Name: extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc
Uploaded: 2020-06-26T15:00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) in het kader van de Duitse Excellence Strategy - EXC-2070 – 390732324 (PhenoRob), de Research Training Group GRK2064 en individuele onderzoeksbeurzen SCHA1274/4-1 en SCHA1274/5-1 aan G.S.. We danken ook Li Schlüter en Brigitte Ueberbach voor technische bijstand.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier presenteren we een veelzijdige en gevoelige methode om InsP's te kwantificeren, waaronder PP-InsP's in plantenextracten en praktische tips geven over hoe deze methode tot stand kan worden gebracht. Hoewel het protocol over het algemeen robuust is, kunnen suboptimale runs en analyses optreden. In de meeste gevallen kunnen deze runs worden geïdentificeerd door een sterke vermindering of zelfs volledig verlies van sterk fosforyleerde InsP's, met name de PP-InsP-soort InsP7 en InsP8. Mogelijke redenen kunnen microbiële verontreinigingen van het plantaardige materiaal zijn en onvoldoende deactivering van endogene installatie PP-InsP hydrolasen tijdens de extractie als gevolg van onvoldoende slijpen en ontdooien van plantaardig materiaal dat niet onmiddellijk in contact zal komen met de extractiebuffer. Andere redenen zijn onjuiste pH-aanpassing door onvoldoende of overmatige toevoeging van neutralisatiebuffer, of gewoon onvoldoende monstermateriaal. Deze laatste kan het moeilijk maken om PP-InsP's te detecteren, omdat deze vaak in zeer lage hoeveelheden in de cellen aanwezig zijn. Een teveel aan monstermateriaal of inefficiënt drogen tijdens stap 3.5 kan verdunning van het perchloorzuur veroorzaken, wat ook leidt tot onvoldoende enzymdeactivering en een specifiek verlies van InsP6 en PP-InsPs. De hoeveelheid plantaardig materiaal, evenals het radiolabel dat in dit protocol wordt gebruikt, werden geoptimaliseerd op basis van kosten en prestaties, en ligt daarom dicht bij de laagste hoeveelheid die nog steeds voldoende is voor het leveren van optimale resultaten. Bovendien zal de kolom hars geleidelijk aan verliest zijn resolutie capaciteit. Het eerste teken van dit proces is (om redenen die voor de auteurs niet helemaal duidelijk zijn) een specifiek verlies van hogere fosforyleerde InsP-soorten zoals de PP-InsPs in het HPLC-spectrum. Met verdere veroudering, zelfs InsP6 zal niet goed worden opgelost door de kolom (Figuur 1D). Daarom is het gebruik van een adequate kolom, evenals een zorgvuldige behandeling van het monster en een goed onderhoud van de HPLC-componenten van cruciaal belang voor het garanderen van nauwkeurige resultaten.
Bij het vergelijken van monsters en runs, vooral wanneer gegenereerd met verschillende apparatuur (bijvoorbeeld HPLC-systemen en kolommen) of op verschillende dagen, is het van cruciaal belang om de monsters aan elkaar te normaliseren (zoals beschreven in stap 7.3) en ze op dezelfde manier te analyseren. Alleen door normalisatie is het mogelijk en nauwkeurig om meerdere monsters in dezelfde grafiek weer te geven(figuur 3). Voor kwantificering van individuele InsP's ten opzichte van de totale InsP's, of een andere specifieke InsP-soort, is het niet nodig om te normaliseren, zolang alleen relatieve waarden en niet absolute waarden worden weergegeven. Idealiter worden zowel de InsP-profielen als de kwantificeringen getoond. In sommige gevallen is het echter niet mogelijk om twee of meer runs in dezelfde grafiek adequaat weer te geven. Verschillende bewaartijden of verschillende niveaus van achtergrondactiviteit kunnen het moeilijk maken om niet-gekwantificeerde SAX-HPLC-profielen alleen te vergelijken. Hetzelfde geldt wanneer veel monsters moeten worden vergeleken. In dergelijke gevallen is een verdere evaluatie met behulp van een aanvullende software (bijvoorbeeld Origin) voor individuele piekkwantificering noodzakelijk.
De auteurs zijn zich ervan bewust dat het hier beschreven protocol kan worden geoptimaliseerd en moet worden aangepast aan elke individuele onderzoeksvraag. Hoewel wordt geoptimaliseerd voor Arabidopsis extracten7,17 in dit protocol, deze methode is veelzijdig en kan helpen bij het bepalen van InsP profielen van andere plantensoorten ook. Hier illustreren we deze mogelijkheid door voor het eerst een InsP-profiel voor L. japonicuste presenteren, waarvoor geen wijzigingen van de etiketteringsvoorwaarden, InsP-extractie of SAX-HPLC-run nodig waren (figuur 2). Met name, hoewel over het algemeen vergelijkbaar, verschillen worden waargenomen tussen L. japonicus en Arabidopsis InsP profielen. Bijvoorbeeld in L. japonicus InsP5 [4-OH] of zijn enantiomerische vorm InsP5 [6-OH] zijn overvloediger dan InsP5 [1-OH] of zijn enantiomerische vorm InsP5 [3-OH] in vergelijking met Arabidopsis, waar InsP5 [1-OH] of zijn enantiomerische vorm InsP5 [3-OH] de dominante InsP5 soorten zijn. Evenzo verwachten we dat veranderingen in de samenstelling van de media, [3H]- myo-inositolconcentratie, plantleeftijd, omgevingsomstandigheden (bijvoorbeeld licht en temperatuur), toevoeging van chemische verbindingen of analyses van plantaardige microbiële interacties tussen andere factoren, mogelijk moeten worden getest en aangepast.myo
Een belangrijk nadeel van deze methode die in aanmerking moet worden genomen, is dat de etikettering wordt gedaan in een (steriele) vloeibare cultuur, die voor de meeste landplanten geen fysiologische omgeving vertegenwoordigt. Bovendien is het volume van de etiketteringsoplossing en de grootte van het kweekvat vanwege de hoge kosten van [³H]-myo-inositol over het algemeen beperkt, wat ook de grootte van de installaties die kunnen worden gebruikt, beperkt. Teelt in vloeibare cultuur kan worden vermeden door bijvoorbeeld direct te infiltreren in bladeren van grondgegroeide planten met [³H]-myo-inositol en vervolgens het hier beschreven protocol volgen, zoals eerder gemeld10.
Er zijn verschillende nadelen van dit protocol in vergelijking met alternatieve methoden, zoals TiO2 pull-down gevolgd door PAGINA of massa spectrometrie gebaseerde technieken. Als gevolg van de [3H]-myo-inositol etikettering, alleen InsP soorten die rechtstreeks afkomstig zijn van radioactief gelabelde myo-inositol zal worden gedetecteerd op het einde. De hier beschreven methode is blind voor andere Ins isomers zoals scyllo-inositolen andere isomeren waarvan sommige zijn geïdentificeerd in bepaalde planten44. Bovendien zullen myo-InsPsafgeleid van andere trajecten worden uitgesloten, waaronder die gesynthetiseerd door de novo synthese van myo-inositol en myo-inositol-3-fosfaat via isomerisatie van glucose-6-fosfaat, gekatalyseerd door myo-inositol-3-fosfaat synthase (MIPS) eiwitten45. Hoewel [32P] of [33P]-ortho-fosfaatkan worden gebruikt als alternatieve labels, vormt het gebruik ervan een groot nadeel, omdat elk fosfaathoudend molecuul, inclusief de overvloedige nucleotiden en de derivaten ervan, zal worden gelabeld. Deze moleculen kunnen ook worden geëxtraheerd met dit protocol en binden aan de SAX-kolom, wat zal resulteren in een hoog niveau van achtergrondactiviteit die zal interfereren met de identificatie van individuele InsP pieken5. Bovendien kan de kwantificering van [32P]- of [33P] -gelabelde InsP's en PP-InsPs sterk worden beïnvloed door fosfaat- en pyrofosfaatmoiety-omzet en kan het niet worden gemeld dat er een massale uitlezing voor inositolsoorten wordt gemeld.
Aan de andere kant, [3H]-myo-inositol labelt specifiek myo-inositol-bevattende moleculen. InsPs, inositol-bevattende lipiden, zoals fosfoinositides, en galactinol zijn in dit geval gelabeld. Echter, alleen InsPs zal worden geanalyseerd met dit protocol, omdat lipiden zijn onoplosbaar in de extractie buffer en galactinol niet binden aan de SAX kolom.
Tot nu toe zijn de verschillen met een plant InsP-profiel gegenereerd door [3H]-myo-inositol-etikettering in vergelijking met een bepaald door TiO2 pulldown / PAGE blijft onbekend, omdat dergelijke vergelijkingen niet zijn uitgevoerd in planten. Een recente studie in dierlijke cellen ging in op deze vraag46. In dat werk werd een pool van InsP6 die onzichtbaar is door [3H]-myo-inositol etikettering, die daardoor rechtstreeks moet worden afgeleid van glucose-6-fosfaat, geïdentificeerd door SAX-HPLC profielen te vergelijken met PAGE gels van zoogdiercellijnen. 24 uur fosfaathonger resulteerde in een toename van 150% van InsP6 bij het kwantificeren van PAGE gels van InsPs gezuiverd met behulp van TiO2 pulldown. SAX-HPLC-analyses van [3H]- myo-inositol-gelabelde cellen die identiek werden behandeld, toonden slechts een stijging met 15% van [3H]-InsPmyo6. Zoals eerder vermeld, InsP lager dan InsP5 zijn niet op te sporen met PAGINA-analyse in de meeste gevallen. Radiolabeling gevolgd door SAX-HPLC lijkt de methode van keuze te zijn, zolang massaspectrometrische protocollen niet zijn geoptimaliseerd om deze groep zeer negatief geladen moleculen te detecteren.
Een andere resterende uitdaging is het onderscheiden van enantiomeren in SAX-HPLC-analyses (of in een andere methode voor InsP-analyse)10,17. Deze uitdaging kan worden aangepakt door de toevoeging van chirale selectors, dat wil zeggen, enantiopure verbindingen zoals L-arginine amide die interageren met de respectieve enantiomereische moleculen om diastereomeric complexen te vormen die kunnen worden gescheiden10. Voor zover wij weten, is deze aanpak alleen toegepast om de enantiomerische InsP5 isomers InsP5 [1-OH] en InsP5 [3-OH] te discrimineren door NMR analyses10. Discriminatie van andere enantiomereische paren of succesvolle discriminatie van enantiomeren door chirale SAX-HPLC-analyse of chirale PAGE-gebaseerde methoden zijn nog niet gemeld en moeten verder worden ontwikkeld. Gezien de geconserveerde synthese en de geconserveerde regulering van PP-InsP's door fosforbeschikbaarheid, stellen we ons voor dat vooral niet-radioactieve methoden zoals PAGE- of MS-gebaseerde methoden, samen met voedingsanalyses, zullen helpen bij het bundelen van pogingen om teledetectiegegevens te kalibreren die zijn ontworpen om tekorten aan voedingsstoffen in gewassen te diagnosticeren17,18,24,25. Echter, de methode hier gepresenteerd kan momenteel nog steeds worden beschouwd als de gouden standaard voor InsP-analyses en zal instrumenteel zijn om nieuwe functies van deze intrigerende boodschappers in planten te ontdekken.

Bijna vier decennia geleden, inositol fosfaten (InsP's) naar voren als signalering moleculen, na Ins(1,4,5)P3 (InsP3) werd geïdentificeerd als een tweede boodschapper die de receptor-gemedieerde release van Ca2 + in dierlijke cellen1,2activeert . Tot op heden is er geen InsP3-receptor (IP3-R) geïdentificeerd in planten, die een directe signaalrol voor InsP3 in plantencellen3in vraag stelt. Hoe dan ook, InsP3 dient als voorloper voor andere InsP's die betrokken zijn bij verschillende ontwikkelingsprocessen van installaties , waaronder de regulering van specifieke signaleringstrajecten3,4,5,6,7,8. Zo kan InsP3 verder worden gefossyleerd tot InsP6, ook wel bekend als "fytisch zuur", dat een belangrijke bron van fosfaat, myo-inositol en cations vertegenwoordigt, en bleek een belangrijke rol te spelen bij de afweerverdediging van de planten tegen ziekteverwekkers, mRNA-export en fosfaathomeostase5,9,10,11,12.
Inositol pyrofosfaten (PP-InsP's) zijn een klasse van InsP's die ten minste één hoogenergetische di-fosfo-binding bevatten, aanvankelijk geïdentificeerd in dierlijke cellen, amoebe en gist, waar ze een cruciale rol spelen in verschillende cellulaire processen13,14,15. Ondanks het baanbrekende werk aan PP-InsP's in planten16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, blijven de biologische functies en de isomere identiteit van deze moleculen nog steeds grotendeels raadselachtig., In het model plant Arabidopsis thaliana, cellulaire InsP8 werd voorgesteld om afweer tegen insecten herbivoren en necrotrofische schimmels te reguleren via toeval-detectie van InsP8 en actieve jasmonate door de ASK1-COI1-JAZ receptor complex17. Voorts zijn rollen van InsP8 en andere PP-InsP's in energiehomeostase en nutriëntenonderzoek, evenals fosfaathomeostase voorgesteld17,23,24,25,26.
Ongeacht het gebruikte biologische systeem, is één belangrijke methodologische uitdaging bij het bestuderen van InsP's de betrouwbare opsporing en nauwkeurige kwantificering van deze moleculen geweest. Op massaspectrometrie gebaseerde methoden zijn gebruikt om InsP's, waaronder PP-InsPs, uit celextracten te detecteren. Deze studies slaagden er echter niet in onderscheid te maken tussen verschillende isomers26,27. Een andere aanpak om InsP's te analyseren maakt gebruik van pull-down van InsP's van cellysates met Behulp van TiO2 kralen, gevolgd door polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) van de eluted InsPs. De InsP's kunnen dan worden gekleurd door toluidine blauw of DAPI24,28,29. Het is echter tot nu toe niet mogelijk om InsP's die lager zijn dan InsP5, op betrouwbare wijze te detecteren uit plantenextracten met behulp van deze methode. Onlangs werd een methode met behulp van [13C]-myo-inositol voor nucleaire magnetische resonantie (NMR) analyse van InsP's gepubliceerd als een alternatief voor sterke anion uitwisseling high-performance liquid chromatografie (SAX-HPLC)30. Deze techniek is gemeld om een vergelijkbare gevoeligheid te bereiken in vergelijking met SAX-HPLC en om de detectie van 5-InsP 7 mogelijk te maken,evenalsde discriminatie van verschillende niet-enantiomerische InsP5-isomeren uit celextracten. De implementatie van de op NMR gebaseerde methode vereist echter chemisch gesynthetiseerd en commercieel niet beschikbaar [13C]-myo-inositol. Daarom is de methode die in de meeste gevallen wordt gebruikt radiolabeling samples met [3H]-myo-inositol, gevolgd door SAX-HPLC31,32,33. Deze techniek is gebaseerd op myode opname van radioactieve myo-inositol in de plant en de omzetting ervan in verschillende InsP's door de gecombineerde activiteit van toegewijde cellulaire kinasen en fosfata's.
De[3H]-gelabelde InsP's worden vervolgens zuur geëxtraheerd en gefractioneerd met SAX-HPLC. Vanwege hun negatieve lading werken de InsP's sterk samen met de positief geladen stationaire fase van de SAX-HPLC-kolom en kunnen ze worden geëuterd met een buffergradiënt die toenemende fosfaatconcentraties bevat om InsP's uit de kolom te ijveren. Elution tijden dus afhankelijk van lading en geometrie van de InsP soorten te scheiden. Bij afwezigheid van chirale kolommen kunnen alleen niet-enantiomeree isomeren door gescheiden door dit protocol. Radioactief gelabelde normen kunnen echter worden gebruikt om het isomerische karakter van een specifieke InsP-piek toe te wijzen. Meerdere pogingen in het verleden door verschillende laboratoria om gelabelde en niet-gelabelde normen te genereren met (bio)chemische methoden of om ze te zuiveren uit verschillende cellen en organismen hebben bijgedragen tot het toewijzen van pieken aan bepaalde InsP-soorten; en ook om de isomerische identiteit van individuele InsP-soorten5,7,21,34, 35,36,36,37,38,39,,40,41,42,43te beperken . Ook de recente opheldering van enzymatische trajecten die leiden tot de vorming van PP-InsP's in planten, evenals de ontdekking van een bacteriële type III-effector met een specifieke 1-fytaseactiviteit , verschaffen informatie over het genereren van nuttige normen voor deze analyses10,17,18,22,23.
De resulterende breuken kunnen worden gemeten in een vloeibare scintillatieteller als gevolg van het β-verval van tritium (3H). Met de toenemende etiketteringstijd wordt een steady-state isotopisch evenwicht bereikt, waarna de verkregen InsP-profielen de InsP-status van de installatie31moeten vertegenwoordigen. Het grote voordeel van dit protocol in vergelijking met andere beschikbare technieken is de hoge gevoeligheid die wordt bereikt door het gebruik van de directe voorloper voor InsP's en het meten van een radioactief signaal.
SAX-HPLC van monsters gewonnen uit [3H]-myo-inositol-gelabelde planten of andere organismen wordt vaak gebruikt voor de detectie en kwantificering van InsP's, variërend van lagere InsP-soorten tot PP-InsPs, wat een waardevol instrument is om het metabolisme, de functie en de werkingswijzen van InsP's beter te begrijpen. Tot nu toe is deze methode ook de meest geschikte keuze voor onderzoekers met speciale interesse in lagere InsP-soorten. Hoewel de basis van deze procedure, waarop het hier beschreven protocol voortbouwt, eerder zijn beschreven7,21,31,34, ontbreekt nog steeds een gedetailleerd protocol dat is afgestemd op de analyse van door planten afgeleide InsP's en in het bijzonder van PP-InsP's. Eerdere publicaties meldden moeilijkheden om de lage p-insp's, met name InsP8, betrouwbaar op te sporen als gevolg van een of meer van de volgende factoren: relatief lage hoeveelheden plantaardig materiaal, [3H]-myo-inositol met een lage specifieke activiteit (> 20 Ci/mmol), gebruik van extractiebuffers die ofwel niet zijn gebaseerd op perchloorzuur of minder geconcentreerd zijn dan 1 M, verschillende neutraliserende buffers, evenals suboptimale hellingen of detectie van [3H] met een on-line detector. In vergelijking met deze studies is het hier gepresenteerde protocol ontworpen voor de betrouwbare detectie van PP-InsPs7,21,34.
Hier presenteren we een gedetailleerde workflow, vanaf de installatie van de apparatuur tot plantenteelt en etikettering, InsP extractie en de SAX-HPLC run zelf. Hoewel de methode werd geoptimaliseerd om het model plant A. thaliana, kan het gemakkelijk worden gewijzigd om andere plantensoorten te bestuderen, zoals hier getoond met de eerste gemelde InsP profiel van het model peulvruchten Lotus japonicus. Hoewel het gebruik van een andere plantensoort enige optimalisatie kan vereisen, zijn we van plan deze kleine te maken, waardoor dit protocol een goed uitgangspunt is voor verder onderzoek in plant InsP's. Om mogelijke optimalisaties mogelijk te maken, geven we elke stap binnen het protocol aan waarin wijzigingen mogelijk zijn, evenals alle kritieke stappen die uitdagend kunnen zijn bij het voor het eerst vaststellen van de methode. Daarnaast rapporteren we hoe gegevens die met deze methode worden verkregen, kunnen worden gebruikt voor de kwantificering van specifieke InsP's en hoe verschillende monsters kunnen worden geanalyseerd en vergeleken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>model: 5430 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diammonium hydrogen phosphate, &#8805;97 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0268.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, &#8805;99 %, p.a., ACS</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>LAMBDA Instruments GmbH</td>
			<td>model: OMNICOLL single channel collector</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth incubator</td>
			<td>poly klima GmbH</td>
			<td>model: PK 520-LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC pumps</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector for HPLC</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>model: Rheodyne 9725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol, myo-[1,2-3H(N)]</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals Inc.</td>
			<td>ART 0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>University, Chemistry Department</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>model: TRI-CARB 2900TR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pestle</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>CXH7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 &#181;m pore size, 47 mm circle</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>10401770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer for HPLC</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: M 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium, salt mixture</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro software</td>
			<td>OriginLab Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthophosphoric acid, &#8805;85 %, p.a., ISO</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>6366.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partisphere 5 &#181;m SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4621-0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile</td>
			<td>Greiner Bio One International GmbH</td>
			<td>688161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-indicator paper pH 5.5 - 9.0, Neutralit</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>109564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>P743.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>57648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL</td>
			<td>Simport Scientific Inc.</td>
			<td>S207-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench</td>
			<td>LaboGene</td>
			<td>model: ScanLaf MARS 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, &#8805;99,5 %, p.a.</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>6013599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure deionized water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrenchless WVS End Fitting Kit</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4631-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc

De fosfaatesters van myo-inositol, ook wel inositolfosfaten (InsP's) genoemd, zijn een klasse van cellulaire regelgevers die een belangrijke rol spelen in de plantenfysiologie. myo Vanwege hun negatieve lading, lage overvloed en gevoeligheid voor hydrolytische activiteiten, is de detectie en kwantificering van deze moleculen een uitdaging. Dit is met name het geval voor sterk fosforyleerde vormen die diphospho-bindingen met "hoogenergetische" bevatten, ook wel inositol pyrofosfaten (PP-InsPs) genoemd. Vanwege de hoge gevoeligheid is sterke anionuitwisseling high-performance vloeibare chromatografie (SAX-HPLC) van planten gelabeld met [3H]-myo-inositol momenteel de methode bij uitstek om deze moleculen te analyseren. Door [3H]-myo-inositol te gebruiken voor radiolabel plantenzaailingen, kunnen verschillende InsP-soorten, waaronder verschillende niet-enantiomereïsche isomeren, met hoge gevoeligheid worden gedetecteerd en gediscrimineerd. Hier wordt de opzet van een geschikt SAX-HPLC-systeem beschreven, evenals de volledige workflow van plantenteelt, radiolabeling en InsP-extractie tot de SAX-HPLC-run en de daaropvolgende data-analyse. Het hier gepresenteerde protocol maakt de discriminatie en kwantificering van verschillende InsP-soorten mogelijk, waaronder verschillende niet-enantiomeree isomeren en van de PP-InsP's, InsP7 en InsP8, en kan gemakkelijk worden aangepast aan andere plantensoorten. Als voorbeelden worden SAX-HPLC analyses van Arabidopsis thaliana en Lotus japonicus zaailingen uitgevoerd en worden complete InsP profielen gepresenteerd en besproken. De hier beschreven methode is een veelbelovend instrument om de biologische rol van InsP's in planten beter te begrijpen.

De hier getoonde resultaten zijn gericht op het illustreren van mogelijke resultaten verkregen op basis van variaties op technisch en biologisch niveau. De eerste wordt geïllustreerd door analyses met behulp van nieuwe versus verouderde kolommen (figuur 1) en verse versus opgeslagen monsters (figuur 3), en de tweede door het evalueren van extracten uit twee verschillende installatiesystemen, A. thaliana (figuur 1, figuur 3) en L. japonicus (figuur 2).
Een optimale SAX-HPLC run is afgebeeld op figuur 1A\u2012C, die een compleet inositol polyfosfaatspectrum toont verkregen uit A. thaliana-extracten na scintillatietelling. Houd er rekening mee dat pieken mooi gescheiden zijn en kunnen worden toegewezen aan verschillende isomeren (of enantiomer-paren) op basis van chromatografische mobilities die eerder5,7 zijnbeschreven .
Figuur 2 toont het representatieve resultaat van een SAX-HPLC-analyse van L. japonicuszaailingen die onder dezelfde voorwaarden als de Arabidopsis-zaailingen zijn geteeld en gelabeld. Hoewel vermoedelijk alle InsP-soorten en pieken die bekend zijn van Arabidopsis kunnen worden gezien, zijn er aanzienlijke verschillen met betrekking tot de relatieve (bijvoorbeeld, verhoudingen tussen isomers) hoeveelheid specifieke InsP-isomeren, bij het vergelijken van de profielen van beide soorten. Bijvoorbeeld, de Lotus extracten toonde verhoogde InsP3c, InsP4b, InsP5b en verminderde InsP3a, InsP4a, InsP5a en InsP5c in vergelijking met Arabidopsis die ruimte laat voor verdere onderzoeken. Figuur 2D illustreert de verschillende verhoudingen tussen InsP-isomeren tussen Arabidopsis en Lotus.
Figuur 3 toont twee InsP-profielen van een monster dat na de extractie is gesplitst. De eerste helft werd onmiddellijk geanalyseerd en de tweede helft een dag later, na opslag bij -80 °C. Houd er rekening mee dat er slechts kleine verschillen worden waargenomen tussen de verschillende monsters (d.w.z. zwarte en rode lijnen op figuur 3A\u2012Cen figuur 3D). Dit illustreert dat één vriesdooicyclus het monster niet schaadt en dat de methode zelf reproduceerbare resultaten genereert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig01.jpg"> Figuur 1: Typisch InsP-profiel van een succesvol en van een mislukte SAX-HPLC-analyse uitgevoerd met dit protocol. (A\u2012C) SAX-HPLC profiel van 17-dagen-oude wild-type (Col-0) Arabidopsis zaailingen radioactief gelabeld met [3H]-myo-inositol. Global InsP extractie en SAX-HPLC run werden uitgevoerd op dezelfde dag. a) volledige spectra; (B, C) Zoomind van het profiel in A. Alle zichtbare pieken worden gemarkeerd en toegewezen aan de overeenkomstige InsP-soorten. Op basis van gepubliceerde chromatografische mobiliteiten5,7, vertegenwoordigt InsP4a waarschijnlijk Ins(1,4,5,6)P4 of Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a vertegenwoordigt InsP5 [2-OH], InsP5b vertegenwoordigt InsP5 [4-OH] of zijn enantiomereic vorm InsP5 [6-OH], en InsP5c vertegenwoordigt InsP5 [1-OH] of zijn enantiomerische vorm InsP5 [3-OH]. De isomerische aard van InsP3a-c, InsP4b, InsP7, en InsP8 zijn nog onbekend. Panel (D) toont een SAX-HPLC profiel van identiek geteelde planten, maar met behulp van een verouderde kolom (>40 runs). Een duidelijke vermindering van InsP6 ten opzichte van andere InsP-soorten en de afwezigheid van PP-InsP's is zichtbaar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2.jpg"> Figuur 2: Representatief InsP-profiel van L. japonicusplanten.  SAX-HPLC profiel (A\u2012C) van 17-dagen-oude wild-type (Gifu) L. japonicus zaailingen radioactief gelabeld met [3H]-myo-inositol. a) volledige spectra; (B, C) Zoomind van het profiel in A. Alle zichtbare pieken worden gemarkeerd en toegewezen aan de overeenkomstige InsP-soorten. Op basis van gepubliceerde chromatografische mobiliteiten5,7, vertegenwoordigt InsP4a waarschijnlijk Ins(1,4,5,6)P4 of Ins(3,4,5,6)P4, InsP5b vertegenwoordigt waarschijnlijk InsP5 [4-OH] of de enantiomeree vorm InsP5 [6-OH], en InsP5c vertegenwoordigt waarschijnlijk InsP5 [1-OH] of zijn enantiomereic vorm InsP5 [3-OH]. De isomerische aard van InsP3a-c, InsP4b, InsP7en InsP8 zijn onbekend. (D) Vergelijking tussen de afzonderlijke InsP-soorten (in % van de totale activiteit uit elutie 25\u201296) van A. thaliana (gegevens uit figuur 1A\u2012C) en L. japonicus (gegevens uit figuur 2A–C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig03.jpg"> Figuur 3: InsP-profielen van een gesplitst monster ter illustratie van de reproduceerbaarheid van SAX-HPLC-analyses. (A\u2012C) SAX-HPLC profielen van 17 dagen oude wild-type (Col-0) Arabidopsis zaailingen radioactief gelabeld met [3H]-myo-inositol. Voorafgaand aan de run werd het monster gesplitst en de ene helft onmiddellijk uitgevoerd en de andere helft een dag later na opslag bij -80 °C. (A) Volledige spectra; (B, C) Zoomind van het profiel in A. Alle zichtbare pieken worden gemarkeerd en toegewezen aan de overeenkomstige InsP-soorten. Op basis van gepubliceerde chromatografische mobiliteiten5,7, vertegenwoordigt InsP4a waarschijnlijk Ins(1,4,5,6)P4 of Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a vertegenwoordigt InsP5 [2-OH], InsP5a vertegenwoordigt InsP5 [2-OH], InsP5b vertegenwoordigt InsP5 [4-OH] of de enantiomereic vorm InsP5 [6-OH], en InsP5c vertegenwoordigt InsP5 [1-OH] of de enantiomeree vorm InsP5 [3-OH]. De isomerische aard van InsP3a-c, InsP4b, InsP7, en InsP8 zijn nog onbekend. Panel D toont de kwantificering van InsP6 en de PP-InsP7 en InsP8 van beide runs. De waarden vertegenwoordigen het bedrag (in %) van de respectieve InsP-soorten ten opzichte van alle InsP (totale activiteit van elutie 25–96). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Aanvullende figuur 1: Software-instellingen voor het tellen van vloeibare scintillatie met behulp van een licht scintillatieteller. Screenshots met de softwareversie, evenals instellingen die worden gebruikt voor scintillatie tellen van [3H] monsters uitgevoerd met dit protocol worden afgebeeld. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig01.jpg" target="_blank">Klik hier om dit cijfer te downloaden.</a>
Aanvullend figuur 2: Representatief voorbeeld van gegevensnormalisatie. Een schermafbeelding van een werkblad toont alle stappen en formules die worden gebruikt om SAX-HPLC-runs naar elkaar te normaliseren. Voor vereenvoudiging worden slechts fracties van 25–35 van de monsters weergegeven. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig02.jpg" target="_blank">Klik hier om dit cijfer te downloaden.</a>
Aanvullende figuur 3: Piekbepaling, achtergrondaftrekken en integratie met behulp van analysesoftware. (A) Gegevens uit SAX-HPLC-analyse worden in de software geladen (minuten 28–96) en de piekanalyzertool is geselecteerd. (B\u2012E) De basislijn wordt handmatig gedefinieerd door punten in te stellen tussen afzonderlijke pieken en de achtergrond wordt afgetrokken. (F) Pieken worden handmatig bepaald op basis van het uiterlijk en gepubliceerde chromatografische mobiliteiten5,7. (G) Piekbereiken worden handmatig gedefinieerd door cpm-waarden. (H)Pieken worden geïntegreerd en berekend als % van alle pieken. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig03.jpg" target="_blank">Klik hier om dit cijfer te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC at JoVE.com

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

Hier beschrijven we sterke anion uitwisseling high-performance vloeibare chromatografie van [3H]-myo-inositol-gelabelde zaailingen die een zeer gevoelige methode is om inositol polyfosfaten in planten te detecteren en te kwantificeren.

Extractie en kwantificering van oplosbare, radiogelabelde Inositol Polyfosfaten van verschillende plantensoorten met SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

Het hier aangetoonde protocol kan helpen om de biosynthese van inositolpolyfosfaten van planten te verduidelijken en vragen te beantwoorden over hun rol in bepaalde aspecten van plantenmetabolisme en -ontwikkeling. Deze methode is zeer gevoelig omdat het gebruik van de radioactief gelabelde precursor van inositolfosfaten een betrouwbare detectie van alle inositolfosfaatsoorten in planten mogelijk maakt. Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk omdat de meeste plantenbiologen niet bekend zijn met HPLC-analyse en de benodigde setup.Bovendien zijn kritieke stappen van dit protocol, zoals de extractie van inositolfosfaten, moeilijk te volgen zonder de juiste demonstratie. Begin met het opzetten van een systeem bestaande uit twee onafhankelijke HPLC pompen, een voor buffer A en een voor buffer B.Beide pompen moeten samen worden gecontroleerd via een computer of een master pomp. Voer een zuigerafdichtingswas voor beide pompen, hetzij via gravitatiekracht of via een derde lagedrukpomp.Sluit beide pompen aan op een dynamische mixer en sluit de mixer vervolgens aan op een injectieklep met een monsterlus met ten minste één millilitercapaciteit. Gebruik haarvaten om de injectieklep aan te sluiten op de kolom en de kolom op de fractiecollector. Zaai lotuszaden in één rij op vierkante petrischaaltjes gevuld met solide groeimedia bestaande uit 0,8% bacteriologische agar in gedeïmiseerd water.Laat de zaden te stratificeren voor ten minste drie dagen op vier graden Celsius in het donker. Plaats de zaden in een groei incubator. Breng 10 tot 20 zaailingen over in een put van een 12-goed heldere platte bodemcelkweekplaat gevuld met twee milliliter halfsterkte MS-zoutoplossing die wordt aangevuld met 1%sacharose en aangepast aan pH 5.7.Voeg 45 microcurie 3H myo-inositol toe aan de plaat en draai het voorzichtig. Bedek de plaat met een deksel en verzegel het met microporeuze chirurgische tape. Plaats het dan terug in de groeibroeder.Na vijf dagen van etikettering, verwijder zaailingen uit de media en was ze kort met gedeïniseerd water. Droog ze met papieren handdoeken en breng ze in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis, zorg ervoor dat niet te vullen de buis. Snap bevriezen van de buis in vloeibare stikstof en bewaar het op min 80 graden Celsius tot de winning.Neem de monsters uit de vriezer en bewaar ze in vloeibare stikstof tot klaar voor gebruik. Maal ze met een microcentrifuge buis stamper totdat ze beginnen te ontdooien, voeg dan 500 microliters van ijskoude extractie buffer. Blijf malen totdat het monster is gehomogeniseerd en de oplossing is gekleurd.Centrifugeren de monsters gedurende 10 minuten op 18,000 keer G en vier graden Celsius. Breng de supernatant vervolgens over in een verse buis van 1,5 milliliter. De buizen die voor de winning worden gebruikt, worden beschouwd als vast radioactief afval en moeten dienovereenkomstig worden verwijderd.Voeg voorzichtig 300 microliter neutralisatiebuffer toe aan het extract, wat onmiddellijk neerslag van eiwitten en borrelen zal veroorzaken. Meng het monster na een minuut met een pipetpunt en pipet vijf microliters op pH-papier om er zeker van te zijn dat de pH tussen de zeven en acht ligt. Voeg indien nodig kleine hoeveelheden neutralisatiebuffer of extractiebuffer toe totdat de gewenste pH is bereikt en laat de monsters minstens een uur rusten op ijs met een open deksel.Dan centrifugeren ze voor 10 minuten en breng de supernatant in een verse 1,5 milliliter buis. Rust de fractiecollector uit met 96 kleine scintillatiefolie flacons en vul elke flacon met twee milliliter van een geschikte scintillatiecocktail die compatibel is met lage pH-buffers en hoge ammoniumfosfaatconcentraties. Start het HPLC-systeem, activeer vervolgens de zuigerafdichting en houd deze gedurende de hele run geactiveerd.Injecteer het monster handmatig met een geschikte spuit. Start de pompen en de helling. Terwijl de HPLC-run aan de gang is, controleer de druk regelmatig.De startdruk moet rond de 18 tot 24 bar liggen en moet langzaam stijgen tot 50 tot 60 bar zodra 100% buffer B is bereikt. Na de run sluit u de flesjes stevig en schud de fracties krachtig met de scintillatiecocktail om te mengen. Als u niet rechtstreeks met de meting bezig bent, houdt u de flesjes rechtop in het donker.Om de breuken te meten, steek de flacons in de scintillatietellerrekken met behulp van rekken die de kleine flesjes passen en meet elke flacon gedurende vijf minuten in een vloeibare scintillatieteller. Bereid een 2D-lijndiagram voor waarin de gemeten tellingen per minuut of CPM worden uitgezet op basis van de bewaartijd. Om monsters met elkaar te vergelijken, normaliseert u de gegevens door de CPM van elke vooreen elbende fractie van minuut 25 tot en met 96 voor elk afzonderlijk monster op te tellen en door de totale CPM van dat monster te delen door de totale CPM van de andere monsters.Om relatieve kwantificeringen van bepaalde inositolpofosfaatpieken uit te voeren en vervolgens staafgrafieken te maken die gegevens van replicaties voor statistische analyses bevatten, u de analyse voortzetten met een gespecialiseerde software die piekgebieden van chromatogrammen kan berekenen. Een volledig inositol polyfosfaatspectrum verkregen uit A.thaliana extracten na scintillatie tellen wordt hier getoond. De pieken zijn mooi gescheiden en kunnen worden toegewezen aan verschillende isomeren.Wanneer een verouderde kolom wordt gebruikt, is een duidelijke vermindering van inositol hexakifosfaatfosfaat en de afwezigheid van inositol pyrofosfaat zichtbaar. SAX-HPLC analyse werd ook uitgevoerd op L.japonica zaailingen die werden geteeld en gelabeld onder dezelfde voorwaarden als de Arabidopsis zaailingen. Terwijl vermoedelijk alle inositol polyfosfaat soorten en pieken die bekend zijn van Arabidopsis kan worden gezien, zijn er verschillen in de relatieve hoeveelheden van specifieke inositol polyfosfaat isomeren tussen de twee soorten.Om aan te tonen dat monsters niet onmiddellijk na de extractie hoeven te worden geanalyseerd, werd één monster in tweeën gesplitst en de helft ervan werd de volgende dag na opslag bij min 80 graden Celsius geanalyseerd. De verschillen tussen SAX-HPLC-profielen van de verse en bevroren monsters waren niet significant, wat aantoont dat één vriesdooicyclus het monster niet schaadt en dat de methode zelf reproduceerbare resultaten genereert. Bij het proberen van dit protocol, altijd malen de monsters grondig, bevroren en met extractie buffer, en streven naar bijna neutrale pH na neutralisatie om een maximale terugwinning van radio-gelabelde inositol fosfaat voor SAX-HPLC analyse te garanderen.Het is mogelijk om radio-gelabeld van een SAX-HPLC run te zuiveren voor later gebruik, bijvoorbeeld in wederzijdse reacties door het verzamelen van fracties zonder scintillatie cocktails en het meten van slechts kleine aliquots.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessen uit een analyse van maïs Leaf Development

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Een eenvoudige gefractieerde extractie methode voor de uitgebreide analyse van metabolieten, lipiden en proteïnen uit een enkele monster

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolatie en respiratoire metingen van Mitochondria van Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fractionering voor oplossing van oplosbare en onoplosbare Huntingtin soorten

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Blad Spray massaspectrometrie: Een snelle Ambient ionisatie techniek om te beoordelen direct metabolieten van plantaardige weefsels

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Cafeïne-extractie, enzymatische activiteit en genexpressie van cafeïne Synthase uit plantaardige cel schorsingen

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

RNA Blot Analyse voor de detectie en kwantificering van Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Schatting van het ligninegehalte van plantaardige biomassa met thioglycolzuur (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...