Name: extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc
Uploaded: 2020-06-26T15:00:00
Duration: 9 min 1 s
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이 작품은 독일의 우수 전략 - EXC-2070 – 390732324 (페노롭), 연구 교육 그룹 GRK2064 및 개별 연구 보조금 SCHA1274/4-1 및 SCHA1274/SCHA1274/SCHA1274/SCHA1274/SCHA1274/SCHA1274/SCHA1274/SCHA1274/SCHA1274/SCHA1274/5.1.에 의해 지원되었다. 우리는 또한 기술 지원을 리 슐뤼터와 브리기테 우에베르바흐에게 감사드립니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기서 는 식물 추출물에 PP-InsP를 포함한 InsP를 정량화하고이 방법을 확립하는 방법에 대한 실용적인 팁을 제공하는 다재다능하고 민감한 방법을 제시합니다. 프로토콜은 일반적으로 강력하더라도 최적이 아닌 실행 및 분석이 발생할 수 있습니다. 대부분의 경우, 이러한 실행은 높은 인광염, 특히 PP-InsP 종 InsP7 및 InsP8의강력한 감소 또는 완전한 손실에 의해 식별될 수 있다. 가능한 이유는 식물 물질의 미생물 오염및 추출 버퍼와 즉시 접촉하지 않을 식물 재료의 부족한 분쇄 및 해동으로 인해 추출 하는 동안 내인성 식물 PP-InsP 하이드로라의 불충분 한 비활성화 될 수 있습니다. 또 다른 이유로는 중화 버퍼의 불충분하거나 과도한 첨가에 의한 부정확한 pH 조정, 또는 단순히 불충분한 샘플 재료가 포함됩니다. 후자는 PP-InsP를 검출하는 것을 어렵게 만들 수 있습니다, 그 세포에 있는 아주 낮은 양에 수시로 존재하기 때문에. 3.5단계에서 시료 재료의 과잉 또는 비효율적인 건조는 과염소산의 희석을 유발할 수 있으므로 효소 비활성화가 불충분하고 InsP6 및 PP-InsPs의 특정 손실을 초래할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 식물 재료의 양과 무선 라벨은 비용과 성능에 따라 최적화되었으며, 따라서 최적의 결과를 제공하기에 충분한 최저 양에 가깝습니다. 또한 컬럼 수지는 해상도 용량을 점차 느슨하게 합니다. 이 과정의 첫 징후는 (저자에게 완전히 명확하지 않은 이유로) HPLC 스펙트럼의 PP-InsPs와 같은 더 높은 인인SP 종의 특정 손실입니다. 추가 노화와 함께, 심지어 InsP6은 열(그림 1D)에의해 제대로 해결되지 않습니다. 따라서 적절한 컬럼의 사용과 샘플링의 세심한 처리 및 HPLC 구성 요소의 적절한 유지 보수는 정확한 결과를 보장하는 데 매우 중요합니다.
특히 다른 장비(예: HPLC 시스템 및 열)로 생성되거나 다른 날에 시료를 서로 정규화하고(7.3단계에서 설명한 대로)로 생성되는 경우 샘플과 실행을 비교할 때 동일한 방식으로 샘플을 분석하는 것이 중요합니다. 정규화를 통해서만 동일한그래프(그림 3)에여러 샘플을 표시할 수 있고 정확합니다. 총 InsP 또는 다른 특정 InsP 종에 비해 개별 InsP의 정량화의 경우 상대값만 표시되고 절대 값이 표시되지 않는 한 정규화할 필요가 없습니다. 이상적으로는 InsP 프로파일과 정량화가 모두 표시됩니다. 그러나 경우에 따라 동일한 그래프에서 두 개 이상의 실행을 적절하게 표시할 수 없습니다. 서로 다른 보존 시간 또는 다양한 배경 활동 수준으로 인해 정량화되지 않은 SAX-HPLC 프로파일을 단독으로 비교하기가 어려울 수 있습니다. 많은 샘플을 비교해야 할 때도 마찬가지입니다. 이러한 경우 개별 피크 정량화에 대한 추가 소프트웨어(예: Origin)를 사용하여 추가 평가가 필요합니다.
저자는 여기에 설명된 프로토콜이 최적화될 수 있고 각 개별 연구 질문에 적응해야 한다는 것을 알고 있습니다. 이 프로토콜에서 애기장염 추출물7,,17에 최적화되어 있지만, 이 방법은 다재다능하며 다른 식물 종의 InsP 프로파일을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기서 우리는 라벨링 조건, InsP 추출 또는 SAX-HPLC 실행(그림 2)의수정이 필요하지 않은 L. japonicus에대한 InsP 프로파일을 처음으로 제시함으로써 이러한 가능성을 예시합니다. 특히, 전반적으로 유사하면서도 L. japonicus와 Arabidopsis InsP 프로필 사이에 차이가 관찰됩니다. 예를 들어, L. japonicus InsP5 [4-OH] 또는 그 내포성 형태 InsP5 [6-OH]는 InsP5 [1-OH] 또는 그 내항형 인P5 [3-OH]보다 더 풍부하며, 여기서 InsP5 [1-OH] 또는 그 내란성형태인 5P-5P.에 있다.5 Arabidopsis5 마찬가지로, 우리는 미디어 조성물의 변화,[3H]-myo-이노시톨 농도, 식물 연령, 환경 조건(예를 들어, 빛 및 온도), 화학 화합물의 첨가 또는 다른 요인들 간의 식물-미생물 상호 작용의 분석, 테스트 및 적응이 필요할 수 있습니다.myo
고려해야 할 이 방법의 한 가지 중요한 단점은 라벨링이 대부분의 육상 식물에 대한 생리적 환경을 나타내지 않는 (멸균) 액체 배양에서 수행된다는 것입니다. 또한,[³H]-myo-이노시톨의높은 비용으로 인해 라벨링 용액의 부피와 배양 용기의 크기가 일반적으로 제한되어 있어 사용될 수 있는 식물의 크기도 제한한다. 액체 배양에서의 재배는 토양 재배 식물의 예를 들어 직접 침투하여 [³H]-myo-이노시톨과 그 이후에 여기에 설명된 프로토콜을 따르므로, 이전에 보고된10과같이 피할 수 있다.myo
TiO2 풀다운과 같은 대체 방법에 비해 이 프로토콜의 몇 가지 단점이 있으며 PAGE 또는 질량 분석 기반 기술이 뒤따릅니다. [3H]-myo-이노시톨 라벨링으로 인해, 방사성표지근에서 직접 유래한 InsP 종만이 결국 검출될 것이다.3myo myo 여기에 설명된 방법은 특정식물(44)에서확인된 실로-이노시톨 및 기타 이좀러와 같은 다른 Ins isomers에 눈이 멀다. scyllo 더욱이, 다른 경로로부터 유래된45myo-InsPs는 myo포도당-6-인산염의 이소성화를 통해 미오-이노시톨-3-인산염의 드노보 합성에 의해 합성된 것을 포함하여 제외될 것이다, 묘 -이노시톨-3-포산염시네페이트 시파테에 의해 촉매화된다. myo myo [32 P] 또는[33P]-오르토-인산염이 대체 라벨로 사용될 수 있지만, 풍부한 뉴클레오티드 및 그 유도체를 포함한 모든 인산염 함유 분자가 표지될 것이기 때문에 이들의 사용은 큰 단점을 야기한다.33ortho 이러한 분자는 또한 이 프로토콜로 추출하고 SAX 컬럼에 결합하여 개별 InsP 피크5의식별을 방해하는 높은 수준의 배경 활동을 초래할 수 있습니다. 또한,[32P]-또는[33P] -라벨Inps 및 PP-InsP의 정량화는 인산염 및 파이로포스페이트 잡화 회전율에 의해 강하게 영향을 받을 수 있으며 이노시톨 종에 대한 대량 판독을 보고하지 않을 수 있다.
한편,【3H】-myo-이노시톨은 특별히 묘-이노시톨함유 분자를 라벨링한다.myo InsPs, 이노시톨 함유 지질, 인포이노시티드 및 갈락티놀은 이 경우 표지되어 있습니다. 그러나 지질이 추출 버퍼에서 불용성이고 갈락티놀이 SAX 열에 결합되지 않기 때문에 InsPs만 이 프로토콜로 분석됩니다.
지금까지,2 [3H]-Myo-이노시톨3라벨링에myo의해 생성된 식물 InsP 프로파일의 차이는 TiO 2 풀다운/PAGE에 의해 결정된 것과 비교하여 식물에서 수행되지 않았기 때문에 알려지지 않은 채로 남아 있다. 동물 세포에 있는 최근 연구 결과는 이 질문46를해결했습니다. 그 일에서,[3H]-이노시톨라벨링에 의해 보이지 않는 InsP6의 풀은, 따라서 포도당-6-인산염에서 직접 파생되어야 한다, 포유동물 세포주의 PAGE 젤과 SAX-HPLC 프로파일을 비교하여 확인되었다. 24h의 인산염 기아는 TiO2 풀다운을 사용하여 정제된 InsPs의 PAGE 젤을 정량화할 때 InsP6의 150% 증가를 초래하였다. [3H]-이노시톨3표지 세포의myoSAX-HPLC 분석은 동일하게 처리된[3H]-InsP6의15% 증가를 보였다. 앞서 언급했듯이 InsP5보다 낮은 InsP는 대부분의 경우 PAGE 분석을 통해 감지할 수 없습니다. SAX-HPLC 다음에 이어 방사성 라벨링은 질량 분광 프로토콜이 매우 음전하 분자의 이 그룹을 검출하도록 최적화되지 않는 한 선택되는 방법인 것으로 보입니다.
또 다른 과제는 SAX-HPLC 분석(또는 InsP 분석을 위한 다른 방법)에서 enantiomers를구별하는 것입니다(또는InsP 분석을 위한 다른 방법)10,17. 이러한 과제는 각각의 상란성 분자와 상호 작용하는 L-아르기닌 아마이드와 같은 키랄 셀렉터, 즉 엔안티오퓨어 화합물을 첨가하여10을분리할 수 있는 다이아스테레오메릭 복합체를 형성함으로써 해결할 수 있다. 우리의 지식에, 이 방법은 NMR 분석10에의해 enantiomeric InsP5 isomers InsP5 [1-OH] 및 InsP5 [3-OH]를 구별하기 위해 구현되었습니다. 다른 내포성 쌍의 차별 또는 chiral SAX-HPLC 분석 또는 키랄 페이지 기반 방법에 의한 enantiomers의 성공적인 차별은 아직 보고되지 않았으며 더 발전되어야합니다. 인 가용성에 의한 PP-InsPs의 보존된 합성 및 보존된 규제를 고려하여, 특히 페이지 나 MS 기반 방법과 같은 비방사성 방법, 영양 분석과 함께 작물17,,18,,24,25의영양 결핍을 진단하도록 설계된 원격 감지 데이터를 교정하기 위한 지상 진실 노력에 도움이 될 것으로구상됩니다. 그러나, 여기에 제시 된 방법은 현재 여전히 InsP 분석을위한 금 본위제로 간주 될 수 있으며 식물에서 이러한 흥미로운 메신저의 새로운 기능을 발견하는 데 도움이 될 것입니다.

거의 4년 전, 이노시톨 인산염(InsPs)은 Ins(1,4,5)P 3(InsP3)가 동물세포1,,2에서Ca2+의 수용체 매개 방출을 활성화하는 두 번째 메신저로 확인된 후 신호 분자로 나타났다.3 현재까지, 식물 세포3에서 InsP 3 수용체(IP3-R)가 확인되지 않았으며, 이는 식물 세포3에서InsP3에 대한 직접적인 신호 역할을 질문한다. 에 관계없이 InsP,3은 특정 신호 경로,,,3,4,5,6,7,8의규제를 포함하여 여러 식물 개발 과정에 관여하는 다른 InsP의 선구자역할을 한다.7 예를 들어, InsP3는 인산염, 묘-이노시톨 및 양이온의주요 원천을 나타내는 "식물성 산"으로 도알려진 InsP6에더 인포로울 수 있으며 병원균, mRNA 수출 및 인산성 본성5,,9,,10,,11, 112에,12대한 식물 방어에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다.
이노시톨 파이로포스페이트(PP-InsPs)는 동물세포, 아메바 및 효모에서 처음 확인된 적어도 하나의 고에너지 디-인산 결합을 포함하는 InsPs의 클래스로, 다양한 세포 공정에서 중요한 역할을 한다13,,14,,15. ,식물16,17,,,,,19,,20,21,1922,23,,24,,,25,,26,이러한 분자의 생물학적 기능 및 isomer 정체성에서 PP-InsPs에 대한 정액 작용에도 불구하고 여전히 대부분 수수께끼로 남아 있습니다. 모델 식물에서 아기독시스 탈리아나,셀룰러 InsP8은 ASK1-COI1-JAZ 수용체 복합체(17)에 의한 InsP8 및 활성 자스모네이트의 우연의17검출을 통해 곤충 초식동물 및 괴사성 균류에 대한 방어를 조절하도록 제안되었다. 또한, InsP8 및 기타 PP-InsP의 에너지 항상성 및 영양 감지뿐만 아니라 인산염 항상성17,23,24,,25,,26이제안되었다.,,
InsPs를 연구할 때 고용된 생물학적 시스템에 관계없이, InsPs를 공부할 때 한 가지 주요 방법론적 과제는 이러한 분자의 신뢰할 수 있는 검출 및 정밀한 정량화였습니다. 질량 분광법 기반 방법은 세포 추출물에서 PP-InsP를 포함한 InsP를 검출하는 데 사용되었습니다. 그러나, 그 연구는 구별된 isomers 를 구별하는 데 실패26,,27. InsPs를 분석하는 또 다른 접근 방식은 TiO2 구슬을 사용하여 세포 용해에서 InsPs의 풀다운을 사용하고, 그 다음으로 용출된 InsPs의 폴리아크라일아미드 젤 전기포아(PAGE)가 뒤따릅니다. 그런 다음 InsPs는 toluidine,블루 또는 DAPI24,,28,29에의해 염색될 수 있습니다. 그러나, 지금까지 안정적으로이 방법을 사용하여 식물 추출물에서 InsP5보다 낮은 InsPs를 검출 할 수 없습니다. 최근에는 InsPs의 핵자기 공명(NMR) 분석을 위한[13C]-myo-이노시톨을 사용하는 방법이 강력한 음이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피(SAX-HPLC)myo30에대한 대안으로 공표되었다. 이 기술은 SAX-HPLC에 비해 유사한 감도를 달성하고 5-InsP7의검출을 허용하고, 세포 추출물로부터 상이한 비상조인SP5 isomers의 차별을 달성하는 것으로 보고되었다. 그러나, NMR-기반 방법의 구현은 화학적으로 합성되고 상업적으로 사용할 수 없는[13C]-myo-이노시톨이 필요합니다.myo 따라서, 대부분의 경우에 사용되는 방법은 [3H]-myo-이노시톨을 이용한 방사성 라벨링 샘플이며, 그 다음으로 SAX-HPLC31,3myo,32,,33이된다. 이 기술은 방사성 myo-이노시톨을식물로 섭취하고 전용 세포 키나아제와 인산염의 결합 된 활성에 의해 다른 InsPs로 변환을 기반으로합니다.
[33H]-표지된 InsPs는 SAX-HPLC를 사용하여 산추출 및 분별됩니다. 이들의 음전하로 인해 InsP는 SAX-HPLC 컬럼의 양전하 고정 단계와 강하게 상호 작용하며, 증가하는 인산염 농도를 포함하는 완충그라데이션으로 동조하여 열에서 InsP를 능가할 수 있습니다. 따라서 용출 시간은 분리될 InsP 종의 전하 및 기하학에 의존한다. 키랄 컬럼이 없는 경우 비항성 이소성 이소성만 이 프로토콜에 의해 분리될 수 있습니다. 그러나, 방사성 표지 기준은 특정 InsP 피크의 이성질성 특성을 할당하는 데 사용될 수 있다. 과거에는 다양한 실험실에서 (바이오) 화학적 방법으로 표지및 라벨이 부착되지 않은 기준을 생성하거나 다양한 세포와 유기체로부터 정화하는 여러 노력이 특정 InsP 종에 피크를 할당하고 개별 InsP 종,43,41,42,40,,,,,5,,7,21,,34,35,36,,37, 37, 37, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 39,39.39 또한, 최근 식물에서 PP-InsPs의 형성으로 이어지는 효소 경로의 발각뿐만 아니라 특정 1-phytase 활성을 가진 세균형 III 이펙터의 발견은 이러한,분석(10, 17,18,,,1822,,23)에대한 유용한 표준을 생성하는 방법에 대한 정보를 제공한다.
결과 분획은 트리튬(3H)의 β 부패로 인해 액체 신경화3카운터에서 측정될 수 있다. 라벨링 시간이 증가함에 따라 꾸준한 상태 동위 원소 평형에 도달한 후 획득한 InsP 프로파일은식물(31)의InsP 상태를 나타내야 한다. 이 프로토콜의 주요 장점은 InsPs에 대한 직접 전구체의 사용과 방사성 신호의 측정에 의해 달성된 고감도이다.
[3 H]-myo-이노시톨3라벨식물myo또는 기타 유기체로부터 추출된 샘플의 SAX-HPLC는 InsP 종에서 PP-InsP에 이르는 InsPs의 검출 및 정량화에 일반적으로 사용되며, InsPs의 대사, 기능 및 행동 모드를 더 잘 이해하는 귀중한 도구를 나타냅니다. 지금까지,이 방법은 또한 낮은 InsP 종에 특별한 관심을 가진 연구원을위한 가장 적합한 선택입니다. 여기에 설명된 프로토콜이 기반으로 하는 이 절차의 기본내용은 이전에7,,21,,31,,34로설명되었지만 식물 유래 InsP 및 특히 PP-InsP의 분석에 맞는 상세한 프로토콜은 여전히 누락되어 있습니다. 이전 간행물은 낮은 풍부한 PP-InsP를 안정적으로 감지하는 데 어려움을 보고했습니다. 특히 InsP8은,식물 재료의 상대적으로 낮은 양,[3H]-myo-이노시톨 낮은 특정 활성 (> 20 Ci/mmol), 과염소산을 기반으로하지 않거나 1 M 미만의 추출 버퍼의 사용, 다른 중성 화 완충제뿐만 아니라 3 선에 있는 최적의 검출기 및 검출선에 대한 저조함[3] 및 검출에 따른 최적의 검출기 및 검출식[3]에 의한 검출기..myo3 이러한 연구에 비해, 여기에 제시된 프로토콜은 PP-InsP7,,21,,34의 신뢰할 수 있는 검출을 위해고안되었습니다.
여기에서는 장비 설정부터 재배 및 라벨링, InsP 추출 및 SAX-HPLC 실행 자체에 이르기까지 자세한 워크플로우를 제시합니다. 이 방법은 모델 식물 A. thaliana에최적화되었지만, 모델 르구스 자포니쿠스의첫 번째 보고된 InsP 프로파일과 함께 본편에 나타난 바와 같이 다른 식물 종을 연구하기 위해 쉽게 수정할 수 있다. 다른 식물 종의 사용은 약간의 최적화를 필요로 할 수 있지만, 우리는 그 사소한 것 상상, 이 프로토콜은 식물 InsP에 추가 연구를위한 좋은 출발점만들기. 가능한 최적화를 용이하게 하기 위해 수정이 가능한 프로토콜 내의 모든 단계와 메서드를 처음 수립할 때 어려울 수 있는 모든 중요한 단계를 나타냅니다. 또한 이 방법으로 얻은 데이터를 특정 InsP의 정량화에 어떻게 사용할 수 있는지, 그리고 다른 샘플을 분석하고 비교할 수 있는 방법을 보고합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>model: 5430 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diammonium hydrogen phosphate, &#8805;97 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0268.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, &#8805;99 %, p.a., ACS</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>LAMBDA Instruments GmbH</td>
			<td>model: OMNICOLL single channel collector</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth incubator</td>
			<td>poly klima GmbH</td>
			<td>model: PK 520-LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC pumps</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector for HPLC</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>model: Rheodyne 9725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol, myo-[1,2-3H(N)]</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals Inc.</td>
			<td>ART 0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>University, Chemistry Department</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>model: TRI-CARB 2900TR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pestle</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>CXH7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 &#181;m pore size, 47 mm circle</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>10401770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer for HPLC</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: M 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium, salt mixture</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro software</td>
			<td>OriginLab Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthophosphoric acid, &#8805;85 %, p.a., ISO</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>6366.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partisphere 5 &#181;m SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4621-0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile</td>
			<td>Greiner Bio One International GmbH</td>
			<td>688161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-indicator paper pH 5.5 - 9.0, Neutralit</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>109564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>P743.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>57648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL</td>
			<td>Simport Scientific Inc.</td>
			<td>S207-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench</td>
			<td>LaboGene</td>
			<td>model: ScanLaf MARS 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, &#8805;99,5 %, p.a.</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>6013599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure deionized water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrenchless WVS End Fitting Kit</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4631-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc

근로-이노시톨의 myo인산염 에스테르는 이노시톨 인산염(InsPs)이라고도 하며 식물 생리학에서 중요한 역할을 하는 세포 조절기관의 클래스입니다. 그들의 음전하, 낮은 풍부 및 가수 분해 활동에 감수성 때문에, 이 분자의 검출 그리고 정량화는 도전적입니다. 이것은 특히 '고에너지' 디포스포 결합을 포함하는 고인형성의 경우, 또한 이노시톨 파이로포스페이트(PP-InsPs)라고 불립니다. 높은 감도로 인해 강력한 음이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피 (SAX-HPLC)로 라벨식물[3H]- myo-이노시톨은 현재 이러한 분자를 분석하는 선택의 방법입니다.myo [3H]-이노시톨을방사성라벨 식물 묘목으로 사용함으로써, 여러 비내포민성 이소종을 포함한 다양한 InsP 종은 고감도로 검출및 차별될 수 있다.3 여기서, 적합한 SAX-HPLC 시스템의 설정뿐만 아니라 식물 재배, 방사성 라벨링 및 InsP 추출에서 SAX-HPLC 실행 및 후속 데이터 분석에 이르는 완전한 워크플로우가 설명된다. 여기에 제시된 프로토콜은 여러 비상화 성 isomers 및 PP-InsP, InsP7 및 InsP8을포함하여 다양한 InsP 종의 차별 및 정량화를 허용하고 다른 식물 종에 쉽게 적응할 수 있습니다. 예로, SAX-HPLC 분석의 애비독시스 탈리아나 및 로터스 자포니쿠스 모종은 수행되고 완전한 InsP 프로파일이 제시되고 논의됩니다. 여기에 설명된 방법은 식물에서 InsPs의 생물학적 역할을 더 잘 이해하는 유망한 도구를 나타냅니다.

여기에 표시된 결과는 기술적 및 생물학적 수준에서의 변이에 따라 얻은 가능한 결과를 설명하는 것을 목표로합니다. 첫 번째는 새로운 대 숙성 컬럼(도1)과저장된 샘플(도3)을이용한 분석에 의해 예시되며, 두 번째 식물 시스템인 A. 탈리아나(도 1,도 3)및 L. japonicus(그림 2)에서추출한 추출물을 평가하여 두 번째.
최적의 SAX-HPLC 실행은 도 1A\u2012C에묘사되며, 이는 신자극 계산 후 A. 탈리아나 추출물로부터 얻은 완전한 이노시톨 폴리인산염 스펙트럼을 보여줍니다. 피크는 잘 분리되어 있으며 이전5,,7에설명된 크로마토그래픽 동원을 기반으로 다른 이소머(또는 enantiomer-pairs)에 할당할 수 있습니다.
도 2는 아라비도시스 모종과 동일한 조건하에서 재배되고 표지된 L. japonicus 묘목의 SAX-HPLC 분석의 대표적인 결과를 나타낸다. 아마도 모든 InsP 종과 애기독증에서 알려진 피크를 볼 수 있지만, 두 종의 프로파일을 비교할 때 특정 InsP isomers의 상대적 (예 : isomers 사이의 비율) 양에 관한 상당한 차이가 있습니다. 예를 들어, 로터스 추출물은 추가 조사를 위한 여지를 남기는 애비독증에 비해 InsP3c,InsP4b,InsP5b 및 InsP3a,InsP4a,InsP5c 감소를 보였다.5c 도 2D는 애비도시스와 연꽃사이의 InsP 이소머스 사이의 서로 다른 비율을 보여줍니다.
도 3은 추출 후 분할된 샘플의 두 개의 InsP 프로파일을 나타낸다. 상반기는 -80°C에서 저장한 후 하루 뒤, 곧바로 분석되었다. 다른 샘플(예: 그림 3A\u2012C및 그림 3D의검은색 및 빨간색 선)사이에는 사소한 차이점만 관찰됩니다. 이는 하나의 동결 해동 주기가 샘플에 해를 끼치지 않으며 메서드 자체가 재현 가능한 결과를 생성한다는 것을 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig01.jpg"> 그림 1: 이 프로토콜을 통해 수행된 성공적인 SAX-HPLC 분석의 일반적인 InsP 프로파일입니다. (a\u2012C) SAX-HPLC 프로파일17일 야생형(Col-0)0 아라비도시스 모종은 [3H]-근시-이노시톨로 표지되었다.3myo 같은 날 글로벌 InsP 추출 및 SAX-HPLC 실행이 수행되었습니다. (A)전체 스펙트럼; (B, C) A에 표시된 프로파일의 확대/축소. 보이는 모든 피크가 강조 표시되고 해당 InsP 종에 할당됩니다. 공시된 크로마토그래피 동원5,7,7InsP4a 가능성이 Ins(1,4,5,6)P4 또는 Ins(3,4,5,6)P4,InsP5a는 InsP5 [2-OH]를 나타낸다. InsP5b는 InsP5 [4-OH] 또는 그 내항형 인SP5 [6-OH]를 나타내며, InsP5c는 InsP5 [1-OH] 또는 그 내황형태 InsP5 [3-OH]를 나타낸다. InsP3a-c,InsP4b,InsP7및 InsP8의 이성질은 아직 알려지지 않았습니다. 패널(D)은동일하게 재배 된 식물의 SAX-HPLC 프로파일을 보여 주지만 숙성 된 기둥 (>40 실행)을 사용합니다. 다른 InsP 종에 비해 InsP6의 명확한 감소및 PP-InsP의 부재가 눈에 띈다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2.jpg"> 그림 2: L. japonicus 식물의 대표 InsP 프로파일. SAX-HPLC 프로파일 (A\u2012C)17 일 된 야생 형 (Gifu)A L. japonicus 묘목[3H]-myo-이노시톨로 무선 라벨.myo (A)전체 스펙트럼; (B, C) A에 표시된 프로파일의 확대/축소. 보이는 모든 피크가 강조 표시되고 해당 InsP 종에 할당됩니다. 공시된 크로마토그래피 동원5,7,7InsP4a 가능성이 Ins(1,4,5,6)P4 또는 Ins(3,4,5,6)P4,InsP 5b를 나타내며, InsP5b는 InsP5 [4-OH] 또는 그 내포성 형태 InsP5 [6-OH]를 나타낸다. 및 InsP5c는 InsP5 [1-OH] 또는 그 내포성 형태 InsP5 [3-OH]를 나타냅니다. InsP3a-c,InsP4b,InsP7및 InsP8의 이성질은 알 수 없습니다. (D) A. 탈리아나의 개별 InsP 종(용출 25\u201296으로부터의 총 활동의 %)과 L. japonicus (그림 2A-C의데이터)를 비교합니다.A‒C <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig03.jpg"> 그림 3: SAX-HPLC 분석의 재현성을 보여주는 분할 샘플의 InsP 프로파일. (a\u2012C) SAX-HPLC 프로파일17일 야생형(Col-0) 아라비도시스 모종은[3H]-근시-이노시톨로표지되었다.0myo 실행 전에, 샘플은 -80 °C에서 저장 후 즉시 반 실행 및 다른 반나절 을 분할했다(A)전체 스펙트럼; (B, C) A에 표시된 프로파일의 확대/축소. 보이는 모든 피크가 강조 표시되고 해당 InsP 종에 할당됩니다. 공시된 크로마토그래피 동원5,7,7InsP4a 가능성이 Ins(1,4,5,6)P4 또는 Ins(3,4,5,6)P4,InsP5a는 InsP5 [2-OH]를 나타낸다. InsP5a는 InsP5 [2-OH]를 나타내며, InsP5b는 InsP5 [4-OH] 또는 그 내포성 형태 InsP5 [6-OH]를 나타내며, InsP5c는 InsP5 [1-OH] 또는 그 내포성 형태 InsP5 [3-OH]를 나타낸다. InsP3a-c,InsP4b,InsP7및 InsP8의 이성질은 아직 알려지지 않았습니다. 패널 D는 InsP6 및 PP-InsP InsPInsP 7 및 InsP8의 정량화를 모두 실행합니다. 값은 양(에서%)을 나타냅니다. 모든 InsP에 비해 각각의 InsP 종 (용출 25-96에서의 총 활성). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 도 1: 빛 반짝이 카운터를 사용하여 액체 신화 계수에 대한 소프트웨어 설정. 소프트웨어 버전을 보여주는 스크린샷과 이 프로토콜로 수행된[3H]샘플의 신경 계산에 사용되는 설정이 묘사됩니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig01.jpg" target="_blank">이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
추가 그림 2: 데이터 정규화의 대표적인 예입니다. 워크시트의 스크린샷에는 SAX-HPLC를 정규화하는 데 사용되는 모든 단계와 수식이 서로 실행됩니다. 단순화를 위해 샘플의 분수 25-35만 표시됩니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig02.jpg" target="_blank">이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 도 3: 분석 소프트웨어를 사용하여 피크 결정, 배경 뺄셈 및 통합. (A)SAX-HPLC 분석의 데이터가 소프트웨어(분 28-96)에 로드되고 피크 분석기 도구가 선택된다. (B\u2012E) 기준선은 개별 피크와 배경 사이의 점을 설정하여 수동으로 정의됩니다. (F)봉우리모양에 따라 수동으로 결정되며, 공표된 크로마토그래피 동원5,,7. (G)피크 범위는 cpm 값에 의해 수동으로 정의됩니다. (H)피크는 통합되어 모든 피크의 %로 계산됩니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig03.jpg" target="_blank">이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

여기서는식물에서이노시톨 폴리인산염을 검출하고 정량화하는 매우 민감한 방법입니다.myo

SAX-HPLC를 사용하여 다른 식물 종에서 용해성, 방사성 라벨이 붙은 이노시톨 폴리인산염의 추출 및 정량화

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

여기에서 입증된 프로토콜은 식물의 이노시톨 폴리인산염의 생합성을 해명하고 식물 대사 및 발달의 특정 양상에서 그들의 역할에 관하여 그들의 역할에 관하여 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 방법은 이노시톨 인산염의 방사성 표지 전구체의 사용이 식물에서 모든 이노시톨 인산염 종의 신뢰할 수있는 검출을 허용하기 때문에 매우 민감하다. 대부분의 식물 생물학자는 HPLC 분석 및 필요한 설정에 익숙하지 않으므로이 방법의 시각적 데모가 중요합니다.또한 이노시톨 인산염 의 추출과 같은 이 프로토콜의 중요한 단계는 적절한 데모없이 따르기 어렵습니다. 먼저 버퍼 A용과 버퍼 B.Both 펌프는 컴퓨터 나 마스터 펌프를 통해 함께 제어해야 하는 두 개의 독립적인 HPLC 펌프로 구성된 시스템을 설정합니다. 중력을 통해 또는 세 번째 저압 펌프를 통해 두 펌프모두에 피스톤 씰 워시를 구현합니다.두 펌프를 다이나믹 믹서에 연결한 다음 믹서를 사출 밸브에 연결한 다음 적어도 1밀리리터 용량의 샘플 루프를 사용하여 주입 밸브에 연결합니다. 모세혈관을 사용하여 분사 밸브를 열과 열에 분할 컬렉터에 연결합니다. 1열로 연꽃 씨앗을 뿌리는 광장 페트리 요리는 0.8%의 박테리아화 된 물에서 단단한 성장 매체로 가득합니다.씨앗이 어둠 속에서 섭씨 4도에서 적어도 3 일 동안 계층화하도록 허용하십시오. 성장 인큐베이터에 씨앗을 배치합니다. 10~20마리의 묘목을 12웰의 투명한 평평한 바닥 세포 배양 판으로 옮기고 1%의 자당으로 보충되고 pH 5.7로 조정되는 반강도 MS 염용액의 2밀리리터로 채워집니다.접시에 3H 묘 이노시톨 45 마이크로큐리를 넣고 부드럽게 소용돌이치십시오. 뚜껑으로 접시를 덮고 미세 다공성 수술 용 테이프로 밀봉하십시오. 그런 다음 다시 성장 인큐베이터에 넣습니다.라벨링 5일 후, 미디어에서 모종을 제거하고 탈온된 물로 간략하게 씻습니다. 종이 타월로 건조하고 튜브를 덮어지지 않도록 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오. 액체 질소에 튜브를 동결 하고 추출 될 때까지 영하 80도에서 저장합니다.냉동고에서 샘플을 가져 와서 사용할 준비가 될 때까지 액체 질소에 보관하십시오. 해동을 시작할 때까지 마이크로센트심분리기 튜브 유봉으로 갈아서 얼음 냉기 추출 버퍼 500마이크로리터를 추가합니다. 샘플이 균질화되고 용액이 착색될 때까지 계속 연삭합니다.18, 000 배 G 및 섭씨 4도에서 10 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 그런 다음 상체를 신선한 1.5 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 추출에 사용되는 튜브는 고체 방사성 폐기물로 간주되며 그에 따라 폐기해야합니다.조심스럽게 추출에 중화 버퍼의 300 마이크로 리터를 추가, 이는 즉시 단백질과 버블링의 강수량을 일으킬 것입니다. 1분 후 샘플을 파이펫 팁과 파이펫 5마이크로리터를 pH 용지에 섞어 pH가 7~8개 사이인지 확인합니다. 필요한 경우 원하는 pH에 도달할 때까지 소량의 중화 버퍼 또는 추출 버퍼를 추가하고 샘플을 열린 뚜껑으로 최소 한 시간 동안 얼음 위에 놓게 합니다.그런 다음 원심 분리를 10 분 동안 분리하고 상체를 신선한 1.5 밀리리터 튜브로 옮기습니다. 분수 수집기를 96개의 작은 반짝임 바이알으로 장착하고 각 유리병을 pH 버퍼와 높은 암모늄 인산염 농도와 호환되는 적절한 섬광 칵테일 2밀리리터로 채웁니다. HPLC 시스템을 시작한 다음 피스톤 씰 세척을 활성화하고 전체 실행 중에 활성화하십시오.시료를 적절한 주사기로 수동으로 주입합니다. 펌프와 그라데이션을 시작합니다. HPLC 실행이 진행되는 동안 정기적으로 압력을 확인하십시오.시작 압력은 약 18에서 24 bar여야하며 100 % 버퍼 B에 도달하면 천천히 50에서 60 bar로 상승해야합니다. 달리기 후 바이알을 단단히 닫고 반짝이는 칵테일로 분수를 격렬하게 흔들어 섞습니다. 측정을 직접 진행하지 않으면 바이알을 어둠 속에서 똑바로 세워 두십시오.분획을 측정하려면 작은 바이알에 맞는 랙을 사용하여 바이알을 반짝이 카운터 랙에 삽입하고 액체 반짝이 카운터에서 각 바이알을 5분 동안 측정합니다. 분당 측정된 카운트 또는 CPM이 보존 시간에 대해 플롯되는 2D 선 차트를 준비합니다. 샘플을 서로 비교하려면 각 개별 샘플에 대해 각 eluted 분획에서 CPM을 합산하고 해당 샘플의 총 CPM을 다른 샘플의 총 CPM으로 나누어 데이터를 정규화합니다.특정 이노시톨 폴리포산염 피크의 상대적 정량화를 수행하고 통계 분석을 위한 복제 데이터를 포함하는 막대 그래프를 생성하기 위해 크로마토그램의 피크 영역을 계산할 수 있는 특수 소프트웨어를 사용하여 분석을 계속합니다. 신발량 계수 후 A.thaliana 추출물로부터 얻은 완전한 이노시톨 폴리인산염 스펙트럼이 여기에 나와 있다. 봉우리들은 잘 분리되어 있으며 다른 이소마에 할당할 수 있습니다.숙성 된 컬럼을 사용하면 이노시톨 육각증염의 명확한 감소와 이노시톨 파이로포스페이트가 없는 것으로 보입니다. SAX-HPLC 분석은 또한 아라비도시스 모종과 같은 조건하에서 재배되고 표지된 L.japonica 묘목에서 수행되었습니다. 아마도 모든 이노 시 톨 폴리 인산염 종과 아라비도시스에서 알려진 피크를 볼 수 있지만, 두 종 사이의 특정 이노 시톨 폴리 인산염 이소종의 상대적 금액에 차이가 있다.추출 직후 시료를 분석할 필요가 없다는 것을 증명하기 위해, 한 샘플은 섭씨 영하 80도에서 저장한 후 다음날 2개 반으로 분할되었다. 신선 및 냉동 시료의 SAX-HPLC 프로파일 간의 차이는 중요하지 않았으며, 하나의 동결 해동 주기가 샘플에 해를 끼치지 않으며 방법 자체가 재현 가능한 결과를 생성한다는 것을 입증했습니다. 이 프로토콜을 시도할 때는 항상 샘플을 철저히 분쇄하고, 동결및 추출 버퍼로, 중화 후 중성 pH에 가까운 것을 목표로 하여 SAX-HPLC 분석을 위한 무선 라벨이 부착된 이노시톨 인산염의 최대 복구를 보장합니다.SAX-HPLC 실행에서 무선 라벨을 정제할 수 있으며, 예를 들어 반짝이는 칵테일없이 분수를 수집하고 작은 알리쿼트만 측정하여 상호 반응에서 사용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

레이저 이외에 Microdissection RNA-서열에 대한 실험 디자인 : 옥수수 잎 개발의 분석 교훈

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

연구

생화학

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

단일 시료의 대사 산물, 지질 및 단백질의 종합 분석을위한 간단한 분취 추출 방법

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

절연 및 호흡 측정의 미토 콘 드리 아 애기 thaliana 에서

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

가용성과 불용 성 Huntingtin의 해상도 대 한 분류

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

잎 스프레이 질량 분석: 식물 조직에서 대사를 직접 평가 하는 급속 한 대기 이온화 기술

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

카페인 추출, 효소 활동 및 식물 세포 정지에서 카페인 Synthase의 유전자 발현

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

체 외 형광 공명 에너지 전달에 밀리초 시간 규모에서 단백질 복합물의 역학을 공부 하는 사용 하 여

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

식물 MicroRNAs의 검출 및 정량화를 위한 RNA 블롯 분석

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

티오글리콜산(TGA)을 이용한 식물바이오매스 리그닌 함량 추정

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...