Name: extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc
Uploaded: 2020-06-26T15:00:00
Duration: 9 min 1 s
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Ces travaux ont été financés par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande de recherche) dans le cadre de la stratégie d’excellence de l’Allemagne - EXC-2070 – 390732324 (PhenoRob), le Groupe de formation à la recherche GRK2064 et des subventions individuelles de recherche SCHA1274/4-1 et SCHA1274/5-1 à G.S. Nous remercions également Li Schlüter et Brigitte Ueberbach pour leur assistance technique.

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Ici, nous présentons une méthode polyvalente et sensible pour quantifier les Insp, y compris les PPP-InsPs dans les extraits de plantes et de fournir des conseils pratiques sur la façon d’obtenir cette méthode établie. Même si le protocole est généralement robuste, des pistes et des analyses sous-optimales peuvent se produire. Dans la plupart des cas, ces pistes peuvent être identifiées par une forte réduction ou même la perte complète d’Insps hautement phosphorylés, en particulier les espèces PP-InsP InsP7 et InsP8. Les raisons possibles peuvent être la contamination microbienne du matériel végétal et la désactivation insuffisante des hydrolases PP-InsP de la plante endogène pendant l’extraction en raison d’un broyage et d’un dégel insuffisants du matériel végétal qui ne sera pas en contact immédiat avec le tampon d’extraction. D’autres raisons incluent un ajustement inexact du pH par ajout insuffisant ou excessif de tampon de neutralisation, ou tout simplement un matériel d’échantillonnage insuffisant. Ce dernier peut rendre difficile la détection des PP-InsP, car ceux-ci sont souvent présents en très faibles quantités dans les cellules. Un excès de matériel d’échantillon ou un séchage inefficace au cours de l’étape 3.5 peut provoquer la dilution de l’acide perchlorique, ce qui entraîne également une désactivation insuffisante des enzymes et une perte spécifique des Insp6 et PP-InsP. La quantité de matériel végétal, ainsi que le radiolabel utilisé dans ce protocole ont été optimisées en fonction des coûts et des performances, et est donc proche de la quantité la plus basse qui est encore suffisante pour fournir des résultats optimaux. De plus, la résine de colonne perdra progressivement sa capacité de résolution. Le premier signe de ce processus est (pour des raisons qui ne sont pas tout à fait claires pour les auteurs) une perte spécifique d’espèces insp plus phosphorylées comme les PP-Insp dans le spectre hplc. Avec le vieillissement supplémentaire, même InsP6 ne sera pas résolu correctement par la colonne (Figure 1D). Par conséquent, l’utilisation d’une colonne adéquate, ainsi que la manipulation méticuleuse de l’échantillon et la maintenance appropriée des composants HPLC est cruciale pour assurer des résultats précis.
Lorsqu’on compare des échantillons et des pistes, en particulier lorsqu’ils sont générés avec différents équipements (p. ex., les systèmes et colonnes hplc) ou à des jours différents, il est crucial de normaliser les échantillons les uns aux autres (comme décrit à l’étape 7.3) et de les analyser de la même manière. Ce n’est que par la normalisation qu’il est possible et précis d’afficher plusieurs échantillons dans le même graphique (figure 3). Pour la quantification des Insp individuels par rapport aux Insp totaux, ou à une autre espèce spécifique de l’InsP, il n’est pas nécessaire de normaliser, tant que seules les valeurs relatives et non les valeurs absolues sont affichées. Idéalement, les profils InsP et les quantifications sont indiqués. Toutefois, dans certains cas, il n’est pas possible d’afficher adéquatement deux ou plusieurs séries dans le même graphique. Des temps de rétention différents ou différents niveaux d’activité en arrière-plan peuvent rendre difficile la comparaison des profils SAX-HPLC non quantifiés seuls. Il en va de même lorsque de nombreux échantillons doivent être comparés. Dans de tels cas, une évaluation plus poussée à l’aide d’un logiciel supplémentaire (p. ex., Origin) pour la quantification individuelle des pics est nécessaire.
Les auteurs sont conscients que le protocole décrit ici peut être optimisé et doit être adapté à chaque question de recherche individuelle. Bien qu’elle soit optimisée pour les extraits d’Arabidopsis 7,17 dans ce protocole, cette méthode est polyvalente et peut aider à déterminer les profils InsP d’autres espèces végétales ainsi. Ici, nous exemplifions cette possibilité en présentant pour la première fois un profil InsP pour L. japonicus, qui n’a exigé aucune modification des conditions d’étiquetage, extraction InsP ou sax-HPLC exécuter (Figure 2). Notamment, bien que dans l’ensemble similaire, des différences sont observées entre les profils L. japonicus et Arabidopsis InsP. Par exemple, dans L. japonicus Insp5 [4-OH] ou sa forme enantiomérique InsP5 [6-OH] sont plus abondants que l’InsP5 [1-OH] ou sa forme enantioérique InsP5 [3-OH] par rapport à Arabidopsis, où l’InsP5 [1-OH] ou sa forme enantiomérique InsP5 [3-OH] sont les espèces dominantes de l’InsP5. De même, nous prévoyons que des altérations de la composition des milieux,[3H]- concentration demyo-inositol, âge des plantes, conditions environnementales (par exemple, lumière et température), ajout de composés chimiques ou analyses d’interactions végétales-microbiennes entre autres facteurs, pourraient devoir être testées et adaptées.
Un inconvénient important de cette méthode qui doit être pris en considération est que l’étiquetage se fait dans une culture liquide (stérile), qui ne représente pas un environnement physiologique pour la plupart des plantes terrestres. En outre, en raison des coûts élevés de [³H]-myo-inositol, le volume de la solution d’étiquetage et la taille du navire de culture est généralement limité, ce qui limite également la taille des plantes qui peuvent être utilisées. La culture liquide peut être évitée en infiltrant directement par exemple les feuilles de plantes cultivées dans le sol avec [³H]-myo-inositol et en suivant par la suite le protocole décrit ici, comme précédemment rapporté10.
Il existe plusieurs inconvénients de ce protocole par rapport aux méthodes alternatives, telles que TiO2 pull-down suivie par PAGE ou des techniques basées sur la spectrométrie de masse. En raison de l’étiquetage demyo-inositol de[3H], seules les espèces d’InsP qui proviennent directement du myoradio-inositol seront détectées à la fin. La méthode décrite ici est aveugle à d’autres isomères Ins tels que le scyllo-inositol et d’autres isomères dont certains ont été identifiés dans certaines plantes44. En outre, le myo-InsP dérivé d’autres voies sera exclu, y compris ceux synthétisés par synthèse de novo de myo-inositol et myo-inositol-3-phosphate via isomérisation du glucose-6-phosphate, catalysé par myo-inositol-3-phosphate synthase (MIPS) protéines45. myo Bien que[32P] ou [33P]-ortho-phosphatepuisse être utilisé comme étiquettes alternatives, leur utilisation pose un inconvénient majeur, puisque chaque molécule contenant du phosphate, y compris les nucléotides abondants et ses dérivés, sera étiquetée. Ces molécules peuvent également être extraites avec ce protocole et se lier à la colonne SAX, ce qui se traduira par un niveau élevé d’activité de fond qui interférera avec l’identification des pics individuels InsP5. En outre, la quantification de[32P]- ou [33P] -étiquetés Insp et PP-Insp peut être fortement influencée par le chiffre d’affaires de phosphate et de pyrophosphate moiety et pourrait ne pas signaler une lecture de masse pour les espèces d’inositol.
D’autre part, [3H]-myo-inositol étiquette spécifiquement myo-molécules contenant de l’inositol. Les insP, les lipides contenant de l’inositol, tels que les phosphoinositides, et le galactinol sont dans ce cas étiquetés. Cependant, seuls les Insp seront analysés avec ce protocole, puisque les lipides sont insolubles dans le tampon d’extraction et le galactinol ne se lie pas à la colonne SAX.
Jusqu’à présent, les différences par rapport au profil InsP d’une usine généré par [3H]-étiquetage myo-inositolpar rapport à celui déterminé par TiO2 pulldown/PAGE reste inconnue, puisque de telles comparaisons n’ont pas été effectuées dans les plantes. Une étude récente sur les cellules animales a abordé cette question46. Dans ce travail, un pool d’InsP6 qui est invisible par[3H]- étiquetage myo-inositol, qui devrait ainsi être directement dérivé du glucose-6-phosphate, a été identifié en comparant les profils SAX-HPLC avec des gels PAGE des lignées cellulaires des mammifères.myo 24 h de famine de phosphate a eu comme conséquence une augmentation de 150% de l’InsP6 en quantifiant des gels de PAGE des InsP purifiés utilisant le pulldown de TiO2. Les analyses SAX-HPLC de [3H]-cellules étiquetées myo-inositolqui ont été traitées de façon identique seulement ont montré une augmentation de 15% de [3H]-InsP6. Comme nous l’avons mentionné précédemment, les Insp inférieurs à l’InsP5 sont indétectables avec l’analyse PAGE dans la plupart des cas. L’étiquetage radio suivi par SAX-HPLC semble être la méthode de choix, tant que les protocoles spectrométriques de masse ne sont pas optimisés pour détecter ce groupe de molécules fortement chargées négativement.
Un autre défi restant consiste à distinguer les enantiomères dans les analyses SAX-HPLC (ou dans toute autre méthode d’analyse InsP)10,17. Ce défi peut être relevé par l’ajout de sélecteurs chiraux, c’est-à-dire des composés enantiopures comme l’amide L-arginine qui interagissent avec les molécules enantiomérites respectives pour former des complexes diastéréomérisaires qui peuvent être séparés10. À notre connaissance, cette approche n’a été mise en œuvre que pour discriminer les insp5 isomers insP5 [1-OH] et InsP5 [3-OH] par les analyses RMN10. La discrimination d’autres paires enantioméries ou la discrimination réussie des enantiomères par l’analyse chirale SAX-HPLC ou les méthodes chirales basées sur la PAGE n’ont pas encore été signalées et devraient être développées davantage. Compte tenu de la synthèse conservée et de la réglementation conservée des PP-InsP par disponibilité au phosphore, nous envisageons que des méthodes particulièrement non radioactives telles que les méthodes à base de PAGE ou de MS, ainsi que les analyses de nutriments, aideront à mettre au sol les efforts de vérité pour calibrer les données de télédétection conçues pour diagnostiquer les carences en nutriments dans les cultures17,18,24,25. Cependant, la méthode présentée ici peut actuellement encore être considérée comme l’étalon-or pour les analyses InsP et sera déterminante pour découvrir de nouvelles fonctions de ces messagers intrigants dans les plantes.

Il y a près de quatre décennies, les phosphates d’inositol (InsP) sont apparus comme des molécules de signalisation, après que l’Ins(1,4,5)P3 (InsP3) a été identifié comme un deuxième messager qui active la libération de Ca2+ par récepteur dans les cellules animales1,2. À ce jour, aucun récepteur InsP3 (IP3-R) n’a été identifié dans les plantes, ce qui remet en question un rôle de signalisation directe pour l’InsP3 dans les cellules végétales3. Quoi qu’il en soit, l’InsP3 sert de précurseur pour d’autres Insp impliqués dans plusieurs processus de développement des plantes, y compris la régulation de voies de signalisation spécifiques3,4,5,6,7,8. Par exemple, InsP3 peut être encore phosphorylé à l’InsP6, également connu sous le nom « acide phytique », qui représente une source majeure de phosphate, myo-inositol et cations, et a été montré pour jouer des rôles clés dans la défense des plantes contre les agents pathogènes, l’exportation d’ARNm et l’homéostasie du phosphate5,9,10,11,12.
Les pyrophosphates d’inositol (PP-Insp) sont une classe d’Insp qui contiennent au moins un lien di-phospho à haute énergie, initialement identifié dans les cellules animales, les amibes et la levure, où ils jouent un rôle critique dans divers processus cellulaires13,14,15. Malgré les travaux séminaux sur les PP-InsP dans les plantes16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, les fonctions biologiques et l’identité isomère de ces molécules restent encore largement énigmatique. Dans la plante modèle Arabidopsis thaliana, cellulaire InsP8 a été proposé pour réglementer les défenses contre les herbivores d’insectes et les champignons nécrotrophiques par coïncidence-détection de l’InsP8 et jasmonate actif par le complexe récepteur ASK1-COI1-JAZ17. En outre, les rôles de l’InsP8 et d’autres PP-InsP dans l’homéostasie énergétique et la détection des nutriments, ainsi que l’homéostasie du phosphate ont été proposés17,23,24,25,26.
Indépendamment du système biologique utilisé, un défi méthodologique majeur lors de l’étude des Insp a été la détection fiable et la quantification précise de ces molécules. Des méthodes basées sur la spectrométrie de masse ont été utilisées pour détecter les Insp, y compris les PP-Insp, à partir d’extraits cellulaires. Cependant, ces études n’ont pas réussi à différencier les isomères distincts26,27. Une autre approche pour analyser les Insp utilise le retrait des Insp des lysates cellulaires à l’aide de perles TiO2, suivie de l’électrophorèse gel polyacrylamide (PAGE) des Insps. Les Insp peuvent alors être tachés par le bleu toluidine ou DAPI24,28,29. Cependant, il n’est pas encore possible de détecter de manière fiable insPs inférieur à l’InsP5 à partir d’extraits de plantes en utilisant cette méthode. Récemment, une méthode utilisant[13C]-myo-inositol pour la résonance magnétique nucléaire (RMN) analyse des Insp a été publié comme une alternative à l’échange d’anion forte haute performance chromatographie liquide (SAX-HPLC)30. Cette technique a été rapportée pour atteindre une sensibilité semblable par rapport à SAX-HPLC et pour permettre la détection de 5-InsP7, aussi bien que la discrimination de différents insp 5 non-enantiomeric5 isomers des extraits cellulaires. Toutefois, la mise en œuvre de la méthode basée sur la RMN nécessite une synthèse chimique et non disponible dans le commerce [13C]-myo-inositol. Par conséquent, la méthode utilisée dans la plupart des cas est l’étiquetage radio avec [3H]-myo-inositol, suivi par SAX-HPLC31,32,33. Cette technique est basée sur myol’absorption de myo-inositol radioactif dans la plante et sa conversion en différents Insp par l’activité combinée des kinases cellulaires dédiées et des phosphatases.
Les InsP étiquetés[3H] sont ensuite extraits à l’acide et fractionnés à l’aide de SAX-HPLC. En raison de leur charge négative, les Insp interagissent fortement avec la phase stationnaire chargée positivement de la colonne SAX-HPLC et peuvent être élutés avec un gradient tampon contenant des concentrations croissantes de phosphate pour surpasser les InsP de la colonne. Les temps d’élution dépendent donc de la charge et de la géométrie des espèces InsP à séparer. En l’absence de colonnes chirales, seuls les isomères non enantiomeriques peuvent par séparés par ce protocole. Toutefois, des normes radio-étiques peuvent être utilisées pour attribuer la nature isomérique d’un pic InsP spécifique. Les multiples efforts déployés dans le passé par divers laboratoires pour générer des normes étiquetées et non étiquetées avec des méthodes (bio)chimiques ou pour les purifier à partir de diverses cellules et organismes ont aidé à attribuer des pics à certaines espèces de l’InsP, et aussi de réduire l’identité isomérique des espèces individuelles InsP5,7,21,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. En outre, l’élucidation récente des voies enzymatiques menant à la formation de PP-Insp dans les plantes, ainsi que la découverte d’un effecteur bactérien de type III avec une activité spécifique 1-phytase, fournissent des informations sur la façon de générer des normes utiles pour ces analyses10,17,18,22,23.
Les fractions résultantes peuvent être mesurées dans un compteur de scintillation liquide en raison de la β-décomposition du tritium (3H). Avec l’augmentation du temps d’étiquetage, un équilibre isotopique à état stable est atteint, après quoi les profils InsP obtenus devraient représenter le statut InsP de la plante31. Le principal avantage de ce protocole par rapport à d’autres techniques disponibles est la haute sensibilité obtenue par l’utilisation du précurseur direct pour les Insp et la mesure d’un signal radioactif.
SAX-HPLC des échantillons extraits de [3H]-myo-inositol-étiqueté plantes ou d’autres organismes est couramment utilisé pour la détection et la quantification des Insp allant de l’espèce InsP inférieure aux PP-InsP, représentant un outil précieux pour mieux comprendre le métabolisme, la fonction et les modes d’action des Insp. Jusqu’à présent, cette méthode est également le choix le plus approprié pour les chercheurs ayant un intérêt particulier pour les espèces insP inférieures. Alors que les bases de cette procédure, sur laquelle le protocole décrit ici s’appuie, ont déjà été décrits7,21,31,34, un protocole détaillé adapté à l’analyse des InsP dérivés de plantes et en particulier des PP-Insp est toujours manquant. Les publications précédentes ont signalé des difficultés à détecter de manière fiable les PP-Insp peu abondants, en particulier l’InsP8, en raison d’un ou plusieurs des facteurs suivants : des quantités relativement faibles de matières végétales, [3H]-myo-inositol avec une faible activité spécifique (> 20 Ci/mmol), l’utilisation de tampons d’extraction qui ne sont pas basés sur l’acide perchlorique ou sont moins concentrés que 1 M, différents tampons de neutralisation, ainsi que des gradients sous-optimaux ou la détection de [3H] avec un détecteur en ligne. Par rapport à ces études, le protocole présenté ici est conçu pour la détection fiable des PP-Insp7,21,34.
Nous présentons ici un flux de travail détaillé, à partir de la configuration de l’équipement pour la culture et l’étiquetage des plantes, l’extraction InsP et le SAX-HPLC s’exécutent. Bien que la méthode a été optimisée à la plante modèle A. thaliana, il peut être facilement modifié pour étudier d’autres espèces végétales, comme indiqué ici avec le premier profil InsP rapporté du modèle de légumineuse Lotus japonicus. Bien que l’utilisation d’une espèce végétale différente pourrait nécessiter une certaine optimisation, nous prévoyons que ceux-ci seront mineurs, ce qui rend ce protocole un bon point de départ pour la poursuite de la recherche dans les insPs végétaux. Afin de faciliter les optimisations possibles, nous indiquons chaque étape dans le protocole dans lequel des modifications sont possibles, ainsi que toutes les étapes critiques qui peuvent être difficiles lors de l’établissement de la méthode pour la première fois. En outre, nous rapportons comment les données obtenues par cette méthode peuvent être utilisées pour la quantification d’Insp spécifiques et comment différents échantillons peuvent être analysés et comparés.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>model: 5430 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diammonium hydrogen phosphate, &#8805;97 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0268.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, &#8805;99 %, p.a., ACS</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>LAMBDA Instruments GmbH</td>
			<td>model: OMNICOLL single channel collector</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth incubator</td>
			<td>poly klima GmbH</td>
			<td>model: PK 520-LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC pumps</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector for HPLC</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>model: Rheodyne 9725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol, myo-[1,2-3H(N)]</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals Inc.</td>
			<td>ART 0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>University, Chemistry Department</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>model: TRI-CARB 2900TR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pestle</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>CXH7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 &#181;m pore size, 47 mm circle</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>10401770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer for HPLC</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: M 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium, salt mixture</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro software</td>
			<td>OriginLab Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthophosphoric acid, &#8805;85 %, p.a., ISO</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>6366.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partisphere 5 &#181;m SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4621-0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile</td>
			<td>Greiner Bio One International GmbH</td>
			<td>688161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-indicator paper pH 5.5 - 9.0, Neutralit</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>109564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>P743.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>57648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL</td>
			<td>Simport Scientific Inc.</td>
			<td>S207-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench</td>
			<td>LaboGene</td>
			<td>model: ScanLaf MARS 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, &#8805;99,5 %, p.a.</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>6013599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure deionized water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrenchless WVS End Fitting Kit</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4631-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc

Les esters myode phosphate du myo-inositol, également appelé phosphates d’inositol (InsPs), sont une classe de régulateurs cellulaires jouant un rôle important dans la physiologie des plantes. En raison de leur charge négative, de leur faible abondance et de leur faible sensibilité aux activités hydrolytiques, la détection et la quantification de ces molécules est difficile. C’est particulièrement le cas pour les formes fortement phosphorylées contenant des liaisons diphospho « à haute énergie », également appelées pyrophosphates d’inositol (PP-InsP). En raison de sa sensibilité élevée, la chromatographie liquide haute performance (SAX-HPLC) des plantes étiquetées avec[3H]-myo-inositol est actuellement la méthode de choix pour analyser ces molécules. En utilisant[3H]-myo-inositol aux semis de plantes radiolabel, diverses espèces de l’InsP, y compris plusieurs isomères non enantiomères peuvent être détectés et discriminés avec une sensibilité élevée. Ici, la configuration d’un système SAX-HPLC approprié est décrite, ainsi que le flux de travail complet de la culture des plantes, l’étiquetage radio et l’extraction InsP à l’exécution SAX-HPLC et l’analyse des données ultérieure. Le protocole présenté ici permet la discrimination et la quantification de diverses espèces de l’InsP, y compris plusieurs isomères non-enantiomeric et des PP-Insp, InsP7 et InsP8, et peut être facilement adapté à d’autres espèces végétales. À titre d’exemple, les analyses SAX-HPLC des semis Arabidopsis thaliana et Lotus japonicus sont effectuées et des profils InsP complets sont présentés et discutés. La méthode décrite ici représente un outil prometteur pour mieux comprendre les rôles biologiques des InsP dans les plantes.

Les résultats présentés ici visent à illustrer les résultats possibles obtenus en fonction des variations aux niveaux technique et biologique. La première est illustrée par des analyses utilisant de nouvelles colonnes par rapport aux colonnes âgées (figure 1) et des échantillons frais par rapport aux échantillons stockés (figure 3), et la seconde par l’évaluation d’extraits de deux systèmes végétaux différents, A. thaliana (Figure 1, Figure 3) et L. japonicus (Figure 2).
Une course optimale de SAX-HPLC est représentée à la figure 1A\u2012C, qui montre un spectre polyphosphate d’inositol complet obtenu à partir d’extraits de A. thaliana après comptage de scintillation. Notez que les pics sont bien séparés et peuvent être attribués à différents isomères (ou enantiomère-paires) basés sur les mobilités chromatographiques décrites plus tôt5,7.
La figure 2 montre le résultat représentatif d’une analyse SAX-HPLC des semis de L. japonicus qui ont été cultivés et étiquetés dans les mêmes conditions que les semis d’Arabidopsis. Bien que l’on puisse vraisemblablement voir toutes les espèces et les pics de l’InsP connus à partir d’Arabidopsis, il existe des différences importantes en ce qui concerne la quantité relative (p. ex., les ratios entre isomères) de isomères InsP spécifiques, lorsqu’on compare les profils des deux espèces. Par exemple, les extraits de Lotus ont montré augmenté InsP3c, InsP4b, InsP5b et réduit InsP3a, InsP4a, InsP5a et InsP5c par rapport à Arabidopsis qui laisse place à d’autres enquêtes. La figure 2D illustre les différents ratios entre les isomères d’InsP entre Arabidopsis et Lotus.
La figure 3 montre deux profils InsP d’un échantillon qui a été divisé après l’extraction. La première moitié a été immédiatement analysée et la seconde moitié un jour plus tard, après stockage à -80 °C. Notez que seules des différences mineures sont observées entre les différents échantillons (c.-à-d. lignes noires et rouges à la figure 3A\u2012C) et figure 3D). Cela montre qu’un cycle gel-dégel ne nuit pas à l’échantillon et que la méthode elle-même génère des résultats reproductibles.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig01.jpg"> Figure 1 : Profil insP typique d’une analyse RÉUSSIE et d’une analyse SAX-HPLC infructueuse effectuée avec ce protocole. (A\u2012C) Profil SAX-HPLC de 17 jours de type sauvage (Col-0) Arabidopsis semis radiolabeled avec [3H]-myo-inositol. L’extraction globale d’InsP et l’exécution de SAX-HPLC ont été exécutées le même jour. (A) Spectres complets; (B, C) Zoom-ins du profil indiqué dans A. Tous les pics visibles sont mis en évidence et attribués aux espèces InsP correspondantes. Basé sur les mobilités chromatographiques publiées5,7, InsP4a représente probablement Ins(1,4,5,6)P4 ou Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a représente InsP5 [2-OH], InsP5b représente l’InsP5 [4-OH] ou sa forme enantiomère InsP5 [6-OH], et InsP5c représente InsP5 [1-OH] ou sa forme enantiomérique InsP5 [3-OH]. Les natures isomériiques d’InsP3a-c, InsP4b, InsP7et InsP8 sont encore inconnues. Panel (D) montre un profil SAX-HPLC des plantes cultivées de façon identique, mais à l’aide d’une colonne vieillie (>40 fonctionne). Une réduction nette de l’InsP6 par rapport à d’autres espèces de l’InsP et l’absence de PP-InsPs est visible. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2.jpg"> Figure 2 : Profil insP représentatif des plantes L. japonicus.  Profil SAX-HPLC (A\u2012C) de 17 jours de type sauvage (Gifu) L. japonicus semis radiolabeled avec [3H]-myo-inositol. (A) Spectres complets; (B, C) Zoom-ins du profil indiqué dans A. Tous les pics visibles sont mis en évidence et attribués aux espèces InsP correspondantes. D’après les mobilités chromatographiques publiées5,7, InsP4a représente probablement Ins(1,4,5,6)P4 ou Ins(3,4,5,6)P4, InsP5b représente probablement InsP5 [4-OH] ou sa forme enantiomérique InsP5 [6-OH], et InsP5c représente probablement InsP5 [1-OH] ou sa forme enantiomère InsP5 [3-OH]. Les natures isomériiques d’InsP3a-c, InsP4b, InsP7et InsP8 sont inconnues. (D) Comparaison entre les espèces insP individuelles (en % de l’activité totale de l’élution 25\u201296) de A. thaliana (données de la figure 1A\u2012C) et L. japonicus (données de la figure 2A–C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig03.jpg"> Figure 3 : Profils Insp d’un échantillon fractionné illustrant la reproductibilité des analyses SAX-HPLC. (A\u2012C) Profils SAX-HPLC de 17 jours de type sauvage (Col-0) Arabidopsis semis radiolabeled avec [3H]-myo-inositol. Avant la course, l’échantillon a été divisé et une demi-exécution immédiatement et l’autre moitié un jour plus tard après le stockage à -80 °C. (A) Spectres complets; (B, C) Zoom-ins du profil indiqué dans A. Tous les pics visibles sont mis en évidence et attribués aux espèces InsP correspondantes. Basé sur les mobilités chromatographiques publiées5,7, InsP4a représente probablement Ins(1,4,5,6)P4 ou Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a représente InsP5 [2-OH], InsP5a représente InsP5 [2-OH], InsP5b représente InsP5 [4-OH] ou sa forme enantiomérique InsP5 [6-OH], et InsP5c représente InsP5 [1-OH] ou sa forme enantiomérique InsP5 [3-OH]. Les natures isomériiques d’InsP3a-c, InsP4b, InsP7et InsP8 sont encore inconnues. Le panneau D montre la quantification de l’InsP6 et des PP-InsP InsP7 et InsP8 des deux pistes. Les valeurs représentent le montant (en %) des espèces respectives de l’InsP par rapport à toutes les InsP (activité totale de l’élution 25–96). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Figure supplémentaire 1 : Paramètres logiciels pour le comptage de la scintillation liquide à l’aide d’un compteur de scintillation légère. Des captures d’écran montrant la version logicielle, ainsi que les paramètres utilisés pour le comptage de scintillation des échantillons de[3H] effectués avec ce protocole sont représentés. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig01.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.</a>
Figure supplémentaire 2 : Exemple représentatif de normalisation des données. Une capture d’écran d’une feuille de calcul montre toutes les étapes et formules utilisées pour normaliser les courses SAX-HPLC les unes aux autres. Pour la simplification, seules les fractions 25 à 35 des échantillons sont indiquées. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig02.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.</a>
Figure supplémentaire 3 : Détermination maximale, soustraction de fond et intégration à l’aide d’un logiciel d’analyse. (A) Les données de l’analyse SAX-HPLC sont chargées dans le logiciel (minutes 28–96) et l’outil d’analyse de pointe est sélectionné. (B\u2012E) La ligne de base est définie manuellement par le réglage des points entre les pics individuels et l’arrière-plan est soustrait. (F) Les pics sont déterminés manuellement en fonction de l’apparence et des mobilités chromatographiques publiées5,7. (G) Les plages de pointe sont définies manuellement par des valeurs cpm. (H) Les pics sont intégrés et calculés en % de tous les pics. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig03.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.</a>

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Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

Ici, nous décrivons l’échange d’anion forte chromatographie liquide haute performance de [3H]-myo-inositol-étiqueté semis qui est une méthode très sensible pour détecter et quantifier les polyphosphates d’inositol dans les plantes.

Extraction et quantification de polyphosphates solubles et radioalétiques d’inositol provenant de différentes espèces végétales à l’aide de SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

Le protocole démontré ici peut aider à élucider la biosynthèse des polyphosphates d’inositol des plantes et à répondre aux questions concernant leur rôle dans certains aspects du métabolisme et du développement des plantes. Cette méthode est très sensible car l’utilisation du précurseur radioactif des phosphates d’inositol permet une détection fiable de toutes les espèces de phosphate d’inositol chez les plantes. La démonstration visuelle de cette méthode est importante parce que la plupart des biologistes végétaux ne sont pas familiers avec l’analyse HPLC et la configuration nécessaire.En outre, les étapes critiques de ce protocole, comme l’extraction des phosphates d’inositol, sont difficiles à suivre sans démonstration appropriée. Commencez par mettre en place un système composé de deux pompes HPLC indépendantes, l’une pour le tampon A et l’autre pour le tampon B.Les deux pompes doivent être contrôlées ensemble via un ordinateur ou une pompe principale. Mettre en place un lavage de joint à piston pour les deux pompes, soit par la force gravitationnelle ou par une troisième pompe basse pression.Connectez les deux pompes à un mélangeur dynamique, puis connectez le mélangeur à une valve d’injection avec une boucle d’échantillon d’au moins un millilitre. Utilisez des capillaires pour connecter la valve d’injection à la colonne et la colonne au collecteur de fractions. Sèmez les graines de lotus en une rangée sur des boîtes carrées de Petri remplies de solides supports de croissance composés de 0,8% d’agar bactériologique dans de l’eau déionisée.Laissez les graines stratifier pendant au moins trois jours à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Placer les graines dans un incubateur de croissance. Transférer 10 à 20 semis dans un puits d’une plaque de culture à fond plat de 12 puits remplie de deux millilitres de solution de sel de SP demi-résistance qui est complétée par 1 % de saccharose et ajustée au pH 5,7.Ajouter 45 microcourards de myo-inositol 3H à l’assiette et le tourbillonner doucement. Couvrir la plaque d’un couvercle et la sceller de ruban chirurgical microporeux. Ensuite, placez-le de nouveau dans l’incubateur de croissance.Après cinq jours d’étiquetage, retirer les semis des médias et les laver brièvement avec de l’eau déionisée. Séchez-les avec des serviettes en papier et transférez-les dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre, en vous assurant de ne pas trop remplir le tube. Casser le tube dans de l’azote liquide et le conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’extraction.Prélevez les échantillons du congélateur et conservez-les dans de l’azote liquide jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi. Moudre avec un pilon tube de microcentrifugeuse jusqu’à ce qu’ils commencent à décongeler, puis ajouter 500 microlitres de tampon d’extraction de froid glacé. Continuer le broyage jusqu’à ce que l’échantillon soit homogénéisé et que la solution soit colorée.Centrifugeuse les échantillons pendant 10 minutes à 18 000 fois G et quatre degrés Celsius. Transférer ensuite le supernatant dans un tube frais de 1,5 millilitre. Les tubes utilisés pour l’extraction sont considérés comme des déchets radioactifs solides et doivent être éliminés en conséquence.Ajouter soigneusement 300 microlitres de tampon de neutralisation à l’extrait, ce qui provoquera immédiatement des précipitations de protéines et de bouillonnement. Après une minute, mélanger l’échantillon avec une pointe de pipette et pipette cinq microlitres sur du papier pH pour s’assurer que le pH est entre sept et huit. Si nécessaire, ajouter de petites quantités de tampon de neutralisation ou de tampon d’extraction jusqu’à ce que le pH désiré soit atteint et laisser reposer les échantillons sur la glace pendant au moins une heure avec un couvercle ouvert.Ensuite, centrifugez-les pendant 10 minutes et transférez le supernatant dans un tube frais de 1,5 millilitre. Équipez le collecteur de fractions de 96 petits flacons de scintillation et remplissez chaque flacon de deux millilitres d’un cocktail de scintillation approprié compatible avec de faibles tampons de pH et des concentrations élevées de phosphate d’ammonium. Démarrez le système HPLC, puis activez le lavage du joint de piston et maintenez-le activé pendant toute la course.Injecter manuellement l’échantillon avec une seringue appropriée. Démarrez les pompes et le gradient. Pendant que l’exécuter HPLC est en cours, vérifiez la pression régulièrement.La pression de départ devrait être d’environ 18 à 24 barre et devrait lentement passer à 50 à 60 barre une fois que 100% tampon B est atteint. Après la course, fermez les fioles hermétiquement et secouez vigoureusement les fractions avec le cocktail de scintillation à mélanger. Si vous ne procédez pas directement à la mesure, gardez les flacons en position verticale dans l’obscurité.Pour mesurer les fractions, insérez les flacons dans les supports de comptoir de scintillation à l’aide de supports qui s’adaptent aux petits flacons et mesurez chaque flacon pendant cinq minutes dans un comptoir de scintillation liquide. Préparez un graphique de ligne 2D où les dénombrements mesurés par minute ou CPM sont tracés en fonction du temps de rétention. Pour comparer les échantillons les uns avec les autres, normalisez les données en résumant le CPM de chaque fraction élisée de la minute 25 à 96 pour chaque échantillon individuel et en divisant le CPM total de cet échantillon par le CPM total des autres échantillons.Afin d’effectuer des quantifications relatives de certains pics de polyphosphate d’inositol et de créer par la suite des graphiques à barres contenant des données de réplications pour des analyses statistiques, poursuivez l’analyse avec un logiciel spécialisé qui permet de calculer les zones de pointe des chromatogrammes. Un spectre complet de polyphosphate d’inositol obtenu à partir des extraits d’A.thaliana après comptage de scintillation est montré ici. Les sommets sont bien séparés et peuvent être attribués à différents isomères.Quand une colonne âgée est employée, une réduction claire de l’hexakisphosphate d’inositol et de l’absence du pyrophosphate d’inositol est visible. L’analyse SAX-HPLC a également été effectuée sur les semis de L.japonica qui ont été cultivés et étiquetés dans les mêmes conditions que les semis d’Arabidopsis. Bien que l’on puisse vraisemblablement voir toutes les espèces et pics de polyphosphate d’inositol connus d’Arabidopsis, il existe des différences dans les quantités relatives d’isomères polyphosphate d’inositol spécifiques entre les deux espèces.Pour démontrer que les échantillons n’ont pas à être analysés immédiatement après l’extraction, un échantillon a été divisé en deux et la moitié a été analysé le lendemain après l’entreposage à moins 80 degrés Celsius. Les différences entre les profils SAX-HPLC des échantillons frais et congelés n’étaient pas significatives, ce qui démontre qu’un cycle gel-dégel ne nuit pas à l’échantillon et que la méthode elle-même génère des résultats reproductibles. Lorsque vous essayez ce protocole, toujours moudre les échantillons à fond, congelés et avec tampon d’extraction, et viser près de pH neutre après neutralisation pour assurer une récupération maximale du phosphate d’inositol radio-étiqueté pour l’analyse SAX-HPLC.Il est possible de purifier la radio-étiquetée à partir d’une course SAX-HPLC pour une utilisation ultérieure, par exemple dans les réactions mutuelles en collectant des fractions sans cocktails de scintillation et en mesurant seulement de petits aliquots.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Conception expérimentale pour Laser Microdissection ARN-Seq: Leçons tirées d&#39;une analyse du développement du maïs Feuille

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

Recherche

Biochimie

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Une méthode simple d&#39;extraction fractionnée pour l&#39;analyse complète des métabolites, des lipides et des protéines à partir d&#39;un seul échantillon

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Capture interactine d&#39;ARNm à partir de protoplastes végétaux

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolement et mesures respiratoire des mitochondries d’Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fractionnement pour la résolution des espèces de la huntingtine solubles et insolubles

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Spectrométrie de masse de pulvérisation foliaire : Une Technique d’ionisation ambiant rapide pour évaluer directement les métabolites de tissus végétaux

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Extraction de la caféine, l’activité enzymatique et l’Expression génique de caféine Synthase de Suspensions de cellules végétales

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

À l’aide au transfert d’énergie Fluorescence in Vitro pour étudier la dynamique des protéines Complexes à une échelle de temps de milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

Analyse des taches d’ARN pour la détection et la quantification des microARN végétaux

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Estimation de la teneur en lignine de la biomasse végétale à l’aide de l’acide thioglycolique (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...