Name: extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc
Uploaded: 2020-06-26T15:00:00
Duration: 9 min 1 s
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この研究は、ドイツのエクセレンス戦略の下でドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト(DFG、ドイツ研究財団)によって資金提供されました - EXC-2070 - 390732324(フェノロブ)、研究トレーニンググループGRK2064と個々の研究助成金SCHA1274/4-1とSCHA1274 /5-1からG.S.に。また、李シュリュターとブリジット・ウエーベルバッハの技術支援に感謝します。

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、植物抽出物のPP-InsPを含むInsPを定量化する汎用性と高感度な方法を提示し、この方法を確立する方法についての実用的なヒントを提供します。プロトコルは一般的に堅牢ですが、最適でない実行と分析が発生する可能性があります。ほとんどの場合、これらの実行は、強い減少または高リン酸化インスポース、特にPP-InsP種InsP7 およびInsP8の完全な損失によって識別することができる。考えられる理由は、植物材料の微生物汚染と抽出中の内因性植物PP-InsP水化酵素の不十分な不活性化であり、抽出バッファーとすぐに接触しない植物材料の不十分な粉砕および解凍が原因である可能性があります。更なる理由としては、中和緩衝液の不十分または過剰な添加による不正確なpH調整、または単に不十分なサンプル材料が含まれる。後者は、細胞内に非常に低い量で存在することが多いため、PP-InsPを検出することが困難になる可能性があります。ステップ3.5中に過剰なサンプル材料または非効率的な乾燥が発生すると、過塩素酸の希釈が生じる可能性があり、したがって、酵素の不活性化が不十分になり、InsP6 およびPP-InsPの特定の損失を招く可能性があります。このプロトコルで使用される放射性ラベルと同様に植物材料の量は、コストと性能に基づいて最適化されたため、最適な結果を提供するのにまだ十分な最低量に近い。また、カラム樹脂は徐々に分解能を失います。このプロセスの最初の兆候は、HPLCスペクトルにおけるPP-InsPのような高リン酸化InsP種の特定の損失(著者には完全には明らかではない)である。さらにエージングを行うと、InsP6 でさえ、カラム(図1D)によって適切に解決されません。したがって、適切なカラムの使用、およびサンプルの細心の注意を払った取り扱いとHPLCコンポーネントの適切なメンテナンスは、正確な結果を確保するために重要です。
サンプルとランを比較する場合、特に異なる機器(例えば、HPLCシステムとカラム)で生成された場合、または異なる日に、サンプルを互いに正規化し(ステップ7.3で説明)、それらを同じ方法で分析することが重要です。正規化を通してのみ、同じグラフに複数のサンプルを表示することが可能で正確です(図3)。合計 InsP または別の特定の InsP 種に対する個々の InsP の定量化では、相対値のみで絶対値以外の値が示されている限り、正規化する必要はありません。理想的には、InsP プロファイルと定量化の両方が示されています。ただし、同じグラフで 2 回以上の実行を適切に表示できない場合があります。保持時間やバックグラウンドアクティビティのレベルが異なっている場合、定量化されていないSAX-HPLCプロファイルを単独で比較することが困難になる可能性があります。多くのサンプルを比較する必要がある場合も同様です。このような場合には、個別のピーク定量のために追加のソフトウェア(例えば、Origin)を用いたさらなる評価が必要である。
著者らは、ここで説明するプロトコルは最適化可能であり、個々の研究問題に適応する必要があることを認識している。このプロトコルでは、シロイヌナズナズナの抽出物7、1717のために最適化されているが、この方法は汎用性が高く、同様に他の植物種のInsPプロファイルを決定するのに役立ちます。7ここでは、ラベル付け条件の変更を必要としなかったL.ジャポニクスのInsPプロファイルを初めて提示することによって、この可能性を例示します, InsP抽出またはSAX-HPLC実行 (図2)。特に、全体的に似ているが、L.ジャポニクスとシロイヌナズナズのInsPプロファイルの間に違いが観察される。例えば、L.ジャポニカスInsP5[4-OH]またはそのエノミノマー形態InsP5[6-OH]では、InsP 5[1-OH]またはそのエノミオマー形態InsP5 5 5[3-OH]よりも豊富であり、InsP5[1-OH]またはそのエノミオメリック形態Ins5P5P5同様に、培地組成[3H]-イノシトール濃度、植物年齢、環境条件(光と温度)、化学化合物の添加、または他の要因間の植物微生物相互作用の分析の変化をテストし、適応させる必要があると予想しています。
この方法の重要な欠点の1つは、ほとんどの陸上植物の生理的環境を表さない(無菌)液体培養で標識が行われるということです。また、[³H]-ミオ-イノシトールのコストが高いため、培養容器のラベリング液の体積やサイズが一般的に制限され、使用できる植物のサイズも制限される。液体培養における培養は、例えば土壌成長植物の葉を[³H]-ミオ−イノシトールで直接浸潤し、その後ここで説明したプロトコルに従うことによって、先に報告された10を回避できる。
このプロトコルには、TiO2プルダウン、ページまたは質量分析ベースの手法などの代替方法と比較して、いくつかの欠点があります。[3H]-ミオ-イノシトール標識により、放射性標識されたミオ-イノシトールに直接由来するInsP種のみが最終的に検出される。ここで説明する方法は、特定の植物44で同定されているスキュラ-イノシトールおよび他の異性体のような他のイン類性体に対して盲目である。さらに、他の経路から誘導されるmyo-InsPsは、グルコース-6-リン酸の異性化を介したミオ-イノシmyoトール-イノシトール-3-リン酸のデノボ合成によって合成されたものも含め、ミオ-イノシトール-3-リン酸(MIPS)タンパク質によって触媒される。[32P]または[33P]-直交-リン酸は代替ラベルとして使用できるが、その使用は大きな欠点をもたらし、豊富なヌクレオチドおよびその誘導体を含むすべてのリン酸含有分子が標識されることになる。これらの分子もこのプロトコルで抽出し、SAXカラムに結合することができ、これは、個々のInsPピーク5の同定を妨げる高レベルのバックグラウンド活性をもたらす。また、[32P]-または[33P]ラベル付きInsPおよびPP-InsPの定量化は、リン酸塩およびピロリン酸部分のターンオーバーの影響を強く受けることができ、イノシトール種の質量読み出しを報告しない可能性があります。
一方、[3H]-ミオ-イノシトールは、具体的にはミオ−イノシトール含有分子を標識する。インスプ、イノシトール含有脂質、ホスホイノシチン酸塩、およびガラクチノールなどがこの場合に標識される。しかし、脂質は抽出バッファーに不溶であり、ガラクチノールは SAX 列に結合しないため、InsP のみがこのプロトコルで分析されます。
これまでに、TiO2プルダウン/PAGEで決定されたものと比較して[3H]-ミオ-イノシトール標識によって生成された植物InsPプロファイルとの違いは、植物でそのような比較が行われていないので、不明のままである。2動物細胞の最近の研究は、この質問46に対処しました。その作業において、グルコース−6-リン酸に直接誘導されるべき[3H]-ミオ-イノシトール標識によって見えないInsP6のプールを、哺乳動物細胞株のPAGEゲルとSAX-HPLCプロファイルを比較することによって同定された。24時間のリン酸塩飢餓は、TiO2プルダウンを使用して精製されたInsPのPAGEゲルを定量化する際にInsP6の150%の増加をもたらした。同一に処理した[3H]-ミオ-イノシトール標識細胞のSAX-HPLC分析は[3H]-InsP6の15%の増加を示した6だけである。前述のように、InsP5より低い InsP は、ほとんどの場合 PAGE 分析では検出できません。XTROMetric プロトコルが非常に負の電荷を帯びた分子のこのグループを検出するように最適化されていない限り、SAX-HPLC に続く放射標識が選択方法であるように見えます。
もう一つの課題は、SAX-HPLC分析(またはInsP分析のための他の方法)でエアンチオマーを区別することです10,,17.この課題は、キラルセレクターの添加によって取り組むことができる、すなわち、L-アルギニンアミドのようなエナチオピュール化合物は、それぞれエランチオマー分子と相互作用して、10個分離することができるジアステレオマー複合体を形成する。我々の知る限り、このアプローチは、NMR分析10によってエナンチオマーInsP5異性体InsP 5[1-OH]およびInsP5[3-OH]を識別するためにのみ実施されている。 キラルSAX-HPLC分析またはキラルPAGEベースの方法による他のエアンチオマー対の差別またはエノミオマーの成功した差別はまだ報告されておらず、さらに開発されるべきである。リンの入手可能性によるPP-InsPの保存された合成と保存された調節を考慮すると、特にPAGEやMSベースの方法などの非放射性方法は、栄養分析と,共に、作物,17、18、24、25の栄養不足を診断するために設計されたリモートセンシングデータを較17,正するための根拠となる真実の努力に役立つことを想定しています。182425しかし、ここで提示される方法は、現在でもInsP分析のゴールドスタンダードと考えることができ、植物のこれらの興味深いメッセンジャーの新しい機能を発見するのに役立ちます。

約40年前、イノシトールリン酸塩(InsP)は、Ins(1,4,5)P3(InsP3)が動物3細胞1,22におけるCa2+の受容体媒介放出を活性化する第二のメッセンジャーとして同定された後、シグナル1伝達分子として出現した。現在までに、植物ではInsP3受容体(IP3-R)が同定されておらず、植物細胞3におけるInsP3の直接的なシグナル伝達の役割を問う。いずれにせよ、InsP,3は、特定のシグナル経路,,33、4、5、6、7、84,5の調節を含む、いくつかの植物発生プロセスに関与する他のInsPの前駆体として機能する。678例えば、InsP5,9,10,11,3は、リン酸、ミオ-イノシトールおよびカチオンの主要な供給源を表す「フィチン酸」とも呼ばれるInsP6にさらにリン酸化することができ、病原体に対する植物防御において重要な役割を果たしていることが示された。6
イノシトールピロリン酸塩(PP-InsPs)は、動物細胞、アメーバおよび酵母において最初に同定された少なくとも1つの高エネルギージホスホ結合を含むInsPのクラスであり、そこでは、種々の細胞プロセス13、14、1514,15において重要な役割を果たす。13,植物,,16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26のPP-InsPに関する精力的な作業にもかかわらず、これらの分子の生物学的機能と異性体の同一性は依然としてほとんど謎のままです。16,17,18,1920,21,22,23,242526モデル植物のシロイヌナズナにおいて、細胞InsP8は、ASK1-COI1-JAZ受容体複合体17によるInsP8および活性ジャスモネートの一致検出を介して昆虫性草食動物および壊死性真菌に対する防御を調節することを提案した。さらに、エネルギー恒常性および栄養センシングにおけるInsP8および他のPP-InsPの役割、ならびにリン酸恒常性の役割が17、23、24、25、26に提案されている。17,23,24,25,26
採用されている生体システムに関係なく、InsPを研究する際の方法論的課題の1つは、これらの分子の信頼性の高い検出と正確な定量化でした。質量分析ベースの方法は、細胞抽出物からPP-InsPを含むInsPを検出するために使用されてきました。しかし、これらの研究は、異性体26,27,27を区別することができなかった。InsP を分析する別のアプローチは、TiO2ビーズを使用した細胞ライセートからの InsP のプルダウンを採用し、続いて溶出したインスプのポリアクリルアミドゲル電気泳動 (PAGE) を採用します。InsP は、トルイジン ブルー,または DAPI24、28、29のいずれかによって染色できます。しかし、この方法を用いて植物抽出物からInsP5より低いInsPを確実に検出することは今のところ不可能である。近年、InsPの核磁気共鳴(NMR)分析に[13C]-ミノシトールを用いた方法が、強力アニオン交換高速液体クロマトグラフィー(SAX-HPLC)30の代替手段として発表された30。この技術は、SAX-HPLCと比較して同様の感度を達成し、5-InsP7の検出を可能にし、細胞抽出物からの異なる非非異性体InsP5異性体の識別を可能にすることが報告されている。しかし、NMRベースの方法の実施は、化学的に合成され、市販されていない[13C]-ミオ-イノシトールを必要とする。したがって、ほとんどの場合に採用される方法は、サンプルに[3H]-ミオ-イノシトールを用いて放射性標識し、続いてSAX-HPLC31、32、3332,33を用いる。31この技術は、放射性ミオイノシトールを植物に取り込み、専用の細胞キナーゼとホスファターゼの組み合わせ活性によって異なるInsPへの変換に基づいています。
[33H]標識インスプは、次いで、SAX-HPLCを使用して酸抽出および分画化されます。負の電荷のため、InsPsはSAX-HPLCカラムの正に帯電した定常相と強く相互作用し、リン酸濃度を増加させるバッファー勾配で溶出して、カラムからInsPを上回ることができます。溶出時間は、このように分離されるInsP種の電荷と幾何学に依存する。キラル列がない場合、非異性体だけがこのプロトコルで分離することができます。ただし、放射ラベル規格は、特定のInsPピークの異性素性を割り当てる場合に使用できます。様々な研究所が、(バイオ)化学法でラベル付けされた非標識規格を生成したり、様々な細胞や生物から精製したりするための様々な取り組みは、特定の,InsP種にピークを割り当てるのに役立ち、また、個々のInsP種,55、7、21、34、35、36、37、38、39、40、4137,2142の43異性同一性を絞り込むのに役立ちました。34,35,36,37,38,39,40,41また、植物におけるPP-InsPの形成に至る酵素経路の最近の解明、ならびに特異的な1-フィターゼ活性を有する細菌型IIIエフェクターの発見は、これらの分析10、17、18、22、23に有用10,17,18,22,23な標準を生成する方法についての情報を提供する。
得られた分率は、トリチウム(3H)のβ崩壊による液体シンチレーションカウンターで測定することができる。標識時間が増加すると、定常同位体平衡に達し、その後、取得したInsPプロファイルはプラント31のInsPステータスを表す必要がある。他の利用可能な技術と比較して、このプロトコルの主な利点は、InsP用の直接前駆体の使用と放射性信号の測定によって達成される高感度です。
[3 H]-ミノシトール標識3植物または他の生物から抽出されたサンプルのSAX-HPLCは、一般的に、InsPの低い種からPP-InsPに至るまでのInsPの検出と定量化に使用され、InsPsの代謝、機能および作用様式をよりよく理解するための貴重なツールを表す。これまでのところ、この方法は、より低いInsP種に特別な関心を持つ研究者にとっても最も適切な選択肢です。ここで説明するプロトコルが構築されるこの手順の基本は、以前に77、21、31、34、,31,34植物由来のInsP、特にPP-InsPの分析に合わせた詳細なプロトコルがまだ欠落している。,以前の出版物は、低い豊富なPP-InsPを確実に検出する困難を報告しました。 特にInsP8は、植物材料の量が比較的少ない、植物材料の量が比較的少ない[3H]-ミオ-イノシトール(>20 Ci/mmol)、過塩素酸に基づいていないか、1Mより集中していない抽出バッファの使用、異なる中和緩衝液、ならびに3-検出器の[H-3]の検出因子に起因する。これらの研究と比較して、ここで提示されるプロトコルは、PP-InsPs,7、21、3421の信頼性の高い検出のために設計されています。734
ここでは、設備の設定から植物栽培とラベリング、InsP抽出、SAX-HPLC実行自体に至る詳細なワークフローを紹介します。この方法はモデル植物 A.タリアナに最適化されたが、モデルマメ科の最初の報告されたInsPプロファイルでここに示すように、他の植物種を研究するために容易に修正することができる 。異なる植物種の使用には何らかの最適化が必要かもしれませんが、それらは軽微であると想定し、このプロトコルは植物InsPのさらなる研究の出発点になります。可能な最適化を容易にするために、我々は、変更が可能なプロトコル内のすべてのステップ、および最初にメソッドを確立する際に困難な可能性のあるすべての重要なステップを示す。さらに、この方法で得られたデータを使用して特定のInsPを定量化する方法と、異なるサンプルを分析して比較する方法を報告します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>model: 5430 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diammonium hydrogen phosphate, &#8805;97 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0268.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, &#8805;99 %, p.a., ACS</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>LAMBDA Instruments GmbH</td>
			<td>model: OMNICOLL single channel collector</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth incubator</td>
			<td>poly klima GmbH</td>
			<td>model: PK 520-LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC pumps</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector for HPLC</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>model: Rheodyne 9725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol, myo-[1,2-3H(N)]</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals Inc.</td>
			<td>ART 0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>University, Chemistry Department</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>model: TRI-CARB 2900TR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pestle</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>CXH7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 &#181;m pore size, 47 mm circle</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>10401770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer for HPLC</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: M 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium, salt mixture</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro software</td>
			<td>OriginLab Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthophosphoric acid, &#8805;85 %, p.a., ISO</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>6366.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partisphere 5 &#181;m SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4621-0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile</td>
			<td>Greiner Bio One International GmbH</td>
			<td>688161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-indicator paper pH 5.5 - 9.0, Neutralit</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>109564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>P743.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>57648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL</td>
			<td>Simport Scientific Inc.</td>
			<td>S207-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench</td>
			<td>LaboGene</td>
			<td>model: ScanLaf MARS 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, &#8805;99,5 %, p.a.</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>6013599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure deionized water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrenchless WVS End Fitting Kit</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4631-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc

イノシトールのリン酸エステルは、イノシトールリン酸塩(InsPs)とも呼ばれますが、植物生理学において重要な役割を果たしている細胞レギュレータのクラスです。その負の電荷、低い存在量、加水分解活動への感受性が低いため、これらの分子の検出と定量は困難です。これは特に、イノシトールピロリン酸塩(PP-InsPs)と呼ぶ「高エネルギー」ジホスホ結合を含む高リン酸化形態の場合である。その高感度により、強いアニオン交換高速液体クロマトグラフィー(SAX-HPLC)を標識植物の[3H]-ミオ-イノシトールは、現在これらの分子を分析する選択の方法です。植物苗の放射標識に[3H]-ミオ-イノシトールを用いることで、いくつかの非異性体を含む様々なInsP種を検出し、高感度で識別することができる。ここでは、適切なSAX-HPLCシステムの設定について説明し、植物栽培、放射性標識およびInsP抽出からSAX-HPLCの実行とその後のデータ分析への完全なワークフローを説明します。ここで提示されるプロトコルは、いくつかの非異性体およびPP-InsP、InsP7およびInsP8を含む様々なInsP種の識別および定量化を可能にし、他の植物種に容易に適応することができる。例として、シロイヌナズナおよびロータスジャポニクス苗のSAX-HPLC分析が行われ、完全なInsPプロファイルが提示され、議論される。ここで説明する方法は、植物におけるInsPの生物学的役割をよりよく理解するための有望なツールを表しています。

ここに示す結果は、技術的および生物学的レベルの変動に応じて得られる可能性のある結果を示すことを目的としています。最初の例は、新しいカラムと熟成カラム(図1)と新鮮なサンプルと保存されたサンプル(図3)を用いた分析で例示され、2つ目はA.thaliana(図1、図3)およびL.japonicus(図2)からの抽出物を評価することによって行う。
最適なSAX-HPLCランは、シンチレーションカウント後にA.タリアナ抽出物から得られた完全なイノシトールポリリン酸スペクトルを示す図1A\u2012Cに描かれています。ピークはうまく分離されており、前の5,,7で説明したクロマトグラフィーの移動に基づいて異性体(またはエアンチオマーペア)に割り当てることができます。
図2は、シロイヌナズナシの苗と同じ条件で成長し、標識されたL.ジャポニクス苗のSAX-HPLC分析の代表的な結果を示しています。おそらく、シロイヌナズナから知られているすべてのInsP種およびピークが見られるが、両方の種のプロファイルを比較する場合、特定のInsP異性体の相対的な量(例えば、異性体間の比率)に関して大きな違いがある。例えば、ロータス抽出物は、さらなる調査のための余地を残すシロイヌナプシスと比較して、増加したInsP3c、InsP4b、InsP5bおよび減少したInsP3a、InsP4a、InsP5aおよびInsP5cを示した。5c図2Dは、シロイヌナズナとロータスの間のInsP異性体間の異なる比率を示しています。
図 3 は、抽出後に分割されたサンプルの 2 つの InsP プロファイルを示しています。前半は、1日後に、-80°Cで保存した後、すぐに分析を行った。 サンプル間にはわずかな違い ( 図 3A\u2012C、図 3Dの黒線と赤線) しか見られないことに注意してください。これは、1 つのフリーズ解凍サイクルがサンプルに害を与えないこと、およびメソッド自体が再現可能な結果を生成することを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig01.jpg"> 図1:このプロトコルで実行されたSAX-HPLC分析が成功し、失敗した典型的なInsPプロファイル。( \u2012C)A17日前の野生型のSAX-HPLCプロファイル(Col-0)[3H]-ミオ-イノシトールで3放射標識されたシロイヌナズナシス苗。グローバルInsP抽出およびSAX-HPLC実行は同日に行った。(A) 完全なスペクトル;(B, C)A に示すプロファイルのズームイン。すべての可視ピークがハイライト表示され、対応する InsP 種に割り当てられます。公開クロマトグラフィーモビリティ55、77に基づいて、InsP4aはイン(1,4,5,6)P 4またはIns(3,4,5,6)P4を表す可能性が高く、InsP5aはInsP5[2-OH]を表し、 InsP5bはInsP5[4-OH]またはそのエノミノマー形態InsP5[6-OH]を表し、InsP5cはInsP 5[1-OH]またはそのエノミノマー形態InsP4 5[3-OH]を表す。5InsP3a-c、InsP4b、InsP7、およびInsP8の異性体性は不明です。パネル (D) は、同じ成長した植物の SAX-HPLC プロファイルを示しますが、熟成カラムを使用します (>40 ラン)。他のInsP種と比較してInsP6の明確な減少とPP-InsPの欠如が見られます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2.jpg"> 図2:L.ジャポニクス植物の代表的なInsPプロファイル。SAX-HPLCプロファイル(17日前の野生型(岐阜)のX線型のC(A\u2012C)は、ラジオ標識[3H]-ミオ-イノシトールで放射状のジャポニクス苗を作成した。(A) 完全なスペクトル;(B, C)A に示すプロファイルのズームイン。すべての可視ピークがハイライト表示され、対応する InsP 種に割り当てられます。公開されたクロマトグラフィーモビリティ55、77に基づいて、InsP4aはIns(1,4,5,6)P 4またはIns(3,4,5,6)P4を表す可能性が高く、InsP5bはInsP 5 [4-OH]またはそのエンランチオマー形式InsP45[6-OH]を表す可能性が高い、 InsP5cは、インスポー 5 [1-OH] またはそのエノミオマー形式 InsP5 5 [3-OH] を表す可能性があります。InsP3a-c、InsP4b、InsP7、およびInsP8の異性体性は不明です。(D) A. タリアナの個々の InsP 種 (溶出による全活動の割合での割合 25\u201296) とL. japonicus (図 2A–Cからのデータ) の比較。A‒C<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig03.jpg"> 図3:SAX-HPLC分析の再現性を示す分割サンプルのInsPプロファイル。( \u2012C)A17日前の野生型のSAX-HPLCプロファイル(Col-0)[3H]-ミオ-イノシトールで3放射標識されたシロイヌナズナシス苗。実行前に、サンプルを分割し、1つの半分をすぐに実行し、残りの半分は-80 °Cで保存した後、1日後に(A)完全なスペクトル;(B, C)A に示すプロファイルのズームイン。すべての可視ピークがハイライト表示され、対応する InsP 種に割り当てられます。公開クロマトグラフィーモビリティ55、77に基づいて、InsP4aはイン(1,4,5,6)P 4またはIns(3,4,5,6)P4を表す可能性が高く、InsP5aはInsP5[2-OH]を表し、 InsP5aはInsP5[2-OH]を表し、InsP5bはInsP5[4-OH]またはそのエノミオマー形態InsP5[6-OH]を表し、InsP5cはInsP 5[1-OH]またはそのエンミノマー形態InsP4 5[3-OH]を表す。5InsP3a-c、InsP4b、InsP7、およびInsP8の異性体性は不明です。パネルDは、両方の実行の InsP6と PP-InsP InsP7と InsP8の定量化を示しています。値は金額を表します (%)すべての InsP に対するそれぞれの InsP 種 (溶出による全活性 25-96)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:軽いシンチレーションカウンターを用いた液体シンチレーションカウントのソフトウェア設定。 ソフトウェアバージョンを示すスクリーンショットと、このプロトコルで実行される[3H]サンプルのシンチレーションカウントに使用される設定が描かれています。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig01.jpg" target="_blank">こちらをダウンロードしてください。</a>
補足図2:データの正規化の代表例。 ワークシートのスクリーンショットは、SAX-HPLC の実行を互いに正規化するために使用されるすべてのステップと数式を示しています。単純化のために、サンプルの分数 25 ~ 35 分のみが示されます。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig02.jpg" target="_blank">こちらをダウンロードしてください。</a>
補足図3:解析ソフトを用いたピーク判定、背景の減算、統合(A)SAX-HPLC分析のデータがソフトウェアにロードされ(分28~96分)、ピークアナライザツールが選択されます。(B\u2012E)ベースラインは、個々のピークと背景の間のポイントを設定することによって手動で定義されます。(F)ピークは、外観と公開クロマトグラフィーモビリティ55、7に基づいて手動で決定されます。(G) ピーク範囲は cpm 値で手動で定義されます。(H) ピークは統合され、すべてのピークの % として計算されます。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig03.jpg" target="_blank">こちらをダウンロードしてください。</a>

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Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

ここでは、植物中のイノシトールポリリン酸塩を検出し定量する高感度の方法である[3H]-ミオ-イノシトール標識苗の強力なアニオン交換高速液体クロマトグラフィーについて述べた。

SAX-HPLCを用いた異種植物由来の可溶性、放射性標識イノシトールポリリン酸塩の抽出と定量化

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

ここで示したプロトコルは、植物のイノシトールポリリン酸の生合成を解明し、植物代謝と開発の特定の側面におけるその役割に関する質問に答える助けになります。この方法は、イノシトールリン酸塩の放射性標識前駆体の使用が植物のすべてのイノシトールリン酸塩種の信頼性の高い検出を可能にするので、非常に敏感です。この方法の視覚的なデモンストレーションは、ほとんどの植物生物学者がHPLC分析と必要なセットアップに精通していないため、重要です。さらに、このプロトコルの重要なステップは、イノシトールリン酸塩の抽出と同様に、適切なデモンストレーションなしに従うのは困難である。まず、バッファA用とバッファB用の2つの独立したHPLCポンプで構成されるシステムを設定します。両方のポンプに対して、重力を介して、または第3の低圧ポンプを介して、ピストンシール洗浄を実施します。両方のポンプをダイナミックミキサーに接続し、少なくとも1ミリリットルの容量を持つサンプルループを備えた注入バルブにミキサーを接続します。毛細血管を使用して、射出バルブを柱に接続し、列を分数コレクターに接続します。純正水に0.8%の細菌学的寒天からなる固体成長培地で満たされた正方形のペトリ料理に蓮の種を一列にまきます。種子が暗闇の中で摂氏4度で少なくとも3日間層化することを許可します。成長インキュベーターに種子を入れます。1%スクロースを補充し、pH 5.7に調整された2ミリリットルの半強度MS塩溶液で満たされた12ウェルクリアフラットボトムセル培養プレートの1つの井戸に10〜20の苗を移します。プレートに3Hミオイノシトールの45マイクロキュリーを加え、穏やかに渦巻きます。蓋でプレートを覆い、マイクロポーラス手術テープで密封します。その後、成長インキュベーターに戻します。5日間のラベリングの後、媒体から苗を取り除き、脱イオン水で短時間洗います。ペーパータオルで乾燥させ、1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移し、チューブを過剰に充填しないようにします。液体窒素でチューブを凍結スナップし、抽出するまでマイナス80°Cで保存します。冷凍庫からサンプルを取り出し、使用する準備ができるまで液体窒素に保管してください。解凍を開始するまでマイクロ遠心分離チューブ害虫でそれらを粉砕し、氷冷抽出バッファーの500マイクロリットルを追加します。サンプルが均質化され、溶液が着色されるまで粉砕を続けます。サンプルを18,000倍Gと摂氏4度で10分間遠心分離します。その後、上清を新鮮な1.5ミリリットルのチューブに移します。抽出に使用されるチューブは、固体放射性廃棄物とみなされ、それに応じて処分する必要があります。300マイクロリットルの中和バッファーを抽出物に慎重に加え、タンパク質の沈殿やバブリングをすぐに引き起こします。1分後、サンプルをピペットチップとピペット5マイクロリットルをpH紙に混ぜて、pHが7〜8の間であることを確認します。必要に応じて、目的のpHに達するまで少量の中和バッファーまたは抽出バッファーを追加し、サンプルを開いた蓋で少なくとも1時間氷の上に置きます。その後、10分間遠心分離し、上清を新鮮な1.5ミリリットルチューブに移します。96の小さなシンチレーションバイアルを分数コレクターに装備し、低pHバッファーと高リン酸アンモニウム濃度と互換性のある適切なシンチレーションカクテルの2ミリリットルで各バイアルを充填します。HPLCシステムを起動し、ピストンシール洗浄を有効にし、全体の実行中にアクティブに保ちます。サンプルに適した注射器を手動で注入します。ポンプと勾配を開始します。HPLCの実行が進行中である間、圧力を定期的に確認してください。開始圧力は約18〜24バーであり、100%バッファBに達するとゆっくりと50〜60バールに上昇する必要があります。実行後、バイアルをしっかりと閉じ、シンチレーションカクテルで分数を激しく振って混ぜます。測定を直接進まない場合は、バイアルを暗闇の中で直立した位置に保ちます。分数を測定するには、小さなバイアルに収まるラックを使用してシンチレーションカウンターラックにバイアルを挿入し、液体シンチレーションカウンターで各バイアルを5分間測定します。2D 折れ線グラフを用意し、1 分あたりの計測数または CPM が保持時間に対してプロットされます。サンプルを互いに比較するには、個々のサンプルごとに分 25 から 96 までの各溶出分数から CPM を合計し、そのサンプルの合計 CPM を他のサンプルの合計 CPM で除算して、データを正規化します。特定のイノシトールポリリン酸ピークの相対的な定量を実行し、その後、統計分析のための複製のデータを含む棒グラフを作成するには、クロマトグラムのピーク領域を計算できる特殊なソフトウェアで分析を継続します。シンチレーションカウント後のA.thaliana抽出物から得られた完全なイノシトールポリリン酸スペクトルをここに示す。ピークはうまく分離されており、異性体に割り当てることができます。老朽化したカラムを使用すると、イノシトール六月リン酸の明確な還元とイノシトールピロリン酸の欠如が見られます。SAX-HPLC分析は、シロイヌナズナの苗と同じ条件で成長し、標識されたL.japonica苗にも対して行われました。おそらくすべてのイノシトールポリリン酸種およびシロイヌナズナシスから知られているピークが見られるが、2つの種間の特定イノシトールポリリン酸異性体の相対的な量に違いがある。抽出直後にサンプルを分析する必要がないことを実証するために、1つのサンプルを2回と半分に分割し、次の日にマイナス80°Cで保存した後に分析した。新鮮なサンプルと凍結したサンプルのSAX-HPLCプロファイルの違いは有意ではなく、1つの凍結融解サイクルがサンプルに害を与えるものではなく、方法自体が再現可能な結果を生成することを実証しました。このプロトコルを試みるとき、常にサンプルを十分に、凍結し、抽出バッファーと粉砕し、SAX-HPLC分析のための放射標識イノシトールリン酸の最大の回復を確実にするために中和後の中性pHに近い目的を目指して下さる。SAX-HPLCランから後で使用するために、例えばシンチレーションカクテルなしで分数を収集し、小さなアリコートのみを測定することによって、相互反応で、無線標識を精製することが可能です。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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レーザーマイクロダイセクションRNA-のSeqのための実験デザイン：トウモロコシ葉の開発の分析からの教訓

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

単一サンプルからの代謝産物、脂質およびタンパク質の包括的分析のための単純分別抽出法

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

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分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

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Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

水溶性と不溶性の Huntingtin 種の解像度の分別

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

リーフ スプレー質量分析: 植物組織由来の代謝産物を直接評価するの急速な周囲のイオン化法

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

カフェイン抽出、酵素活性、植物細胞懸濁液からのカフェイン合成酵素の遺伝子発現

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

ミリ秒時間スケールでのタンパク質複合体のダイナミクスを調べるため体外蛍光共鳴エネルギー移動の使用

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RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

植物マイクロRNAの検出と定量のためのRNAブロット分析

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Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

チオグリコール酸(TGA)を用いた植物バイオマスリグニン含量の推定

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...