Name: extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc
Uploaded: 2020-06-26T15:00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC at JoVE.com

इस काम को जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति के तहत ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) द्वारा वित्त पोषित किया गया था-EXC-२०७०-३९०७३२३२४ (फेनोरोब), अनुसंधान प्रशिक्षण समूह GRK2064 और व्यक्तिगत अनुसंधान अनुदान SCHA1274/4-1 और SCHA1274/5-1 G.S.S. हम तकनीकी सहायता के लिए ली श्ल्टर और ब्रिजित यूबरबाख को भी धन्यवाद देते हैं ।

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>model: 5430 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diammonium hydrogen phosphate, &#8805;97 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0268.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, &#8805;99 %, p.a., ACS</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>LAMBDA Instruments GmbH</td>
			<td>model: OMNICOLL single channel collector</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth incubator</td>
			<td>poly klima GmbH</td>
			<td>model: PK 520-LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC pumps</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector for HPLC</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>model: Rheodyne 9725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol, myo-[1,2-3H(N)]</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals Inc.</td>
			<td>ART 0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>University, Chemistry Department</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>model: TRI-CARB 2900TR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pestle</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>CXH7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 &#181;m pore size, 47 mm circle</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>10401770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer for HPLC</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: M 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium, salt mixture</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro software</td>
			<td>OriginLab Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthophosphoric acid, &#8805;85 %, p.a., ISO</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>6366.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partisphere 5 &#181;m SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4621-0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile</td>
			<td>Greiner Bio One International GmbH</td>
			<td>688161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-indicator paper pH 5.5 - 9.0, Neutralit</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>109564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>P743.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>57648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL</td>
			<td>Simport Scientific Inc.</td>
			<td>S207-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench</td>
			<td>LaboGene</td>
			<td>model: ScanLaf MARS 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, &#8805;99,5 %, p.a.</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>6013599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure deionized water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrenchless WVS End Fitting Kit</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4631-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc

मायो-इनोसिटोल के myoफॉस्फेट एस्टर, को इनोसिटोल फॉस्फेट (आईएनपीएस) भी कहा जाता है, पौधे फिजियोलॉजी में महत्वपूर्ण भूमिकाएं निभाने वाले सेलुलर नियामकों का एक वर्ग है। उनके नकारात्मक आवेश, कम बहुतायत और हाइड्रोलिटिक गतिविधियों के लिए संवेदनशीलता के कारण, इन अणुओं का पता लगाना और परिमाणीकरण चुनौतीपूर्ण है। यह विशेष रूप से 'उच्च ऊर्जा' डिफोस्फो बांड वाले अत्यधिक फॉस्फोरिलेटेड रूपों के लिए मामला है, जिन्हें इनोसिटोल पायरोफोस्फेट (पीपी-इन्स्प्स) भी कहा जाता है। इसकी उच्च संवेदनशीलता के कारण, मजबूत एनियन एक्सचेंज उच्च प्रदर्शन वाले तरल क्रोमेटोग्राफी (एसएक्स-एचपीएलसी) के साथ लेबल किए गए पौधों की[3एच]- मायो-इनोसिटोल वर्तमान में इन अणुओं का विश्लेषण करने के लिए पसंद की विधि है।myo रेडियोलेबल पौधों केरोपणके लिए मायो-इनोसिटोल का उपयोग करके, कई गैर-एन्टिओमेरिक आइसोमर्स सहित विभिन्न आईएनसपी प्रजातियों का पता लगाया जा सकता है और उच्च संवेदनशीलता के साथ भेदभाव किया जा सकता है।myo यहां, एक उपयुक्त सैक्स-एचपीएलसी सिस्टम के सेटअप का वर्णन किया गया है, साथ ही पौधों की खेती, रेडियोलाबेलिंग और आईएनएसपी निष्कर्षण से एसएक्स-एचपीएलसी रन और बाद में डेटा विश्लेषण के लिए पूरा वर्कफ्लो भी वर्णित है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल विभिन्न आईएनपी प्रजातियों के भेदभाव और मात्राकरण की अनुमति देता है, जिसमें कई गैर-एन्टियोमेरिक आइसोमर और पीपी-आईएनपी, आईएनएसपी7 और आईएनएसपी8शामिल हैं, और आसानी से अन्य पौधों की प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के रूप में, अरबीडोप्सिस थैलियाना और लोटस जैपोनिकस रोपण के सैक्स-एचपीएलसी विश्लेषण किए जाते हैं और पूर्ण आईएनपी प्रोफाइल प्रस्तुत किए जाते हैं और चर्चा की जाती है। यहां वर्णित विधि पौधों में InsPs की जैविक भूमिकाओं को बेहतर ढंग से समझने के लिए एक आशाजनक उपकरण का प्रतिनिधित्व करती है।

यहां दिखाए गए परिणामों का उद्देश्य तकनीकी और जैविक स्तरों पर भिन्नता के अनुसार प्राप्त संभावित परिणामों को चित्रित करना है । पहला, नए बनाम वृद्ध स्तंभों(चित्रा 1)और ताजा बनाम संग्रहित नमूनों(चित्रा 3)का उपयोग करके विश्लेषण द्वारा उदाहरण दिया गया है, और दूसरा दो अलग-अलग पौध प्रणालियों, ए थैलियाना (चित्रा 1, चित्रा 3)और एल जैपोनिकस (चित्रा 2)से अर्क का मूल्यांकन करके।
एक इष्टतम सैक्स-एचपीएलसी रन को चित्र 1ए\u2012Cपर दर्शाया गया है, जो प्रस्फुटन गिनती के बाद ए थैलियाना अर्क से प्राप्त एक पूर्ण इनोसिटोल पॉलीफॉस्फेट स्पेक्ट्रम दिखाता है। ध्यान दें कि चोटियों को अच्छी तरह से अलग किया जाता है और पहले5,,7वर्णित क्रोमेग्राफिक गतिशीलता के आधार पर विभिन्न आइसोमर्स (या एनेंटिमर-जोड़े) को सौंपा जा सकता है।
चित्रा 2 एल जैपोनिकस रोपण के एक सैक्स-एचपीएलसी विश्लेषण का प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है जो अरबीडोप्सिस रोपण के समान परिस्थितियों में उगाए गए थे और लेबल किए गए थे। जबकि संभवतः सभी आईएनएसपी प्रजातियों और चोटियों कि अरबीडोप्सिस से जाना जाता है देखा जा सकता है, वहां रिश्तेदार के बारे में काफी मतभेद है (जैसे, isomers के बीच अनुपात) विशिष्ट InsP isomers की राशि, जब दोनों प्रजातियों के प्रोफाइल की तुलना । उदाहरण के लिए, लोटस अर्क ने अरबीडोप्सिस की तुलना में आईएनएसपी3सी,आईएनएसपी4बी,आईएनएसपी5बी और कम आईएनएसपी3ए,आईएनएसपी4ए,आईएनएसपी5ए और आईएनएसपी5सी को दिखाया जो आगे की जांच के लिए जगह छोड़ता है । चित्रा 2डी अरबीडोप्सिस और लोटसके बीच आईएनएसपी आइसोमर्स के बीच विभिन्न अनुपातों को दर्शाता है।
चित्रा 3 एक नमूना है कि निष्कर्षण के बाद विभाजित किया गया था की दो InsP प्रोफाइल से पता चलता है । पहली छमाही का तुरंत विश्लेषण किया गया और दूसरी छमाही एक दिन बाद, भंडारण के बाद-८० डिग्री सेल्सियस । ध्यान दें कि चित्रा 3ए\u2012Cऔर चित्रा 3 डी पर विभिन्न नमूनों (यानी, काले और लाल रेखाओं) के बीच केवल मामूली अंतर देखा जाता है। यह दिखाता है कि एक फ्रीज-गल चक्र नमूने को नुकसान नहीं पहुंचाता है और विधि स्वयं प्रजनन योग्य परिणाम उत्पन्न करती है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig01.jpg"> चित्रा 1: इस प्रोटोकॉल के साथ किए गए एक सफल और असफल सैक्स-एचपीएलसी विश्लेषण की विशिष्ट आईएनएसपी प्रोफ़ाइल। (एक\u2012C) 17 दिन पुराने जंगली प्रकार(कर्नल-0) अरबीडोप्सिस रोपण का सैक्स-एचपीएलसी प्रोफाइल[3एच]- मायो-इनोसिटोल के साथ रेडियोलेबल।myo उसी दिन ग्लोबल आईएनएसपी एक्सट्रैक्पन और एसएक्स-एचपीएलसी रन का प्रदर्शन किया गया। (A)पूर्ण स्पेक्ट्रा; (बी, सी) ए में दिखाए गए प्रोफाइल के जूम-इन। सभी दृश्यमान चोटियों को हाइलाइट किया गया है और इसी आईएनएसपी प्रजातियों को सौंपा गया है। प्रकाशित क्रोमेग्राफिक मोबिलिटीज5,,7के आधार पर, आईएनएसपी4ए संभावित आईएनएस (1,4,5,6) पी4 या आईएनएस (3,4,5,6) पी4,आईएनपी5ए का प्रतिनिधित्व करता है, आईएनपी5 [2-ओह], आईएनएसपी5b InsP5 [4-OH] या इसके एंटिओमेरिक फॉर्म InsP5 [6-OH] का प्रतिनिधित्व करता है, और आईएनएसपी5सी आईएनपी5 [1-ओह] या इसके एन्टियोमेरिक फॉर्म InsP5 [3-OH] का प्रतिनिधित्व करता है। आईएनएसपी3ए-सी,आईएनएसपी4बी,आईएनएसपी7और आईएनएसपी8 की आइसोमेरिक प्रकृति अभी भी अज्ञात है। पैनल(डी)समान रूप से उगाए गए पौधों की एक सैक्स-एचपीएलसी प्रोफाइल दिखाता है, लेकिन एक वृद्ध कॉलम (>40 रन) का उपयोग कर रहा है। अन्य आईएनएसपी प्रजातियों की तुलना में आईएनएसपी6 की स्पष्ट कमी और पीपी-आईएनएसपी की अनुपस्थिति दिखाई दे रही है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2.jpg"> चित्रा 2: एल जैपोनिकस पौधों का प्रतिनिधि आईएनएसपी प्रोफाइल। 17 दिन पुराने जंगली प्रकार (गिफू) एल जैपोनिकस रोपण के सैक्स-एचपीएलसी प्रोफाइल(एक\u2012C)[3एच]-मायो-इनोसिटोल के साथ रेडियोलेबल ।myo (A)पूर्ण स्पेक्ट्रा; (बी, सी) ए में दिखाए गए प्रोफाइल के जूम-इन। सभी दृश्यमान चोटियों को हाइलाइट किया गया है और इसी आईएनएसपी प्रजातियों को सौंपा गया है। प्रकाशित क्रोमेग्राफिक गतिशीलता के आधार पर5,,7,InsP4a की संभावना आईएनएस (1,4,5,6) पी4 या आईएनएस (3,4,5,6) पी4,आईएनपी5बी की संभावना आईएनपी5 [4-ओह] या इसके एनेंटीओमेरिक फॉर्म InsP5 [6-OH], का प्रतिनिधित्व करती है। और InsP5c की संभावना InsP5 [1-ओह] या उसके enantiomeric फार्म InsP5 [3-ओह] का प्रतिनिधित्व करता है । आईएनएसपी3ए-सी,आईएनएसपी4बी,आईएनएसपी7और आईएनएसपी8 की आइसोमेरिक प्रकृति अज्ञात है। (घ)ए थैलियाना (चित्रा 1 ए\u2012C से डेटा) और एल जैपोनिकस (चित्रा 2ए-सीसे डेटा) की व्यक्तिगत आईएनपी प्रजातियों (elution25\u201296से कुल गतिविधि के% में) के बीच तुलना । Figure 2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig03.jpg"> चित्रा 3: एसैक्स-एचपीएलसी विश्लेषणों की पुन: उत्पन्नता को दर्शाते हुए एक स्प्लिट नमूने की आईएनपी प्रोफाइल। (एक\u2012C) 17 दिन पुराने जंगली प्रकार(कर्नल-0) अरबीडोप्सिस रोपण के सैक्स-एचपीएलसी प्रोफाइल[3एच]-मायो-इनोसिटोल के साथ रेडियोलेबल।myo रन से पहले, नमूना विभाजित किया गया था और एक आधा तुरंत चलाने के लिए और दूसरे आधे एक दिन बाद भंडारण के बाद-८० डिग्री सेल्सियस (एक)पूर्ण स्पेक्ट्रा; (बी, सी) ए में दिखाए गए प्रोफाइल के जूम-इन। सभी दृश्यमान चोटियों को हाइलाइट किया गया है और इसी आईएनएसपी प्रजातियों को सौंपा गया है। प्रकाशित क्रोमेग्राफिक मोबिलिटीज5,,7के आधार पर, आईएनएसपी4ए संभावित आईएनएस (1,4,5,6) पी4 या आईएनएस (3,4,5,6) पी4,आईएनपी5ए का प्रतिनिधित्व करता है, आईएनपी5 [2-ओह], InsP5a InsP5 [2-OH], InsP5b का प्रतिनिधित्व करता है InsP5 [4-OH] या इसके enantiomeric फार्म InsP5 [6-ओह], और InsP5c InsP5 [1-OH] या उसके enantiomeric फार्म InsP5 [3-ओह] का प्रतिनिधित्व करता है । आईएनएसपी3ए-सी,आईएनएसपी4बी,आईएनएसपी7और आईएनएसपी8 की आइसोमेरिक प्रकृति अभी भी अज्ञात है। पैनल डी आईएनएसपी6 और पीपी-आईएनपी आईएनएसपी7 और आईएनएसपी8 के दोनों रनों की मात्रा दिखाता है । मान राशि का प्रतिनिधित्व करते हैं (%) सभी आईएनएसपी के सापेक्ष संबंधित आईएसएसपी प्रजातियों में से (कुल गतिविधि 25-96 से) । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
पूरक चित्रा 1: प्रकाश प्रस्फुटन काउंटर का उपयोग करके तरल प्रस्फुटन गणना के लिए सॉफ्टवेयर सेटिंग्स। सॉफ्टवेयर संस्करण दिखाने वाले स्क्रीनशॉट, साथ ही इस प्रोटोकॉल के साथ किए गए[3एच] नमूनों की प्रस्फुटन गिनती के लिए उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स को चित्रित किया गया है। <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig01.jpg" target="_blank">इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
पूरक चित्रा 2: डेटा सामान्यीकरण का प्रतिनिधि उदाहरण। एक वर्कशीट का स्क्रीनशॉट सभी चरणों और सूत्रों को सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया SAX-HPLC एक दूसरे के लिए चलाता है दिखाता है । सरलीकरण के लिए नमूनों के केवल अंश 25-35 दर्शाए गए हैं। <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig02.jpg" target="_blank">इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
पूरक चित्रा 3: पीक दृढ़ संकल्प, पृष्ठभूमि घटाव और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एकीकरण। (A)सैक्स-एचपीएलसी विश्लेषण से डेटा सॉफ्टवेयर (मिनट 28-96) में लोड किया जाता है और पीक एनालाइजर टूल का चयन किया जाता है। (BB\u2012ई) आधार रेखा को व्यक्तिगत चोटियों के बीच अंक स्थापित करके मैन्युअल रूप से परिभाषित किया गया है और पृष्ठभूमि को घटाया जाता है। (च) चोटियों का निर्धारण मैन्युअल रूप से उपस्थिति और प्रकाशित क्रोमेग्राफिक मोबिलिटीज 5,7के आधार पर कियाजाताहै । (जी)पीक रेंज को सीपीएम मूल्यों द्वारा मैन्युअल रूप से परिभाषित किया जाता है। (ज)चोटियों को एकीकृत और सभी चोटियों के% के रूप में गणना की जाती है। <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig03.jpg" target="_blank">इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC at JoVE.com

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

यहां हम मजबूत एनियन एक्सचेंज[3एच]-मायो-इनोसिटोल-लेबल वाले रोपण की उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी का वर्णन करते हैं जो पौधों में इनोसिटोल पॉलीफॉस्फेट का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील तरीका है।myo

सक्स-एचपीएलसी का उपयोग करके विभिन्न पौधों की प्रजातियों से घुलनशील, रेडियोलेबल इनोसिटोल पॉलीफॉस्फेट का निष्कर्षण और क्वांटिफिकेशन

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

यहां प्रदर्शित प्रोटोकॉल पौधों के इनोसिटोल पॉलीफॉस्फेट के बायोसिंथेसिस को स्पष्ट करने और पौधों के चयापचय और विकास के कुछ पहलुओं में उनकी भूमिका के बारे में सवालों के जवाब देने में मदद कर सकता है। यह विधि अत्यधिक संवेदनशील है क्योंकि इनोसिटोल फॉस्फेट के रेडियोधर्मी लेबल वाले अग्रदूत का उपयोग पौधों में सभी इनोसिटोल फॉस्फेट प्रजातियों का विश्वसनीय पता लगाने की अनुमति देता है। इस विधि का दृश्य प्रदर्शन महत्वपूर्ण है क्योंकि अधिकांश पौधे जीव एचपीएलसी विश्लेषण और आवश्यक सेटअप से अपरिचित हैं।इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम, जैसे इनोसिटोल फॉस्फेट की निकासी, उचित प्रदर्शन के बिना पालन करना मुश्किल है। दो स्वतंत्र एचपीएलसी पंपों से मिलकर एक प्रणाली स्थापित करके शुरू करें, एक बफर ए के लिए और एक बफर बी के लिए दोनों पंपों को कंप्यूटर या मास्टर पंप के माध्यम से एक साथ नियंत्रित करने की आवश्यकता है। दोनों पंपों के लिए एक पिस्टन सील धोने को लागू करें, या तो गुरुत्वाकर्षण बल के माध्यम से या एक तिहाई कम दबाव पंप के माध्यम से ।दोनों पंपों को एक गतिशील मिक्सर से कनेक्ट करें, फिर मिक्सर को एक इंजेक्शन वाल्व से एक नमूना लूप से कनेक्ट करें जिसमें कम से कम एक मिलीलीटर क्षमता है। इंजेक्शन वाल्व को कॉलम और कॉलम को अंश कलेक्टर से जोड़ने के लिए केशिकाओं का उपयोग करें। वर्ग पेट्री ठोस विकास मीडिया से भरा वर्ग पेट्री व्यंजन पर एक पंक्ति में कमल के बीज बोना deionized पानी में 0.8% जीवाणु आगर से मिलकर।बीजों को अंधेरे में चार डिग्री सेल्सियस पर कम से कम तीन दिनों तक स्तरीकरण करने की अनुमति दें। बीजों को ग्रोथ इनक्यूबेटर में रखें। 10 से 20 रोपण को एक 12-अच्छी तरह से स्पष्ट फ्लैट बॉटम सेल कल्चर प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें जो आधी ताकत एमएस नमक समाधान के दो मिलीलीटर से भरा है जो 1% सुक्रोज के साथ पूरक है और पीएच 5.7 में समायोजित है।थाली में 3H मायो-इनोसिटोल के 45 माइक्रोक्यूरी जोड़ें और इसे धीरे से घूमता है। प्लेट को ढक्कन से ढक कर माइक्रोपोरस सर्जिकल टेप से सील कर दें। फिर इसे वापस ग्रोथ इनक्यूबेटर में रखें।लेबलिंग के पांच दिनों के बाद, मीडिया से रोपण निकालें और उन्हें deionized पानी के साथ संक्षेप में धो लें। उन्हें कागज तौलिए के साथ सुखाएं और उन्हें 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, जिससे ट्यूब को ओवरफिल न करना सुनिश्चित हो। स्नैप तरल नाइट्रोजन में ट्यूब फ्रीज और निष्कर्षण तक शून्य से ८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।फ्रीजर से नमूने लें और उपयोग करने के लिए तैयार होने तक उन्हें तरल नाइट्रोजन में रखें। उन्हें एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब मूसल के साथ पीसें जब तक कि वे विगलन शुरू न करें, फिर बर्फ ठंडे निष्कर्षण बफर के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें। जब तक नमूना समरूप न हो जाए और समाधान रंगीन न हो जाए तब तक पीस जारी रखें।18, 000 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूनों को अपकेंद्रित्र । फिर सुपरनेट को एक ताजा 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। निष्कर्षण के लिए उपयोग की जाने वाली ट्यूबों को ठोस रेडियोधर्मी अपशिष्ट माना जाता है और तदनुसार निपटान किए जाने की आवश्यकता होती है।ध्यान से निकालने के लिए बेअसर बफर के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें, जो तुरंत प्रोटीन और बुदबुदाती की वर्षा का कारण होगा। एक मिनट के बाद, नमूने को पीएच पेपर पर एक पिपेट टिप और पिपेट फाइव माइक्रोलीटर के साथ मिलाएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पीएच सात और आठ के बीच है। यदि आवश्यक हो, तो वांछित पीएच तक पहुंचने तक या तो बेअसर बफर या निष्कर्षण बफर की छोटी मात्रा जोड़ें और नमूनों को खुले ढक्कन के साथ कम से कम एक घंटे तक बर्फ पर आराम करने दें।फिर उन्हें 10 मिनट के लिए अपकेंद्री करें और सुपरनेट को एक ताजा 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। अंश कलेक्टर को 96 छोटे प्रस्फुटन शीशियों से लैस करें और प्रत्येक शीशी को एक उपयुक्त प्रस्फुटन कॉकटेल के दो मिलीलीटर के साथ भरें जो कम पीएच बफ़र्स और उच्च अमोनियम फॉस्फेट सांद्रता के साथ संगत है। एचपीएलसी सिस्टम शुरू करें, फिर पिस्टन सील वॉश को सक्रिय करें और पूरे रन के दौरान इसे सक्रिय रखें।मैन्युअल रूप से एक उपयुक्त सिरिंज के साथ नमूना इंजेक्ट करें। पंप और ढाल शुरू करें। जबकि एचपीएलसी रन चल रहा है, नियमित रूप से दबाव की जांच करें।शुरुआती दबाव 18 से 24 बार के आसपास होना चाहिए और धीरे-धीरे 100% बफर बी तक पहुंचने के बाद 50 से 60 बार तक बढ़ना चाहिए। रन के बाद, शीशियों को कसकर बंद करें और मिश्रण करने के लिए प्रस्फुटन कॉकटेल के साथ अंशों को तेजी से हिलाएं। यदि माप के साथ सीधे आगे नहीं बढ़ रहा है, तो शीशियों को अंधेरे में एक ईमानदार स्थिति में रखें।अंशों को मापने के लिए, छोटी शीशियों को फिट करने वाले रैक का उपयोग करके प्रस्फुटन काउंटर रैक में शीशियों को डालें और तरल प्रस्फुटन काउंटर में प्रत्येक शीशी को पांच मिनट के लिए मापें। एक 2D लाइन चार्ट तैयार करें जहां प्रति मिनट मापा गया मायने रखता है या सीपीएम को प्रतिधारण समय के खिलाफ प्लॉट किया जाता है। एक दूसरे के साथ नमूनों की तुलना करने के लिए, प्रत्येक व्यक्ति के नमूने के लिए मिनट 25 से 96 तक प्रत्येक eluted अंश से सीपीएम को संक्षेप में और अन्य नमूनों के कुल सीपीएम द्वारा उस नमूने से कुल सीपीएम को विभाजित करके डेटा को सामान्य करें।कुछ इनोसिटोल पॉलीफॉस्फेट चोटियों के सापेक्ष मात्राकरण करने के लिए और बाद में बार ग्राफ बनाने के लिए जिसमें सांख्यिकीय विश्लेषणों के लिए प्रतिकृतियों का डेटा होता है, एक विशेष सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण जारी रखें जो क्रोमाटोग्राम के चरम क्षेत्रों की गणना कर सकता है। प्रस्फुटन गिनती के बाद ए थैलियाना अर्क से प्राप्त एक पूर्ण इनोसिटोल पॉलीफॉस्फेट स्पेक्ट्रम यहां दिखाया गया है । चोटियों को अच्छी तरह से अलग किया जाता है और विभिन्न आइसोमर्स को सौंपा जा सकता है।जब एक वृद्ध स्तंभ का उपयोग किया जाता है, तो इनोसिटोल हेक्साकिस्फोफफेट की स्पष्ट कमी और इनोसिटोल पायरोफॉस्फेट की अनुपस्थिति दिखाई देती है। सैक्स-एचपीएलसी विश्लेषण एल जैपोनिका रोपण पर भी किया गया था जो अरबीडोप्सिस रोपण के समान परिस्थितियों में उगाए गए थे और लेबल किए गए थे। जबकि संभवतः सभी इनोसिटोल पॉलीफॉस्फेट प्रजातियों और चोटियों कि अरबीडोप्सिस से जाना जाता है देखा जा सकता है, वहां दो प्रजातियों के बीच विशिष्ट इनोसिटोल पॉलीफॉस्फेट आइसोमर की सापेक्ष मात्रा में मतभेद हैं ।यह प्रदर्शित करने के लिए कि नमूनों को निष्कर्षण के तुरंत बाद विश्लेषण नहीं किया जाना है, एक नमूना दो में विभाजित किया गया था और इसके आधे हिस्से का विश्लेषण अगले दिन शून्य से ८० डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के बाद किया गया था । ताजा और जमे हुए नमूनों के सैक्स-एचपीएलसी प्रोफाइल के बीच मतभेद महत्वपूर्ण नहीं थे, यह प्रदर्शित करते हुए कि एक फ्रीज-गल चक्र नमूने को नुकसान नहीं पहुंचाता है और विधि स्वयं प्रजनन योग्य परिणाम उत्पन्न करती है। इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, नमूनों को हमेशा अच्छी तरह से पीसें, जमे हुए और निष्कर्षण बफर के साथ, और एसएसी-एचपीएलसी विश्लेषण के लिए रेडियो-लेबल इनोसिटोल फॉस्फेट की अधिकतम वसूली सुनिश्चित करने के लिए बेअसर होने के बाद तटस्थ पीएच के करीब का लक्ष्य रखें।बाद के उपयोग के लिए एक सैक्स-एचपीएलसी रन से रेडियो-लेबल को शुद्ध करना संभव है, उदाहरण के लिए प्रस्फुटन कॉकटेल के बिना अंशों को इकट्ठा करके और केवल छोटे अलीकोट को मापने के द्वारा पारस्परिक प्रतिक्रियाओं में।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

लेजर Microdissection शाही सेना seq के लिए प्रायोगिक डिजाइन: मक्का पत्तियों के विकास के एक विश्लेषण से सबक

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

एक नमूना से मेटाबोलाइट्स, लिपिड्स और प्रोटीन्स के व्यापक विश्लेषण के लिए एक सरल भिन्नात्मक निष्कर्षण विधि

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA संयंत्र Protoplasts से इंटरैक्टियम कैद

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

अलगाव और Arabidopsis थालियाना से Mitochondria की श्वसन माप

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

घुलनशील और अघुलनशील Huntingtin प्रजातियों के समाधान के लिए भिन्नीकरण

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

पत्ती स्प्रे मास स्पेक्ट्रोमेट्री: एक तेजी से परिवेश Ionization तकनीक सीधे संयंत्र के ऊतकों से चयापचयों का आकलन करने के लिए

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

कैफीन निष्कर्षण, एंजाइमी गतिविधि और संयंत्र सेल सस्पेंशन से कैफीन सिंथेस की जीन अभिव्यक्ति

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

एक मिलीसेकंड समय स्केल पर प्रोटीन परिसरों की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए विट्रो प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण में उपयोग करना

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

प्लांट माइक्रोआरएनए का पता लगाने और क्वांटिफिकेशन के लिए आरएनए दाग विश्लेषण

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

थिओग्लिकोलिक एसिड (टीजीए) का उपयोग करके पौधे बायोमास लिग्निन सामग्री का अनुमान

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...