Name: extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc
Uploaded: 2020-06-26T15:00:00
Duration: 9 min 1 s
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Gefördert wurde diese Arbeit von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie Deutschlands - EXC-2070 – 390732324 (PhenoRob), der Graduiertengruppe GRK2064 und den Individuellen Forschungsstipendien SCHA1274/4-1 und SCHA1274/5-1 an G.S. Wir danken auch Li Schlüter und Brigitte Ueberbach für die technische Unterstützung.

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Hier präsentieren wir eine vielseitige und sensible Methode zur Quantifizierung von InsPs einschließlich PP-InsPs in Pflanzenextrakten und geben praktische Tipps, wie man diese Methode etablieren kann. Obwohl das Protokoll im Allgemeinen robust ist, können suboptimale Ausführungen und Analysen auftreten. In den meisten Fällen können diese Läufe durch eine starke Reduktion oder sogar einen vollständigen Verlust von hochphosphorylierten InsPs, insbesondere der PP-InsP-Arten InsP7 und InsP8,identifiziert werden. Mögliche Ursachen können mikrobielle Verunreinigungen des Pflanzenmaterials und eine unzureichende Deaktivierung der endogenen Pflanzen-PP-InsP-Hydrolasen während der Extraktion aufgrund unzureichender Schleifen und Auftauen von Pflanzenmaterial sein, das nicht in unmittelbarem Kontakt mit dem Extraktionspuffer steht. Weitere Gründe sind eine ungenaue pH-Anpassung durch unzureichende oder übermäßige Zugabe des Neutralisationspuffers oder einfach unzureichendes Probenmaterial. Letzteres kann es schwierig machen, PP-InsPs zu erkennen, da diese oft in sehr geringen Mengen in den Zellen vorhanden sind. Ein Überschuss an Probenmaterial oder ineffiziente Trocknung während Schritt 3.5 kann zu einer Verdünnung der Perchlorsäure führen, was auch zu einer unzureichenden Enzymdeaktivierung und einem spezifischen Verlust von InsP6 und PP-InsPs führen kann. Die Menge an Pflanzenmaterial sowie das in diesem Protokoll verwendete Radiolabel wurden auf DerGrundlage von Kosten und Leistung optimiert und liegen damit nahe an der niedrigsten Menge, die noch für optimale Ergebnisse ausreicht. Darüber hinaus wird das Säulenharz allmählich seine Auflösungskapazität verlieren. Das erste Anzeichen dieses Prozesses ist (aus Gründen, die den Autoren nicht ganz klar sind) ein spezifischer Verlust höherer phosphorylierter InsP-Arten wie der PP-InsPs im HPLC-Spektrum. Bei weiterer Alterung wird selbst InsP6 von der Spalte nicht richtig aufgelöst (Abbildung 1D). Daher ist der Einsatz einer geeigneten Säule sowie die sorgfältige Handhabung der Probe und die ordnungsgemäße Wartung der HPLC-Komponenten entscheidend, um genaue Ergebnisse zu gewährleisten.
Beim Vergleich von Proben und Läufen, insbesondere bei der Erstellung mit unterschiedlichen Geräten (z. B. HPLC-Systeme und -Säulen) oder an verschiedenen Tagen, ist es entscheidend, die Proben untereinander zu normalisieren (wie in Schritt 7.3 beschrieben) und sie auf die gleiche Weise zu analysieren. Nur durch Normalisierung ist es möglich und genau, mehrere Stichproben im selben Graphen zu zeigen (Abbildung 3). Für die Quantifizierung einzelner InsPs im Verhältnis zu den GesamtinsPs oder zu einer anderen spezifischen InsP-Art ist es nicht notwendig, sich zu normalisieren, solange nur relative Werte und nicht absolute Werte angezeigt werden. Idealerweise werden sowohl die InsP-Profile als auch die Quantifizierungen angezeigt. In einigen Fällen ist es jedoch nicht möglich, zwei oder mehr Durchläufe in demselben Diagramm angemessen anzuzeigen. Unterschiedliche Retentionszeiten oder unterschiedliche Hintergrundaktivitätsstufen können den Vergleich nicht quantifizierter SAX-HPLC-Profile allein erschweren. Dasselbe gilt, wenn viele Proben verglichen werden müssen. In solchen Fällen ist eine weitere Auswertung mit einer zusätzlichen Software (z.B. Origin) zur individuellen Spitzenquantifizierung erforderlich.
Die Autoren sind sich bewusst, dass das hier beschriebene Protokoll optimiert werden kann und an jede einzelne Forschungsfrage angepasst werden muss. Obwohl für Arabidopsis Extrakte7,17 in diesem Protokoll optimiert, ist diese Methode vielseitig und kann helfen, InsP-Profile von anderen Pflanzenarten sowie zu bestimmen. Hier zeigen wir diese Möglichkeit, indem wir erstmals ein InsP-Profil für L. japonicuspräsentieren, das keine Änderungen der Etikettierungsbedingungen, insP-Extraktion oder SAX-HPLC-Lauf erforderte (Abbildung 2). Bemerkenswert ist, dass die Unterschiede zwischen L. japonicus und Arabidopsis InsP-Profilen insgesamt ähnlich sind. Zum Beispiel sind in L. japonicus InsP5 [4-OH] oder seiner enantiomeren Form InsP5 [6-OH] reichlicher als InsP5 [1-OH] oder seine enantiomere Form InsP5 [3-OH] im Vergleich zu Arabidopsis,wo InsP5 [1-OH] oder seine enantiomere Form InsP5 [3-OH] die dominierende InsP5 Sind. Ebenso gehen wir davon aus, dass Veränderungen in der Medienzusammensetzung,[3H]- Myo-Inositol-Konzentration, Pflanzenalter, Umgebungsbedingungen (z. B. Licht und Temperatur), Zugabe chemischer Verbindungen oder Analysen pflanzenmikrobieller Wechselwirkungen unter anderem getestet und angepasst werden müssen.myo
Ein wichtiger Nachteil dieser Methode, die berücksichtigt werden muss, ist, dass die Kennzeichnung in einer (sterilen) flüssigen Kultur erfolgt, die für die meisten Landpflanzen keine physiologische Umgebung darstellt. Darüber hinaus ist aufgrund der hohen Kostenmyovon [3H]- Myo-Inositol das Volumen der Etikettierlösung und die Größe des Kulturgefäßes im Allgemeinen begrenzt, was auch die Größe der pflanzen begrenzt, die verwendet werden können. Der Anbau in flüssiger Kultur kann vermieden werden, indem z.B. Blätter von bodenbewachsenen Pflanzen mit [3H]- Myo-Inositol direkt infiltriert und anschließend dem hier beschriebenen Protokoll folgen, wie zuvor berichtet10.myo
Es gibt mehrere Nachteile dieses Protokolls im Vergleich zu alternativen Methoden, wie TiO2 Pull-down gefolgt von PAGE oder Massenspektrometrie-basierten Techniken. Aufgrund der [3H]- Myo-Inositol-Kennzeichnung werden am Ende nur InsP-Arten nachgewiesen, die direkt von radioaktiv markiertem Myo-Inositolstammen.myo Die hier beschriebene Methode ist blind gegenüber anderen Ins-Isomen wie Scyllo-Inositolund anderen Isomern, von denen einige in bestimmten Pflanzen identifiziert wurden44. Darüber hinaus werden Myo-InsPs, die von anderen Wegen abgeleitet werden, ausgeschlossen, einschließlich der durch de novo-Synthese von myo Myo-Inositolund Myo-Inositol-3-Phosphatüber Isomerisierung von Glucose-6-Phosphat, katalysiert durch Myo-Inositol-3-Phosphat-Synthase(MIPS)-Proteine45. de novo Obwohl [32P] oder [33P]-Orthophosphatals alternative Etiketten verwendet werden können, stellt ihre Verwendung einen großen Nachteil dar, da jedes phosphathaltige Molekül, einschließlich der reichlich vorhandenen Nukleotide und seiner Derivate, gekennzeichnet wird. Diese Moleküle können auch mit diesem Protokoll extrahiert werden und an die SAX-Säule binden, was zu einem hohen Niveau an Hintergrundaktivität führt, die die Identifizierung einzelner InsP-Peaks5stören wird. Darüber hinaus kann die Quantifizierung von [32P]- oder [33P] -markierten InsPs und PP-InsPs stark durch Phosphat- und Pyrophosphat-Moiety-Umsätze beeinflusst werden und möglicherweise keine Massenauslesung für Inositolarten melden.
Auf der anderen Seite, [3H]- Myo-Inositol etiketten speziell Myo-Inositol-haltigeMoleküle.myo InsPs, Inositol-haltige Lipide, wie Phosphoinositide, und Galactinol sind in diesem Fall gekennzeichnet. Allerdings werden nur InsPs mit diesem Protokoll analysiert, da Lipide im Extraktionspuffer unlöslich sind und Galactinol nicht an die SAX-Säule bindet.
Bisher sind die Unterschiede zu einem InsP-Profil der Pflanze, das durch [3H]-2 Myo-Inositol-Etikettierung erzeugt wird, im Vergleich zu einer durch TiO 2 Pulldown/PAGE ermittelten, unbekannt, da solche Vergleiche in Pflanzen nicht durchgeführt wurden.myo Eine aktuelle Studie an Tierzellen befasste sich mit dieser Frage46. In dieser Arbeit wurde ein Pool von InsP6 identifiziert, der durch [3H]- Myo-Inositol-Etikettierung unsichtbar ist, der dabei direkt aus Glucose-6-Phosphat abgeleitet werden sollte, indem SAX-HPLC-Profile mit PAGE-Gelen von Säugetierzelllinien verglichen wurden.myo 24 h Phosphathunger führten bei der Quantifizierung von PAGE-Gelen von InsPs, die mit TiO2 2-Pulldown gereinigt wurden, zu einem 150%igen Anstieg von InsP6. SAX-HPLC-Analysen von [3H]- myo-inositol-markierten Zellen, die identisch behandelt wurden, zeigten nur einen Anstieg um 15% von [3H]-InsP6.myo Wie bereits erwähnt, sind InsPs, die unter InsP5 liegen, mit der PAGE-Analyse in den meisten Fällen nicht nachweisbar. Radiolabeling gefolgt von SAX-HPLC scheint die Methode der Wahl zu sein, solange massenspektrometrische Protokolle nicht optimiert sind, um diese Gruppe von stark negativ geladenen Molekülen zu erkennen.
Eine weitere verbleibende Herausforderung besteht darin, Enantiomere in SAX-HPLC-Analysen (oder in jeder anderen Methode für InsP-Analysen)10,17zu unterscheiden. Diese Herausforderung kann durch die Zugabe von chiralen Selektoren, d.h. enantiopure Verbindungen wie L-Arginin-Amid, die mit den jeweiligen enantiomeren Molekülen interagieren, um diastereomere Komplexe zu bilden, die10getrennt werden können, angegangen werden. Unserer Kenntnis nach wurde dieser Ansatz nur umgesetzt, um die enantiomischen InsP 5-Isomer InsP5 [1-OH] und InsP5 [3-OH] durch NMR-Analysen10zu diskriminieren.5 Diskriminierung anderer enantiomere Paare oder erfolgreiche Diskriminierung von Enantiomern durch chirale SAX-HPLC-Analyse oder chirale PAGE-basierte Methoden wurden noch nicht gemeldet und sollten weiterentwickelt werden. Unter Berücksichtigung der konservierten Synthese und der konservierten Regulierung von PP-InsPs durch Phosphorverfügbarkeit stellen wir uns vor, dass insbesondere nicht-radioaktive Methoden wie PAGE- oder MS-basierte Methoden zusammen mit Nährstoffanalysen dazu beitragen werden, die Bemühungen zur Messung von Fernerkundungsdaten zur Diagnose von Nährstoffmangel in Kulturen17,18,24,25zu kalibrieren. Die hier vorgestellte Methode kann jedoch derzeit noch als Goldstandard für InsP-Analysen betrachtet werden und wird entscheidend dazu beitragen, neue Funktionen dieser faszinierenden Botenstoffe in Pflanzen zu entdecken.

Vor fast vier Jahrzehnten tauchten Inositolphosphate (InsPs) als Signalmoleküle auf, nachdem Ins(1,4,5)P3 (InsP3) als zweiter Botenstoff identifiziert wurde, der die rezeptorvermittelte Freisetzung von Ca2+ in tierseuchen Zellen1,2aktiviert. Bis heute wurde kein InsP3-Rezeptor (IP3-R) in Pflanzen identifiziert, was eine direkte Signalfunktion für InsP3 in Pflanzenzellen3in Frage stellt.3 Unabhängig davon dient InsP3 als Vorläufer für andere InsPs, die an mehreren Pflanzenentwicklungsprozessen beteiligt sind, einschließlich der Regulierung spezifischer Signalwege3,4,5,6,7,8. Zum Beispiel kann InsP3 weiter phosphoryliert werden in InsP6, auch bekannt als "Phytinsäure", die eine Hauptquelle von Phosphat, Myo-Inositol und Kationen darstellt, und wurde gezeigt, dass eine Schlüsselrolle in der Pflanzenabwehr gegen Krankheitserreger, mRNA-Export und Phosphat-Homöostase5,9,10,11,12. myo
Inositol-Pyrophosphate (PP-InsPs) sind eine Klasse von InsPs, die mindestens eine hochenergetische Di-Phospho-Bindung enthalten, die ursprünglich in tierischen Zellen, Amöben und Hefe identifiziert wurde, wo sie in verschiedenen zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle spielen13,14,15. Trotz wegweisender Arbeiten an PP-InsPs in Pflanzen16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, bleiben die biologischen Funktionen und die Isomeridentität dieser Moleküle noch weitgehend rätselhaft. In der Modellpflanze Arabidopsis thalianawurde vorgeschlagen, die Abwehr gegen Insektenpflanzenfresser und nekrotrophe Pilze durch Zufall-Nachweis von InsP8 und aktiven Jasmonaten durch den ASK1-COI1-JAZ-Rezeptorkomplex17zu regulieren. Darüber hinaus wurden Rollen von InsP8 und anderen PP-InsPs in der Energiehomöostase und Nährstoffsensorik sowie der Phosphathomöostasevorgeschlagen 17,23,24,25,26.
Unabhängig vom eingesetzten biologischen System war eine der wichtigsten methodischen Herausforderungen bei der Untersuchung von InsPs der zuverlässige Nachweis und die präzise Quantifizierung dieser Moleküle. Massenspektrometrie-basierte Methoden wurden verwendet, um InsPs, einschließlich PP-InsPs, aus Zellextrakten zu erkennen. Diese Studien konnten jedoch keine unterschiedlichen Isomere unterscheiden26,27. Ein anderer Ansatz zur Analyse von InsPs nutzt den Pull-down2 von InsPs aus Zelllysaten mit TiO 2-Perlen, gefolgt von Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) der eluierten InsPs. Die InsPs können dann entweder mit Toluidinblau oder DAPI24,28,29gebeizt werden. Bisher ist es jedoch nicht möglich, InsPs, die niedriger als InsP5 sind, mit dieser Methode zuverlässig zu erkennen. Kürzlich wurde eine Methode mit [13C]- Myo-Inositol zur Kernspinresonanzanalyse (NMR) von InsPs als Alternative zur starken Anionenaustausch Hochleistungschromatographie (SAX-HPLC)30veröffentlicht.myo Diese Technik wurde berichtet, um eine ähnliche Empfindlichkeit im Vergleich zu SAX-HPLC zu erreichen und den Nachweis von 5-InsP7zu ermöglichen, sowie die Diskriminierung von verschiedenen nicht-enantiomerinin insetomerischen InsP 5-Isomeren aus Zellextrakten.5 Die Implementierung der NMR-basierten Methode erfordert jedoch chemisch synthetisierte und kommerziell nicht verfügbare [13C]- Myo-Inositol.myo Daher ist die in den meisten Fällen angewandte Methode das Radiolabeling von Proben mit [3H]- Myo-Inositol, gefolgt von SAX-HPLC31,32,myo33. Diese Technik basiert auf der myoAufnahme von radioaktivem Myo-Inositol in die Pflanze und ihrer Umwandlung in verschiedene InsPs durch die kombinierte Aktivität von dedizierten zellulären Kiinasen und Phosphatasen.
Die [3H]-markierten InsPs werden dann mit SAX-HPLC säureextrahiert und fraktioniert. Aufgrund ihrer negativen Ladung interagieren die InsPs stark mit der positiv geladenen stationären Phase der SAX-HPLC-Säule und können mit einem Puffergradienten eluiert werden, der steigende Phosphatkonzentrationen enthält, um InsPs aus der Kolonne zu übertreffen. Die Elutionszeiten hängen daher von der Ladung und Geometrie der zu trennenden InsP-Art ab. In Ermangelung von chiralen Säulen können nur nicht-enantiomere Isomer durch dieses Protokoll getrennt werden. Radiolabeled Standards können jedoch verwendet werden, um die isomerische Natur eines bestimmten InsP-Peaks zuzuweisen. Mehrere Bemühungen verschiedener Laboratorien in der Vergangenheit, markierte und nicht gekennzeichnete Standards mit (bio)chemischen Methoden zu erzeugen oder sie aus verschiedenen Zellen und Organismen zu reinigen, haben dazu beigetragen, bestimmten InsP-Arten Spitzen zuzuweisen und auch die isomerische Identität einzelner InsP-Arten5,7,21,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43zu verengen. Auch die jüngste Aufklärung von enzymatischen Wegen, die zur Bildung von PP-InsPs in Pflanzen führen, sowie die Entdeckung eines bakteriellen Typ-III-Effektors mit einer spezifischen 1-Phytase-Aktivität, liefern Informationen darüber, wie nützliche Standards für diese Analysen generiert werden können10,17,18,22,23.
Die resultierenden Fraktionen können in einem flüssigen Szintillationszähler aufgrund des β-Zerfalls von Tritium (3H) gemessen werden. Mit zunehmender Etikettierungszeit wird ein stationäres Isotopengleichgewicht erreicht, nach dem die erhaltenen InsP-Profile den InsP-Status der Pflanze31darstellen sollten. Der große Vorteil dieses Protokolls im Vergleich zu anderen verfügbaren Techniken ist die hohe Empfindlichkeit, die durch den Einsatz des direkten Vorläufers für InsPs und die Messung eines radioaktiven Signals erreicht wird.
SAX-HPLC von Proben, die aus [3H]- myo-inositol-markierten Pflanzen oder anderen Organismen extrahiert wurden, wird häufig für den Nachweis und die Quantifizierung von InsPs verwendet, die von niedrigeren InsP-Arten bis hin zu PP-InsPs reichen, was ein wertvolles Werkzeug darstellt, um den Stoffwechsel, die Funktion und die Wirkweisen von InsPs besser zu verstehen.myo Bisher ist diese Methode auch die am besten geeignete Wahl für Forscher mit besonderem Interesse an niedrigeren InsP-Arten. Während die Grundlagen dieses Verfahrens, auf dem das hier beschriebene Protokoll aufbaut, zuvor beschrieben wurden7,21,31,34, fehlt noch ein detailliertes Protokoll, das auf die Analyse von pflanzlichen InsPs und insbesondere von PP-InsPs zugeschnitten ist. Frühere Veröffentlichungen berichteten von Schwierigkeiten, die geringen insbesondere InsP8, aufgrund eines oder mehrerer der folgenden Faktoren: relativ geringe Mengen an Pflanzenmaterial, [3H]- Myo-Inositol mit geringer spezifischer Aktivität (> 20 Ci/mmol), Verwendung von Extraktionspuffern, die entweder nicht auf Perchlorsäure basieren oder weniger konzentriert als 1 M sind, unterschiedliche Neutralisationspuffer sowie suboptimale Gradienten oder Nachweis von [3H] mit einem Online-Detektor.myo Im Vergleich zu diesen Studien ist das hier vorgestellte Protokoll für den zuverlässigen Nachweis von PP-InsPs7,21,34ausgelegt.
Hier stellen wir Ihnen einen detaillierten Workflow vor, angefangen beim Aufbau der Anlagen bis hin zum Pflanzenanbau und der Etikettierung, der InsP-Extraktion und dem SAX-HPLC-Lauf selbst. Obwohl die Methode für die Modellpflanze A. thalianaoptimiert wurde, kann sie leicht modifiziert werden, um andere Pflanzenarten zu untersuchen, wie hier mit dem ersten gemeldeten InsP-Profil des Modells Legume Lotus japonicusgezeigt. Obwohl die Verwendung einer anderen Pflanzenart eine gewisse Optimierung erfordern könnte, gehen wir davon aus, dass diese geringfügig sein werden, was dieses Protokoll zu einem guten Ausgangspunkt für weitere Forschungen in PflanzeninsPs macht. Um mögliche Optimierungen zu ermöglichen, geben wir jeden Schritt innerhalb des Protokolls an, in dem Änderungen möglich sind, sowie alle kritischen Schritte, die bei der erstmaligen Etablierung der Methode eine Herausforderung darstellen können. Darüber hinaus berichten wir, wie die mit dieser Methode gewonnenen Daten für die Quantifizierung bestimmter InsPs verwendet werden können und wie verschiedene Proben analysiert und verglichen werden können.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>model: 5430 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diammonium hydrogen phosphate, &#8805;97 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0268.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, &#8805;99 %, p.a., ACS</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>LAMBDA Instruments GmbH</td>
			<td>model: OMNICOLL single channel collector</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth incubator</td>
			<td>poly klima GmbH</td>
			<td>model: PK 520-LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC pumps</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector for HPLC</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>model: Rheodyne 9725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol, myo-[1,2-3H(N)]</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals Inc.</td>
			<td>ART 0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>University, Chemistry Department</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>model: TRI-CARB 2900TR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pestle</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>CXH7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 &#181;m pore size, 47 mm circle</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>10401770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer for HPLC</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: M 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium, salt mixture</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro software</td>
			<td>OriginLab Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthophosphoric acid, &#8805;85 %, p.a., ISO</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>6366.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partisphere 5 &#181;m SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4621-0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile</td>
			<td>Greiner Bio One International GmbH</td>
			<td>688161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-indicator paper pH 5.5 - 9.0, Neutralit</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>109564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>P743.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>57648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL</td>
			<td>Simport Scientific Inc.</td>
			<td>S207-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench</td>
			<td>LaboGene</td>
			<td>model: ScanLaf MARS 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, &#8805;99,5 %, p.a.</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>6013599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure deionized water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrenchless WVS End Fitting Kit</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4631-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc

Die Phosphatester von myoMyo-Inositol, auch inositolphosphate (InsPs) bezeichnet, sind eine Klasse von zellulären Regulatoren, die eine wichtige Rolle in der Pflanzenphysiologie spielen. Aufgrund ihrer negativen Ladung, geringen Häufigkeit und Anfälligkeit für hydrolytische Aktivitäten ist der Nachweis und die Quantifizierung dieser Moleküle eine Herausforderung. Dies gilt insbesondere für hochphosphorylierte Formen, die "hochenergetische" Diphosphobindungen enthalten, auch inositolpyrophosphate (PP-InsPs) bezeichnet. Aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit, starke Anionenaustausch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (SAX-HPLC) von Pflanzen mit[3H]-Myo-Inositolgekennzeichnet ist derzeit die Methode der Wahl, um diese Moleküle zu analysieren. Durch die Verwendung von [3H]- Myo-Inositol zum Radiolabel Pflanzensämlinge können verschiedene InsP-Arten, darunter mehrere nicht-enantimere Isomere, nachgewiesen und mit hoher Empfindlichkeit diskriminiert werden.myo Hier wird der Aufbau eines geeigneten SAX-HPLC-Systems beschrieben, ebenso wie der komplette Workflow von Pflanzenanbau, Radiolabeling und InsP-Extraktion bis hin zum SAX-HPLC-Lauf und anschließender Datenanalyse. Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Diskriminierung und Quantifizierung verschiedener InsP-Arten, einschließlich mehrerer nicht-enantimerer Isomere und der PP-InsPs, InsP7 und InsP8, und kann leicht an andere Pflanzenarten angepasst werden. Als Beispiele werden SAX-HPLC-Analysen von Arabidopsis thaliana und Lotus Japonicus Sämlingen durchgeführt und komplette InsP-Profile vorgestellt und diskutiert. Die hier beschriebene Methode stellt ein vielversprechendes Werkzeug dar, um die biologische Rolle von InsPs in Pflanzen besser zu verstehen.

Die hier gezeigten Ergebnisse sollen mögliche Ergebnisse veranschaulichen, die nach Schwankungen auf technischer und biologischer Ebene erzielt werden. Die erste wird durch Analysen anhand von neuen versus gealterten Spalten (Abbildung 1) und frischen im Vergleich zu gespeicherten Proben (Abbildung 3) veranschaulicht, und die zweite durch Auswertung von Extrakten aus zwei verschiedenen Pflanzensystemen, A. thaliana (Abbildung 1, Abbildung 3) und L. japonicus (Abbildung 2).
Ein optimaler SAX-HPLC-Lauf ist auf Abbildung 1A'u2012Cdargestellt, die ein vollständiges Inositol-Polyphosphat-Spektrum zeigt, das nach der Szintillationszählung aus A. thaliana-Extrakten gewonnen wird. Beachten Sie, dass Spitzen schön getrennt sind und verschiedenen Isomern (oder Enantiomer-Paaren) basierend auf chromatographischen Mobilitäten zugeordnet werden können, die oben beschrieben wurden5,7.
Abbildung 2 zeigt das repräsentative Ergebnis einer SAX-HPLC-Analyse von L. japonicus Sämlingen, die unter den gleichen Bedingungen wie die Arabidopsis Sämlinge angebaut und gekennzeichnet wurden. Während vermutlich alle InsP-Arten und Spitzen, die von Arabidopsis bekannt sind, zu sehen sind, gibt es erhebliche Unterschiede in Bezug auf die relative (z.B. Verhältnisse zwischen Isomere) Menge spezifischer InsP-Isomere, wenn man die Profile beider Arten vergleicht. Zum Beispiel zeigten die Lotus-Extrakte erhöhte InsP3c, InsP4b, InsP 5b und reduzierte InsP3a, InsP4a, InsP5a und InsP5c im Vergleich zu Arabidopsis, die Raum für weitere Untersuchungen lässt.5b Abbildung 2D zeigt die unterschiedlichen Verhältnisse zwischen InsP-Isomern zwischen Arabidopsis und Lotus.
Abbildung 3 zeigt zwei InsP-Profile einer Probe, die nach der Extraktion geteilt wurde. Die erste Hälfte wurde sofort analysiert und die zweite Hälfte einen Tag später, nach Lagerung bei -80 °C. Beachten Sie, dass zwischen den verschiedenen Stichproben nur geringfügige Unterschiede beobachtet werden (d. h. schwarze und rote Linien in Abbildung 3A- u2012Cund Abbildung 3D). Dies zeigt, dass ein Frost-Tau-Zyklus der Probe nicht schadet und dass die Methode selbst reproduzierbare Ergebnisse erzeugt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig01.jpg"> Abbildung 1: Typisches InsP-Profil einer erfolgreichen und einer erfolglosen SAX-HPLC-Analyse, die mit diesem Protokoll durchgeführt wurde. (A2012C) SAX-HPLC Profil von 17 Tage alten Wildtyp (Col-0) Arabidopsis Sämlinge radioaktiv mit [3H]- Myo-Inositol.myo Die globale InsP-Extraktion und der SAX-HPLC-Lauf wurden am selben Tag durchgeführt. (A) Volle Spektren; (B, C) Zoom-Ins des Profils in A. Alle sichtbaren Peaks werden hervorgehoben und den entsprechenden InsP-Arten zugeordnet. Basierend auf veröffentlichten chromatographischen Mobilitäten5,7, insP4a wahrscheinlich repräsentiert Ins(1,4,5,6)P4 oder Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a steht für InsP5 [2-OH], InsP5b steht für InsP5 [4-OH] oder seine enantiomere Form InsP5 [6-OH], und InsP5c steht für InsP5 [1-OH] oder seine enantiomere Form InsP5 [3-OH]. Die isomerischen Naturen von InsP3a-c, InsP4b, InsP7und InsP8 sind noch unbekannt. Panel (D) zeigt ein SAX-HPLC-Profil von gleich gewachsenen Pflanzen, jedoch mit einer gealterten Spalte (>40 Durchläufe). Eine deutliche Verringerung von InsP6 im Vergleich zu anderen InsP-Arten und das Fehlen von PP-InsPs ist sichtbar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2.jpg"> Abbildung 2: Repräsentatives InsP-Profil von L. japonicus-Pflanzen. SAX-HPLC-Profil (A- 2012C) von 17 Tage alten Wildtyp (Gifu) L. japonicus Sämlinge radioaktiv mit [3H]- Myo-Inositol.myo (A) Volle Spektren; (B, C) Zoom-Ins des Profils in A. Alle sichtbaren Peaks werden hervorgehoben und den entsprechenden InsP-Arten zugeordnet. Basierend auf den veröffentlichten chromatographischen Mobilitäten5,7stellt InsP4a wahrscheinlich Ins(1,4,5,6)P4 oder Ins(3,4,5,6)P4, InsP5b wahrscheinlich in InsP5 [4-OH] oder seine enantiomere Form InsP5 [6-OH] dar, und InsP5c stellt wahrscheinlich InsP5 [1-OH] oder seine enantiomere Form InsP5 [3-OH] dar. Die isomerischen Naturen von InsP3a-c, InsP4b, InsP7und InsP8 sind unbekannt. (D) Vergleich zwischen den einzelnen InsP-Arten (in % der Gesamtaktivität aus der Elution 25-u201296) von A. thaliana (Daten aus Abbildung 1A'u2012C) und L. japonicus (Daten aus Abbildung 2A–C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig03.jpg"> Abbildung 3: InsP-Profile einer geteilten Probe, die die Reproduzierbarkeit von SAX-HPLC-Analysen veranschaulichen. (A2012C) SAX-HPLC Profile von 17 Tage alten Wildtyp (Col-0) Arabidopsis Sämlinge radioaktiv mit [3H]- Myo-Inositol.myo Vor dem Lauf wurde die Probe geteilt und die eine Hälfte lief sofort und die andere Hälfte einen Tag später nach Lagerung bei -80 °C. (A) Volle Spektren; (B, C) Zoom-Ins des Profils in A. Alle sichtbaren Peaks werden hervorgehoben und den entsprechenden InsP-Arten zugeordnet. Basierend auf veröffentlichten chromatographischen Mobilitäten5,7, insP4a wahrscheinlich repräsentiert Ins(1,4,5,6)P4 oder Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a steht für InsP5 [2-OH], InsP5a steht für InsP5 [2-OH], InsP5b für InsP5 [4-OH] oder seine enantiomere Form InsP5 [6-OH], und InsP5c repräsentiert InsP5 [1-OH] oder seine enantiomere Form InsP5 [3-OH]. Die isomerischen Naturen von InsP3a-c, InsP4b, InsP7und InsP8 sind noch unbekannt. Panel D zeigt die Quantifizierung von InsP6 und der PP-InsPs InsP7 und InsP8 beider Durchläufe. Die Werte stellen den Betrag (in %) dar. der jeweiligen InsP-Arten relativ zu allen InsP (Gesamtaktivität aus Elution 25–96). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Softwareeinstellungen für die Flüssigkeitsszintillationszählung mit einem Lichtszintillationszähler. Screenshots, die die Softwareversion zeigen, sowie Einstellungen, die für die Szintillationszählung von [3H] mit diesem Protokoll durchgeführten Samples verwendet werden, werden dargestellt. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig01.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 2: Repräsentatives Beispiel für die Datennormalisierung. Ein Screenshot eines Arbeitsblatts zeigt alle Schritte und Formeln, die zum Normalisieren von SAX-HPLC-Läufen miteinander verwendet werden. Zur Vereinfachung werden nur Bruchteile von 25 bis 35 Proben angezeigt. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig02.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 3: Spitzenbestimmung, Hintergrundsubtraktion und Integration mit Analysesoftware. (A) Daten aus der SAX-HPLC-Analyse werden in die Software geladen (Minuten 28-96) und das Peak Analyzer Tool ausgewählt. (B-2012E) Die Basislinie wird manuell definiert, indem Punkte zwischen einzelnen Peaks festgelegt werden, und der Hintergrund wird subtrahiert. (F) Peaks werden manuell anhand des Aussehens bestimmt und veröffentlichte chromatographische Mobilitäten5,7. (G) Spitzenbereiche werden manuell durch cpm-Werte definiert. (H) Peaks sind integriert und werden als % aller Peaks berechnet. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig03.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.</a>

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Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

Hier beschreiben wir starke Anionenaustausch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie von [3H]- Myo-Inositol-markierten Sämlingen, die eine hochempfindliche Methode zum Nachweis und quantifizieren von Inositolpolyphosphaten in Pflanzen ist.myo

Extraktion und Quantifizierung von löslichen, radioaktiv markierten Inositolpolyphosphaten aus verschiedenen Pflanzenarten mit SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

Das hier gezeigte Protokoll kann helfen, die Biosynthese von Inositolpolyphosphaten von Pflanzen aufzuklären und Fragen zu ihrer Rolle bei bestimmten Aspekten des Pflanzenstoffwechsels und der Pflanzenentwicklung zu beantworten. Diese Methode ist hochsensibel, da die Verwendung des radioaktiv markierten Vorläufers von Inositolphosphaten einen zuverlässigen Nachweis aller Inositphosphatarten in Pflanzen ermöglicht. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da die meisten Pflanzenbiologen mit der HPLC-Analyse und dem erforderlichen Setup nicht vertraut sind.Darüber hinaus sind kritische Schritte dieses Protokolls, wie die Extraktion von Inositolphosphaten, ohne ordnungsgemäße Demonstration schwer zu befolgen. Beginnen Sie mit der Einrichtung eines Systems bestehend aus zwei unabhängigen HPLC-Pumpen, eine für Puffer A und eine für Puffer B. Beide Pumpen müssen gemeinsam über einen Computer oder eine Masterpumpe gesteuert werden. Implementieren Sie eine Kolbendichtungswäsche für beide Pumpen, entweder über Gravitationskraft oder über eine dritte Niederdruckpumpe.Schließen Sie beide Pumpen an einen dynamischen Mischer an, und schließen Sie den Mischer dann mit einer Probenschleife mit einer Probenschleife an, die mindestens einen Milliliter Kapazität hat. Verwenden Sie Kapillaren, um das Einspritzventil mit der Säule und die Säule mit dem Fraktionskollektor zu verbinden. Seufzen Sie Lotussamen in einer Reihe auf quadratischen Petrischalen, gefüllt mit soliden Wachstumsmedien, die aus 0,8% bakteriologischem Agar in entionisiertem Wasser bestehen.Lassen Sie die Samen für mindestens drei Tage bei vier Grad Celsius im Dunkeln zu schichten. Legen Sie die Samen in einen Wachstumsbrutkasten. Übertragen Sie 10 bis 20 Sämlinge in einen Brunnen einer 12-well-klaren flachen Bodenzellkulturplatte gefüllt mit zwei Millilitern halbfester MS-Salzlösung, die mit 1%Saccharose ergänzt und auf pH 5.7 eingestellt ist.45 Mikrocurie von 3H Myo-Inositol auf die Platte geben und sanft wirbeln. Bedecken Sie die Platte mit einem Deckel und versiegeln Sie sie mit mikroporösem chirurgischem Klebeband. Legen Sie es dann wieder in den Wachstums-Inkubator.Nach fünf Tagen Etikettierung Sämlinge aus den Medien nehmen und kurz mit entionisiertem Wasser waschen. Trocknen Sie sie mit Papiertüchern und übertragen Sie sie in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr, um sicherzustellen, dass das Rohr nicht überfüllt wird. Fangen Sie das Rohr in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius bis zur Extraktion.Nehmen Sie die Proben aus dem Gefrierschrank und bewahren Sie sie in flüssigem Stickstoff auf, bis sie einsatzbereit sind. Schleifen Sie sie mit einem Mikrozentrifugenrohr-Pestle, bis sie anfangen zu tauen, dann fügen Sie 500 Mikroliter eiskalten Extraktionspuffer. Schleifen Sie weiter, bis die Probe homogenisiert und die Lösung gefärbt ist.Zentrifugieren Sie die Proben für 10 Minuten bei 18.000 mal G und vier Grad Celsius. Dann den Überstand in ein frisches 1,5-Milliliter-Rohr geben. Die zur Gewinnung verwendeten Rohre gelten als feste radioaktive Abfälle und müssen entsprechend entsorgt werden.Fügen Sie dem Extrakt vorsichtig 300 Mikroliter Neutralisationspuffer hinzu, was sofort zu Ausfällungen von Proteinen und Sprudeln führt. Mischen Sie die Probe nach einer Minute mit einer Pipettespitze und pipette fünf Mikroliter auf pH-Papier, um sicherzustellen, dass der pH-Wert zwischen sieben und acht liegt. Fügen Sie bei Bedarf kleine Mengen entweder Neutralisationspuffer oder Extraktionspuffer hinzu, bis der gewünschte pH-Wert erreicht ist, und lassen Sie die Proben mindestens eine Stunde lang mit offenem Deckel auf Eis ruhen.Dann zentrifugieren Sie sie für 10 Minuten und übertragen Sie den Überstand in ein frisches 1,5 Milliliter Rohr. Den Fraktionssammler mit 96 kleinen Szintillationsfläschchen ausstatten und jede Durchstechflasche mit zwei Millilitern eines geeigneten Szintillationscocktails füllen, der mit niedrigen pH-Puffern und hohen Ammoniumphosphatkonzentrationen kompatibel ist. Starten Sie das HPLC-System, aktivieren Sie dann die Kolbendichtungswäsche und halten Sie sie während des gesamten Laufs aktiviert.Die Probe manuell mit einer geeigneten Spritze injizieren. Starten Sie die Pumpen und den Farbverlauf. Während der HPLC-Lauf läuft, überprüfen Sie den Druck regelmäßig.Der Startdruck sollte etwa 18 bis 24 bar betragen und langsam auf 50 bis 60 bar ansteigen, sobald 100% Puffer B erreicht ist. Nach dem Lauf die Fläschchen fest und kräftig schütteln die Fraktionen mit dem Szintillationscocktail zum Mischen. Wenn Sie nicht direkt mit der Messung fortfahren, halten Sie die Durchstechflaschen in einer aufrechten Position im Dunkeln.Um die Fraktionen zu messen, legen Sie die Fläschchen in die Szintillationszählerracks ein, indem Sie Racks verwenden, die in die kleinen Fläschchen passen und jede Durchstechflasche für fünf Minuten in einem flüssigen Szintillationszähler messen. Bereiten Sie ein 2D-Liniendiagramm vor, in dem die gemessenen Zahlen pro Minute oder CPM auf die Aufbewahrungszeit geplottet werden. Um Stichproben miteinander zu vergleichen, normalisieren Sie die Daten, indem Sie das CPM aus jedem eluierten Bruch von Minute 25 bis 96 für jede einzelne Probe summieren und das gesamte CPM von dieser Probe durch das gesamte CPM der anderen Stichproben dividieren.Um relative Quantifizierungen bestimmter Inositol-Polyphosphatspitzen durchzuführen und anschließend Stabdiagramme zu erstellen, die Replikationsdaten für statistische Analysen enthalten, setzen Sie die Analyse mit einer speziellen Software fort, die Spitzenbereiche von Chromatogrammen berechnen kann. Ein vollständiges Inositol-Polyphosphat-Spektrum, das nach der Szintillationszählung aus A.thaliana-Extrakten gewonnen wird, wird hier gezeigt. Die Peaks sind schön getrennt und können verschiedenen Isomern zugeordnet werden.Wenn eine gealterte Säule verwendet wird, ist eine deutliche Reduktion von Inositol Hexakisphosphat und das Fehlen von Inositolpyrophosphat sichtbar. Die SAX-HPLC-Analyse wurde auch an L.japonica Sämlingen durchgeführt, die unter den gleichen Bedingungen wie die Arabidopsis Sämlinge angebaut und gekennzeichnet wurden. Während vermutlich alle Inositol-Polyphosphat-Arten und Spitzen, die von Arabidopsis bekannt sind, gesehen werden können, gibt es Unterschiede in den relativen Mengen spezifischer Inositol-Polyphosphat-Isomere zwischen den beiden Arten.Um zu zeigen, dass Proben nicht unmittelbar nach der Extraktion analysiert werden müssen, wurde eine Probe in zweieinhalb davon geteilt, die am nächsten Tag nach der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius analysiert wurde. Die Unterschiede zwischen den SAX-HPLC-Profilen der frischen und gefrorenen Proben waren nicht signifikant, was zeigt, dass ein Frost-Tau-Zyklus der Probe nicht schadet und dass die Methode selbst reproduzierbare Ergebnisse liefert. Beim Versuch dieses Protokolls, schleifen Sie die Proben immer gründlich, gefroren und mit Extraktionspuffer, und zielen Sie auf eine nahezu neutrale pH nach neutraler Neutralisierung, um eine maximale Rückgewinnung von radio-markiertem Inositolphosphat für die SAX-HPLC-Analyse zu gewährleisten.Es ist möglich, radiobeschriftete Funketiketten aus einem SAX-HPLC-Lauf für den späteren Gebrauch zu reinigen, z.B. in gegenseitigen Reaktionen, indem Fraktionen ohne Szintillationscocktails gesammelt und nur kleine Aliquots gemessen werden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Experimentelles Design für Laser Mikrodissektion RNA-Seq: Lehren aus einer Analyse von Maisblattentwicklung

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

Forschung

Biochemie

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Eine einfache Fraktionierte Extraktionsmethode für die umfassende Analyse von Metaboliten, Lipiden und Proteinen aus einer einzigen Probe

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA Interactome Capture aus Pflanzenprotoplasten

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation und Atemwege Messungen der Mitochondrien von Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fraktionierung für Auflösung von löslichen und unlöslichen Huntingtin-Arten

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Blatt-Spray-Massenspektrometrie: Eine schnelle Ambient Ionisation Technik direkt Metaboliten von Pflanzengewebe bewerten

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Koffein-Extraktion, enzymatische Aktivität und Genexpression von Koffein-Synthase aus Anlage Zellsuspensionen

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Abschätzung des Ligningehalts von pflanzlicher Biomasse mit Thioglykolsäure (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...