Name: extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc
Uploaded: 2020-06-26T15:00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands Excellence Strategy - EXC-2070 – 390732324 (PhenoRob), Research Training Group GRK2064 og individuelle forskningsbevilgninger SCHA1274/4-1 og SCHA1274/5-1 til G.S.. Vi takker også Li Schlüter og Brigitte Ueberbach for teknisk assistanse.

1. Sette opp HPLC-systemet
<ol><li>Sett opp et system bestående av to uavhengige HPLC-pumper (binærpumpe), én for hver buffer. Begge pumpene må styres sammen via en datamaskin med respektive programvare eller ved å ha en hovedpumpe. Implementer en stempeltetningsvask for begge pumpene, enten via gravitasjonskraft eller gjennom en tredje lavtrykkspumpe. Angi én pumpe for buffer A (betegnet pumpe A) og én for buffer B (betegnet pumpe B). MERK: Begge må kunne generere trykk på opptil 60 bar (6 MPa) og strømningshastigheter på minst 0,5 ml/min.</li>
	<li>Koble begge pumpene til en dynamisk mikser.</li>
	<li>Koble mikseren til en injeksjonsventil med en prøvesløyfe på minst 1 ml kapasitet.</li>
	<li>Koble injeksjonsventilen til søylen med kapillær via de tilsvarende endearmaturene.</li>
	<li>Koble kolonnen til fraksjonsamleren ved hjelp av en kapillær med en passende lengde. MERK: Denne beskrivelsen er basert på vårt HPLC-system (se Materialse tabellen),som krever flere manuelle trinn enn nyere og mer sofistikerte systemer. Vårt system gir enkel tilgang og modifisering av alle komponenter. Kvartærpumper (med den binære gradienten som er beskrevet her) kan også brukes og vil føre til elution profiler og generell kvalitet på analysene som ligner på de som oppnås med binære pumper.</li>
</ol>2. Utarbeidelse av buffere, kolonne og HPLC-system
<ol><li>Klargjør bufferne for uttrekking av løselige InsP-er: ekstraksjonsbuffer (1 M HClO4) og nøytraliseringsbuffer (1 M K2CO3). Forbered begge bufferne med ultra-rent deionisert vann. De er stabile ved romtemperatur i flere måneder. Umiddelbart før ekstraksjon, tilsett EDTA i begge løsningene til en endelig konsentrasjon på 3 mM (f.eks. fra en filtrert 250 mM EDTA lagerløsning). FORSIKTIG: HClO4 (perklorsyre) er sterkt korroderende.</li>
	<li>Klargjør bufferne for SAX-HPLC-kjøringen: buffer A (1 mM EDTA) og buffer B (1 mM EDTA, 1,3 M (NH4)2HPO4; pH 3.8 med H3PO4). Forbered begge ved hjelp av ultra-ren deionisert vann etterfulgt av vakuumfiltrering med 0,2 μm porestore membranfiltre. Disse er stabile ved romtemperatur i flere måneder. MERK: EDTA bør inkluderes i alle buffere for å forhindre samhandling av kasjoner med InsP-er, noe som kan føre til endret InsP-ladning eller til og med uoppløselige InsP-saltkomplekser.</li>
	<li>Programmer graderingen på følgende måte: 0\u20122 min, 0 % buffer B; 2\u20127 min, opptil 10% buffer B; 7\u201268 min, opptil 84% buffer B; 68\u201282 min, opptil 100% buffer B; 82\u2012100 min, 100% buffer B, 100\u2012101 min, ned til 0% buffer B; 101\u2012125 min, 0% buffer B. Den optimale strømningshastigheten for denne graderingen er 0,5 ml/min.<ol>
<li>Under løpet samler du fraksjoner hvert minutt, fra minutt 1 til minutt 96. De resterende 30 min av gradienten tjener til å vaske kolonnen og systemet, og trenger ikke å samles for scintillation telling.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hvis mulig, sett det maksimale utskiftbare trykket før nødstopping av HPLC-pumpene til 80 bar (8 MPa). Dette forhindrer kritisk skade på kolonnens harpiks.</li>
	<li>Når du bruker en ny SAX HPLC-kolonne, vasker du den grundig (> 50 ml) med filtrert ultrarent deionisert vann før første gangs bruk. MERK: Dette vil sikre fjerning av inneholdt metanol, og dermed hindre saltnedbør i senere trinn. Bruk om mulig en separat HPLC-pumpe. Hvis dette ikke er tilgjengelig, må du kontrollere at HPLC har spylt med vann før du vasker kolonnen. Strømningshastigheten bør ikke overstige 2 ml/min. Etter vask er kolonnen klar for analysen, og når den håndteres riktig, kan den brukes til 20\u201240 kjøringer. Etter det vil resolusjonen gradvis reduseres. Langvarig vasking med buffer A (> 1 h) og utfører trinn 2.6 kan bidra til å øke levetiden til kolonnen. Hvis reduksjonen i oppløsningen vedvarer, må kolonnen byttes ut. Gradienten kan justeres for å øke separasjonen mellom spesifikke inositolpolyfosfatarter eller for å redusere den totale kjøretiden. Bruk av forskjellige HPLC-systemer (med forskjellig tomromsvolum eller forskjellig volum av kapillærene) vil sterkt påvirke oppbevaringstidene. Kolonneendringer har også mindre effekter på oppbevaringstidene.</li>
	<li>Utfør en "mock run". I stedet for en ekstrahert prøve, injiser filtrert ultra-ren deionisert vann i HPLC-systemet og kjør standard gradient. Brøkene trenger ikke å samles inn. MERK: Trinn 2.6 er valgfritt. Det bør imidlertid utføres hvis en av følgende situasjoner gjelder: En ny kolonne er installert; HPLC-systemet har blitt brukt til en annen metode på forhånd; HPLC-systemet har ikke vært brukt på mer enn 3 dager. Det oppstod et problem med forrige kjøring.</li>
</ol>3. Plantedyrking og merking med [3H]-myo-inositol
MERK: Følgende trinn skal utføres med sterile komponenter og under sterile forhold, mens du bruker hansker for å beskytte hendene mot forurensning med radiomerket. Plantemedier, spesielt når de inneholder sukrose, er utsatt for mikrobiell forurensning.
<ol><li>Steriliser A. thalianafrø med 1 ml 1,2 % natriumhypokloritt i 3 min etterfulgt av 1 ml 70 % etanol i 3 min. Tilsett deretter 1 ml 100% etanol, pipette frøene med etanol på et sirkulært filterpapir og la dem lufttørke under en laminær-strøm på en ren benk.<ol>
<li>Når du bruker L. japonicus frø, legg dem i en mørtel og skrubb frø med sandpapir før sterilisering for å sikre tilstrekkelig spiring rate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Så ut Arabidopsis frø i 1-2 rader på firkantet Petri retter fylt med solid vekst media bestående av halv styrke Murashige og Skoog (MS) saltløsning, 1% sukrose, 0,7% gellan tyggegummi i deionisert vann justert til pH 5.7 med KOH og la dem stratifisere i minst 1 dag ved 4 ° C i mørket.<ol>
<li>For Lotus frø, så dem ut i 1 rad på firkantet Petri retter fylt med solid vekst media bestående av 0,8% bakteriologisk agar i deionisert vann og la dem stratifisere i minst 3 dager ved 4 ° C i mørket.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plasser platene vertikalt i en vekst inkubator eller klimakammer og la dem vokse i 10-12 dager under kortdagsforhold (8 h lys ved 22 °C, 16 t mørk ved 20 °C).</li>
	<li>Overfør 10–20 frøplanter til én brønn av en 12-brønns klar flatbunnet cellekulturplate fylt med 2 ml halvfast MS saltløsning supplert med 1 % sukrose og justert til pH 5,7.</li>
	<li>Tilsett 45 μCi av [3H]-myo-inositol (30–80 Ci/mmol, oppløst i 90 % etanol) og bland ved skånsom virvlende. Dekk platen med det tilsvarende lokket og forsegle den med mikroporisk kirurgisk tape (f.eks. mikropore eller leuoforetape), og plasser den tilbake i vekstinkubatoren. FORSIKTIG: [3H] er en lavenergi betaemitter som kan være en skadelig strålingsfare ved innånding, inntatt eller absorbert gjennom bar hud. Bruk alltid hansker når du håndterer radioaktivt materiale eller utstyr som har direkte eller indirekte kontakt med radioaktivt materiale. Følg også de lokale reglene for sikker håndtering av radiokjemikalier (f.eks. bruk av ekstra verneklær, bruk av dosimeter og undersøkelser av overflater for forurensninger regelmessig).</li>
	<li>Etter 5 dager med merking, fjern frøplanter fra media og vask dem kort med deionisert vann. Tørk dem med papirhåndklær og overfør dem til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Ikke overfyll røret, og plasser ikke mer enn 100 mg FW/rør, noe som tilsvarer ca. 10\u201220 17-dagers gamle frøplanter. MERK: Et overskudd av plantemateriale vil fortynne syren under ekstraksjonsprosessen og vil sterkt redusere ekstraksjonseffektiviteten.<ol>
<li>Fest røret i flytende nitrogen og oppbevar det ved -80 °C til ekstraksjon. MERK: Prøvene kan oppbevares ved -80 °C i flere uker uten at det går på bekostning av prøvekvaliteten. Vekstforholdene (media, lys, temperatur, tid) kan endres i henhold til behovene til et bestemt eksperiment eller plantearter. Det bør imidlertid utvises forsiktighet ved fortynne [3H]-myo-inositol, for å sikre kvantifiserbare SAX-HPLC-kjøringer av god kvalitet. Derfor anbefales det å starte med [3H]-myo-inositolkonsentrasjoner angitt her og redusere den trinnvis hvis ønskelig. Under merking tid, planter kan sendes til ulike behandlinger (f.eks, miljømessige påkjenninger eller kjemiske midler) for å vurdere virkningen av disse forholdene på globale InsP. For å nå steady-state merking, anbefaler vi å merke planter i minst 5 dager.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Ekstraksjon av løselige InsPs
MERK: Oppbevar prøver og reagenser på is under hele avsugsprosessen. Bruk alltid hansker og vernebriller på grunn av høy risiko for kontakt med radioaktivt materiale, spesielt under sliping. Alt som kommer i kontakt med prøver anses som radioaktivt avfall og bør kastes i henhold til lokale regler for sikker avhending av radioaktivt materiale.
<ol><li>Klargjør arbeidsløsningene for ekstraksjons- og nøytraliseringsbufferen som i trinn 2.1. Hver prøve vil kreve 600 μL ekstraksjonsbuffer og 400 μL nøytraliseringsbuffer. Oppbevar bufferne på is.</li>
	<li>Ta prøvene fra -80 °C fryser og oppbevar dem i flytende nitrogen til videre behandling. Grind prøvene med en mikrocentrifuge tube pestle til de begynner å tine og tilsett 500 μL av iskald ekstraksjonsbuffer. Fortsett slipingen til prøven er helt homogenisert og løsningen har en dyp grønn farge (hvis bladene er tilstede i prøven).</li>
	<li>Sentrifuge prøvene i 10 min ved 4 °C ved ≥ 18000 x g. Overfør supernatanten til et friskt 1,5 ml rør. Husk at rørene som brukes til utvinning anses som fast radioaktivt avfall og må kastes tilsvarende.</li>
	<li>
Tilsett forsiktig 300 μL nøytraliseringsbuffer til ekstraktet. Utfelling av proteiner og boblende vil starte umiddelbart. Bland ved å virvle med en pipettespiss etter et minutt og vent i noen sekunder før du pipetterer en liten mengde (5 μL) på pH-papir (ideelt utvalg av pH 6-9). PH skal være mellom pH 7 og 8 til slutt.<ol>
<li>Tilsett eventuelt små mengder (vanligvis 10–20 μL) med nøytraliseringsbuffer eller ekstraksjonsbuffer til ønsket pH er nådd. La prøvene hvile på is i minst 1 time med åpent lokk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sentrifuge prøvene i 10 min ved 4 °C ved ≥ 18.000 x g. Overfør supernatanten til et friskt 1,5 ml rør. MERK: Prøvene kan enten brukes direkte i en SAX-HPLC-kjøring eller oppbevares på is (hvis de brukes senere samme dag) eller fryses i flytende nitrogen og lagres ved -80 °C i 2\u20124 uker. For å sikre høy reproduserbarhet og sammenlignbarhet anbefales det å alltid fryse prøvene i flytende nitrogen i 5 min, selv om de vil bli direkte brukt etterpå. Langtidslagring av ekstraherte prøver ved -80 °C er mulig så lenge prøvene bare tines én gang. Hvis frosne prøver brukes til analysen, må du kontrollere at ingen partikler er synlige etter tining. Ellers sentrifuge igjen i 10 min ved 4 °C ved ≥ 18 000 x g og overfør supernatanten til et friskt 1,5 ml rør.</li>
</ol>5. Utføre HPLC-kjøringen
<ol><li>Utstyr fraksjonssamleren med 96 små scintillation hetteglass (kapasitet på ~ 6 ml) og fyll hvert hetteglass med 2 ml av en passende scintillation cocktail (f.eks Ultima-Flo AP flytende scintillation cocktail) kompatibel med buffere med lav pH og høy ammoniumfosfatkonsentrasjon (se Materialtabell). MERK: Antall hetteglass og størrelsen på hetteglassene avhenger av fraksjonssamleren og scintillasjonstelleren som brukes. Det er viktig å i det minste samle de første 90 brøkene, hvis gradienten som er beskrevet her, brukes, for å få en full inositol polyfosfatprofil. Sørg også for å merke hvert hetteglass og dets respektive lokk på riktig måte for å forhindre blanding av brøker eller prøver.</li>
	<li>Start HPLC-systemet/pumpene og få det klart til å kjøre. Aktiver stempeltetningsvasken og hold den aktivert under hele løpet. Legg i prøven ved å injisere hele supernatanten manuelt fra trinn 4,5 (ca. 750 μL) ved hjelp av en egnet sprøyte (se Materialtabell). Hvis automatisk injeksjon er mulig, overfør prøven til det tilsvarende prøvehettampullen. Vri ventilen fra "load" til "injisere" posisjon og starte gradienten og fraksjonsamleren. MERK: Avhengig av HPLC-systemet som brukes, kan startprosedyren variere, spesielt når du sammenligner eldre systemer (som beskrevet her) med en fullt programvarestyrt nyere modell. Det er svært viktig å sikre at gradienten, prøveinjeksjonen og brøksamlingen starter samtidig.</li>
	<li>Mens HPLC-kjøringen pågår, må du kontrollere trykket regelmessig. Starttrykket bør være rundt 18–24 bar (1,8–2,4 MPa) og bør sakte stige til 50–60 bar (5–6 MPa) når 100 % buffer B er nådd. FORSIKTIG: Redusert trykk kan indikere en lekkasje i systemet, mens økt trykk indikerer blokkering. Trykksvingninger (≥ 3 bar i løpet av få sekunder) kan indikere tilstedeværelse av luft i systemet. Husk at alt som forlater kolonnen, samt hver lekkasje som oppstår på injektoren eller etterpå er radioaktivt. MERK: Trykket avhenger også av HPLC-systemet og kan være lavere eller høyere enn det som er angitt her. Det vil sakte øke etter ca 15-20 går. Dette påvirker imidlertid ikke nødvendigvis kvaliteten på de oppnådde løpene.</li>
	<li>Etter løpet, lukk hetteglassene tett og bland brøkene med scintillation cocktail ved kraftig risting. Fortsett direkte med målingen eller hold hetteglassene i oppreist stilling, ideelt sett i mørket. MERK: Fraksjoner blandet med scintillation cocktail er stabile i flere uker og kan måles senere. Siden halveringstiden til tritium er 12,32 år, er signaltapet ubetydelig.</li>
	<li>Når dagens siste prøve er fullført, stopper du begge HPLC-pumpene.</li>
	<li>(Valgfritt) For å øke levetiden til systemet, spesielt når det ikke brukes regelmessig, vask pumpe B og kapillær ved å plassere kapillæren fra buffer B i en flaske med buffer A og la pumpen kjøre i 10–15 min. Før neste bruk må du huske å skifte kapillæren i buffer B og koble pumpen B fra mikseren for å skylle den med buffer B. Når pumpen og kapillærene er fylt igjen med buffer B, koble den til mikseren igjen og systemet er klart til bruk.</li>
</ol>6. Måle brøkene
<ol><li>Sett hetteglassene inn i scintillation counter racks og mål hvert hetteglass i 5 min i en flytende scintillation counter.</li>
	<li>Bruk ideelt sett stativer som passer direkte til små hetteglass og unngår å henge i hetteglassene i større (f.eks. 20 ml) hetteglass for å redusere tellefeil. Programvareinnstillingene som brukes i denne protokollen, vises i supplerende figur 1. MERK: Utfør regelmessig en SNC-protokoll (selv normalisering og kalibrering) ved hjelp av uslokkede [3H]-standarder. Kortere telletider (1–5 min) er mulig for å redusere ventetiden. Men for å sikre en høy telling reproduserbarhet og nøyaktighet, anbefales 5 min.</li>
</ol>7. Dataanalyse
<ol><li>Eksporter målingene fra scintillation-telleren som en regnearkfil eller et kompatibelt/ konvertibelt filformat. Evaluer dataene med en datamaskin utstyrt med Excel eller lignende programvare, og en passende analyseprogramvare som Origin.</li>
	<li>Klargjør et 2D-linjediagram der de målte tellingene per minutt (cpm) tegnes inn mot oppbevaringstiden (se figur 1, figur 2).</li>
	<li>Hvis du vil sammenligne prøver med hverandre, normaliserer du dataene ved å summere cpm fra hver utskjøde brøk fra minutt 25 til 96 for hvert enkelt utvalg. MERK: Minutt 25 brukes som cut-off for å utelukke innlemmet [3H]-myo-inositol, InsP1 og InsP2 fra analysen, da de har en tendens til å svinge sterkt og ikke kan skilles godt (i hvert fall med gradienten foreslått i denne protokollen) og dermed sterkt endre normaliseringsfaktoren på grunn av deres høye aktivitet.</li>
	<li>Normaliser alle data til prøven med den laveste totale cpm (i brøker 25\u201296) ved å dele den totale cpm fra prøven med den laveste cpm (i brøker 25-96) med den totale cpm (i brøker 25-96) av de andre prøvene. Den resulterende faktoren kan deretter brukes til å normalisere cpm fra hver brøk ved å multiplisere cpm av hver brøkdel med faktoren. MERK: Til slutt skal summen av cpm-verdiene fra minutt 25 til slutten være lik for alle prøver sammenlignet med hverandre. Bare normaliserte kjøringer skal vises i samme graf/figur (når de presenteres som faktiske profiler). Tilleggstall 2 viser et eksempel på hvordan disse beregningstrinnene gjøres (ved hjelp av bare brøker 25–35 av to eksempler for forenkling). Men i noen tilfeller er det ikke nødvendig å normalisere data. For eksempel, når topper kvantifiseres i henhold til trinn 7.4 og presenteres som prosenter av totale InsP -er (som vist i figur 3D). Som nevnt tidligere, når du presenterer flere analyser side ved side som profiler, eller når den faktiske målte aktiviteten brukes til konklusjoner (f.eks. behandling a) øker InsP7 x% sammenlignet med kontroll, med henvisning til cpm-verdiene til InsP7 av begge prøvene og ikke til deres prosentandel av totale InsP)-normalisering er nødvendig. For å analysere effekten av genotype eller behandlingsforskjeller på merking effektivitet, er det viktig å ikke normalisere, da dette ville ugyldiggjøre disse forskjellene. Absolutt kvantifisering med denne metoden er imidlertid utfordrende fordi utvinningseffektiviteten med denne protokollen kan være variabel av ulike grunner og noen ganger til og med observeres når kopi av samme genotype og behandling analyseres. Husk at avhengig av HPLC-systemet, kolonnen og graderingen som brukes til analysene, må det kanskje hende at avskjæringen må endres.</li>
	<li>Hvis du vil utføre relative kvantifiseringer av visse inositolpolyfosfattopper og deretter opprette stolpegrafer som inneholder data om replikeringer for statistiske analyser, fortsetter du analysen med en spesialisert programvare som kan beregne toppområder av kromatrammer (f.eks. Opprinnelse). Se Tilleggstall 3. MERK: De fleste HPLC-systemer som er programvarestyrte, leveres med en respektive programvare som er i stand til denne oppgaven. Topper bestemmes som brøkene med cpm-verdier over bakgrunnen (som varierer til en viss grad mellom kjøringer) og oppbevaringstider som ligner på tidligere publiserte data. Oppbevaringstiden for en bestemt topp bestemmes i regnearkprogramvare (f.eks. Excel) og brukes til å tilordne topper for beregning av bestemte integraler (f.eks. i Origin). Supplerende figur 3 illustrerer denne prosessen med toppbestemmelse, subtraksjon av bakgrunn og integrering av topper.</li>
</ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Her presenterer vi en allsidig og følsom metode for å kvantifisere InsP-er, inkludert PP-InsPs i planteekstrakter og gi praktiske tips om hvordan du får denne metoden etablert. Selv om protokollen generelt er robust, kan suboptimale kjøringer og analyser forekomme. I de fleste tilfeller kan disse løpene identifiseres ved en sterk reduksjon eller til og med fullstendig tap av svært fosforylerte InsP-er, spesielt PP-InsP-artene InsP7 og InsP8. Mulige årsaker kan være mikrobielle forurensninger av plantematerialet og utilstrekkelig deaktivering av endogene anlegg PP-InsP hydrolaser under ekstraksjon på grunn av utilstrekkelig sliping og tining av plantemateriale som ikke vil være i umiddelbar kontakt med ekstraksjonsbuffer. Ytterligere årsaker inkluderer unøyaktig pH-justering ved utilstrekkelig eller overflødig tilsetning av nøytraliseringsbuffer, eller rett og slett utilstrekkelig prøvemateriale. Sistnevnte kan gjøre det vanskelig å oppdage PP-InsPs, siden de ofte er tilstede i svært lave mengder i cellene. Et overskudd av prøvemateriale eller ineffektiv tørking under trinn 3.5 kan forårsake fortynning av perklosyre, og fører derfor også til utilstrekkelig enzym deaktivering og et spesifikt tap av InsP6 og PP-InsPs. Mengden plantemateriale, samt radiomerket som brukes i denne protokollen ble optimalisert basert på kostnader og ytelse, og er derfor nær det laveste beløpet som fortsatt er tilstrekkelig for å gi optimale resultater. I tillegg vil kolonnen harpiks gradvis miste sin oppløsning kapasitet. Det første tegnet på denne prosessen er (av grunner som ikke er helt klart for forfatterne) et spesifikt tap av høyere fosforylert InsP-arter som PP-InsPs i HPLC-spekteret. Med ytterligere aldring vil selv InsP6 ikke bli løst riktig av kolonnen (figur 1D). Derfor er bruk av en tilstrekkelig kolonne, samt omhyggelig håndtering av prøven og riktig vedlikehold av HPLC-komponentene avgjørende for å sikre nøyaktige resultater.
Når du sammenligner prøver og kjøringer, spesielt når de genereres med forskjellig utstyr (f.eks. HPLC-systemer og kolonner) eller på forskjellige dager, er det avgjørende å normalisere prøvene med hverandre (som beskrevet i trinn 7.3) og analysere dem på samme måte. Bare gjennom normalisering er det mulig og nøyaktig å vise flere prøver i samme graf (figur 3). For kvantifisering av individuelle InsP-er i forhold til totale InsP-er, eller til en annen bestemt InsP-art, er det ikke nødvendig å normalisere, så lenge bare relative verdier og ikke absolutte verdier vises. Ideelt sett vises både InsP-profilene og kvantifiseringene. Men i noen tilfeller er det ikke mulig å tilstrekkelig vise to eller flere løp i samme graf. Ulike oppbevaringstider eller ulike nivåer av bakgrunnsaktivitet kan gjøre det vanskelig å sammenligne ukvantifiserte SAX-HPLC-profiler alene. Det samme gjelder når mange prøver må sammenlignes. I slike tilfeller er det nødvendig med en ytterligere evaluering ved hjelp av en ekstra programvare (f.eks. Origin) for individuell toppkvantifisering.
Forfatterne er klar over at protokollen som er beskrevet her kan optimaliseres og må tilpasses hvert enkelt forskningsspørsmål. Selv om den er optimalisert for Arabidopsis ekstrakter 7,17 i denne protokollen, er denne metoden allsidig og kan bidra til å bestemme InsP-profiler av andre plantearter også. Her eksemplifiserer vi denne muligheten ved å presentere for første gang en InsP-profil for L. japonicus, som ikke krevde noen endringer av merkingsforholdene, InsP-ekstraksjon eller SAX-HPLC-kjøring (figur 2). Spesielt, mens generelt lignende, forskjeller observeres mellom L. japonicus og Arabidopsis InsP profiler. For eksempel i L. japonicus InsP5 [4-OH] eller dens enantiomeriske form InsP5 [6-OH] er mer rikelig enn InsP5 [1-OH] eller dens enantiomeriske form InsP5 [3-OH] i forhold til Arabidopsis,hvor InsP5 [1-OH] eller dens enantiomeriske form InsP5 [3-OH] er den dominerende InsP5 arten. På samme måte forventer vi at endringer i mediesammensetningen, [3H]-myo-inositol konsentrasjon, plantealder, miljøforhold (f.eks. lys og temperatur), tilsetning av kjemiske forbindelser eller analyser av plantemikrobielle interaksjoner blant andre faktorer, må testes og tilpasses.
En viktig ulempe med denne metoden som må vurderes er at merkingen gjøres i en (steril) flytende kultur, som ikke representerer et fysiologisk miljø for de fleste landplanter. I tillegg, på grunn av de høye kostnadene ved [³H]-myo-inositol, er volumet av merkingsløsningen og størrelsen på kulturfartøyet generelt begrenset, noe som også begrenser størrelsen på plantene som kan brukes. Dyrking i flytende kultur kan unngås ved å infiltrere direkte for eksempel blader av jorddyrkede planter med [³H]-myo-inositol og deretter følge protokollen beskrevet her, som tidligere rapportert10.
Det er flere ulemper med denne protokollen i forhold til alternative metoder, for eksempel TiO2-nedtrekk etterfulgt av PAGE eller massespektrometribaserte teknikker. På grunn av [3H]-myo-inositol merking, vil bare InsP arter som direkte stammer fra radiomerket myo-inositol bli oppdaget til slutt. Metoden som er beskrevet her er blind for andre Ins isomers som scyllo-inositol og andre isomers noen som har blitt identifisert i visse planter44. Videre vil myo-InsPs avledet fra andre veier bli utelukket, inkludert de syntetisert av de novo syntese av myo-inositol og myo-inositol-3-fosfat synthase (MIPS) proteiner45. myo Selv om [32P] eller [33P]-ortho-fosfat kan brukes som alternative etiketter, utgjør deres bruk en stor ulempe, siden hvert fosfatholdige molekyl, inkludert de rike nukleotider og dets derivater, vil bli merket. Disse molekylene kan også ekstraheres med denne protokollen og bindes til SAX-kolonnen, noe som vil resultere i et høyt nivå av bakgrunnsaktivitet som vil forstyrre identifiseringen av individuelle InsP-topper5. I tillegg kan kvantifisering av [32P]- eller [33P] -merket InsP og PP-InsPs sterkt påvirkes av fosfat og pyrofosfatmoaety omsetning og kan ikke rapportere en masse avlesning for inositol arter.
På den annen side, [3H]-myo-inositol merker spesielt myo-inositolholdige molekyler. InsPs, inositolholdige lipider, som fosfoinositider og galaktink er i dette tilfellet merket. Imidlertid vil bare InsPs bli analysert med denne protokollen, siden lipider er uoppløselige i ekstraksjonsbufferen og galactinol ikke bindes til SAX-kolonnen.
Så langt er forskjellene fra en plante InsP-profil generert av [3H]-myo-inositol merking sammenlignet med en bestemt av TiO2 pulldown / PAGE forblir ukjent, siden slike sammenligninger ikke har blitt utført i planter. En fersk studie i dyreceller adressert dette spørsmålet46. I dette arbeidet ble et utvalg av InsP6 som er usynlig av [3H]-myo-inositol merking, som dermed bør være direkte avledet fra glukose-6-fosfat, identifisert ved å sammenligne SAX-HPLC-profiler med PAGE geler av pattedyrcellelinjer. 24 timer fosfatsult resulterte i en 150 % økning av InsP6 ved kvantifisering av PAGE geler av InsPs renset ved hjelp av TiO2-nedtrekk. SAX-HPLC-analyser av [3H]- myo-inositol-merkede celler som ble behandlet på samme måte, viste bare en økning med 15 % av [3H]-InsPmyo6. Som tidligere nevnt er InsPs lavere enn InsP5 umulig å oppdage med PAGE-analyse i de fleste tilfeller. Radiolabeling etterfulgt av SAX-HPLC ser ut til å være den metoden for valg, så lenge massespektrometriske protokoller ikke er optimalisert for å oppdage denne gruppen av svært negativt ladede molekyler.
En annen gjenværende utfordring er å skille enantiomers i SAX-HPLC analyser (eller i en annen metode for InsP analyse)10,17. Denne utfordringen kan håndteres ved tillegg av kiralvelgere, det vil si enantiopure forbindelser som L-arginin midt som samhandler med de respektive enantiomeriske molekyler for å danne diastereomeriske komplekser som kan skilles10. Så vidt vi vet, har denne tilnærmingen bare blitt implementert for å diskriminere den enantiomeriske InsP5 isomers InsP5 [1-OH] og InsP5 [3-OH] av NMR analyser10. Diskriminering av andre enantiomeriske par eller vellykket diskriminering av enantiomers ved chiral SAX-HPLC-analyse eller chiral PAGE-baserte metoder er ennå ikke rapportert og bør videreutvikles. Tatt i tanke på den bevarte syntesen og den bevarte reguleringen av PP-InsPs ved fosfortilgjengelighet, ser vi for oss at spesielt ikke-radioaktive metoder som PAGE eller MS-baserte metoder, sammen med næringsanalyser, vil bidra til å grunne sannhetsarbeidet for å kalibrere fjernmålingsdata designet for å diagnostisere næringsmangleri avlinger 17,,18,,24,,25. Metoden som presenteres her kan imidlertid fortsatt betraktes som gullstandarden for InsP-analyser og vil være medvirkende til å oppdage nye funksjoner av disse spennende budbringerne i planter.

Nesten fire tiår siden, inositol fosfater (InsP) dukket opp som signalisere molekyler, etter Ins (1,4,5)P3 (InsP3) ble identifisert som en andre budbringer som aktiverer reseptor-mediert utgivelsen av Ca2 + i dyreceller1,2. Til dags dato er det ikke identifisert noen InsP3-reseptor (IP3-R) i planter, noe som stiller spørsmål ved en direkte signalrolle for InsP3 i planteceller3. Uansett fungerer InsP3 som en forløper for andre InsPs involvert i flere planteutviklingsprosesser, inkludert regulering av spesifikkesignalveier 3,,4,,5,,6,,7,,8. For eksempel kan InsP3 ytterligere fosforyleres til InsP6, også kjent som "fytinsyre", som representerer en viktig kilde til fosfat, myo-inositol og cations, og ble vist å spille sentrale roller i planteforsvar mot patogener, mRNA eksport og fosfat homeostase5,9,10,11,12.
Inositol pyrofosfater (PP-InsPs) er en klasse av InsPs som inneholder minst en høyenergi di-fosfosfater, opprinnelig identifisert i dyreceller, amøbe og gjær, hvor de spiller kritiske roller i ulike cellulæreprosesser 13,14,15. Til tross for banebrytende arbeid på PP-InsPs iplanter 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, biologiske funksjoner og isomer identitet av disse molekylene fortsatt i stor grad gåtefull. I modellen anlegget Arabidopsis thaliana, cellulær InsP8 ble foreslått å regulere forsvar mot insekt planteetere og nekrotrofiske sopp via tilfeldighet-påvisning av InsP8 og aktiv jasmonate av ASK1-COI1-JAZ reseptor kompleks17. Videre har roller av InsP8 og andre PP-InsPs i energi homeostase og næringsfølsom, samt fosfat homeostase blittforeslått 17,23,24,25,26.
Uavhengig av det biologiske systemet som brukes, har en stor metodisk utfordring når man studerer InsP vært pålitelig deteksjon og presis kvantifisering av disse molekylene. Massespektrometribaserte metoder har blitt brukt til å oppdage InsPs, inkludert PP-InsPs, fra celleekstrakter. Men disse studiene klarte ikke å skille distinkte isomers26,27. En annen tilnærming til å analysere InsPs benytter nedtrekk av InsPs fra cellelylater ved hjelp av TiO2 perler, etterfulgt av polyakrylamid gel elektroforese (PAGE) av de eluted InsPs. InsPs kan deretter farges av enten toluidin blå eller DAPI24,28,29. Det er imidlertid så langt ikke mulig å pålitelig oppdage InsPs lavere enn InsP5 fra planteekstrakter ved hjelp av denne metoden. Nylig ble en metode ved hjelp av [13C]-myo-inositol for kjernemagnetisk resonansanalyse (NMR) analyse av InsPs publisert som et alternativ til sterk anionutveksling med høy ytelse flytende kromatografi (SAX-HPLC)30. Denne teknikken har blitt rapportert å oppnå en lignende følsomhet sammenlignet med SAX-HPLC og for å tillate påvisning av 5-InsP7, samt diskriminering av ulike ikke-enantiomeriske InsP5 isomers fra celleekstrakter. Implementeringen av den NMR-baserte metoden krever imidlertid kjemisk syntetisert og kommersielt ikke tilgjengelig [13C]-myo-inositol. Derfor er metoden som brukes i de fleste tilfeller radiolabeling prøver med [3H]-myo-inositol, etterfulgt av SAX-HPLC31,32,33. Denne teknikken er basert på myoopptaket av radioaktiv myo-inositol i anlegget og dens konvertering til forskjellige InsPs av den kombinerte aktiviteten til dedikerte cellulære kinaser og fosfataser.
[3H]-merkede InsP-er blir deretter syreutpakket og fraksjonert ved hjelp av SAX-HPLC. På grunn av deres negative ladning samhandler InsPs sterkt med den positivt ladede stasjonære fasen av SAX-HPLC-kolonnen, og kan eluted med en buffergradient som inneholder økende fosfatkonsentrasjoner for å utkonkurrere InsPs fra kolonnen. Elution ganger dermed avhengig av ladning og geometri av InsP arter som skal skilles. I fravær av kiralkolonner kan bare ikke-enantiomeriske isomers ved atskilt med denne protokollen. Imidlertid kan radiomerkede standarder brukes til å tildele den inoiske naturen til en bestemt InsP-topp. Flere anstrengelser i det siste av ulike laboratorier for å generere merkede og umerkede standarder med (bio) kjemiske metoder eller å rense dem fra ulike celler og organismer har bidratt til å tildele topper til visse InsP-arter, og også for å begrense den inoiske identiteten til individuelle InsParter 5,7,21,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Også den nylige belyselsen av enzymatiske veier som fører til dannelsen av PP-InsPs i planter, samt oppdagelsen av en bakteriell type III-effektor med en bestemt 1-phytase aktivitet, gi informasjon om hvordan du genererer nyttige standarder for disse analysene10,17,18,22,23.
De resulterende fraksjonene kan måles i en flytende scintillasjonsteller på grunn av β tritium (3H). Med økende merkingstid nås en steady-state isotopisk likevekt, hvorav de oppnådde InsP-profilene skal representere InsP-statusen til anlegget31. Den største fordelen med denne protokollen i forhold til andre tilgjengelige teknikker er den høye følsomheten oppnådd ved bruk av den direkte forløperen for InsPs og måling av et radioaktivt signal.
SAX-HPLC av prøver hentet fra [3H]-myo-inositol-merkede planter eller andre organismer brukes ofte til deteksjon og kvantifisering av InsP-er som spenner fra lavere InsP-arter til PP-InsPs, som representerer et verdifullt verktøy for å bedre forstå metabolismen, funksjonen og virkningsmekanismene til InsPs. Så langt er denne metoden også det mest hensiktsmessige valget for forskere med spesiell interesse for lavere InsP-arter. Mens det grunnleggende i denne prosedyren, som protokollen beskrevet her bygger på, har tidligere blitt beskrevet7,21,31,,34, en detaljert protokoll skreddersydd for analyse av plante-avledede InsP og spesielt av PP-InsPs mangler fortsatt. Tidligere publikasjoner rapporterte vanskeligheter med å pålitelig oppdage de lave rikelig PP-InsPs, spesielt InsP8, på grunn av en eller flere av følgende faktorer: relativt lave mengder plantemateriale, [3H]-myo-inositol med lav spesifikk aktivitet (> 20 Ci/mmol), bruk av ekstraksjonsbuffere som enten ikke er basert på perklorsyre eller er mindre konsentrert enn 1 M, forskjellige nøytraliserende buffere, samt sub-optimale gradienter eller påvisning av [3H] med en on-line detektor. I forhold til disse studiene er protokollen som presenteres her designet for pålitelig deteksjon av PP-InsPs7,21,34.
Her presenterer vi en detaljert arbeidsflyt, fra oppsettet av utstyret til plantedyrking og merking, InsP-ekstraksjon og SAX-HPLC kjører seg selv. Selv om metoden ble optimalisert til modellanlegget A. thaliana, kan den enkelt endres for å studere andre plantearter, som vist her med den første rapporterte InsP-profilen til modellen legume Lotus japonicus. Selv om bruk av en annen planteart kan kreve en viss optimalisering, ser vi for oss at de vil være mindre, noe som gjør denne protokollen til et godt utgangspunkt for videre forskning i planteinspene. For å lette mulige optimaliseringer angir vi hvert trinn i protokollen der endringer er mulige, samt alle kritiske skritt som kan være utfordrende når du etablerer metoden for første gang. I tillegg rapporterer vi hvordan data innhentet av denne metoden kan brukes til kvantifisering av bestemte Insp-er og hvordan ulike prøver kan analyseres og sammenlignes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>model: 5430 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diammonium hydrogen phosphate, &#8805;97 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0268.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, &#8805;99 %, p.a., ACS</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>LAMBDA Instruments GmbH</td>
			<td>model: OMNICOLL single channel collector</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth incubator</td>
			<td>poly klima GmbH</td>
			<td>model: PK 520-LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC pumps</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector for HPLC</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>model: Rheodyne 9725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol, myo-[1,2-3H(N)]</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals Inc.</td>
			<td>ART 0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>University, Chemistry Department</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>model: TRI-CARB 2900TR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pestle</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>CXH7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 &#181;m pore size, 47 mm circle</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>10401770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer for HPLC</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: M 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium, salt mixture</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro software</td>
			<td>OriginLab Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthophosphoric acid, &#8805;85 %, p.a., ISO</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>6366.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partisphere 5 &#181;m SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4621-0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile</td>
			<td>Greiner Bio One International GmbH</td>
			<td>688161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-indicator paper pH 5.5 - 9.0, Neutralit</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>109564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>P743.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>57648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL</td>
			<td>Simport Scientific Inc.</td>
			<td>S207-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench</td>
			<td>LaboGene</td>
			<td>model: ScanLaf MARS 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, &#8805;99,5 %, p.a.</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>6013599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure deionized water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrenchless WVS End Fitting Kit</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4631-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc

Fosfat estere av myomyo-inositol, også be begrep inositol fosfater (InsP), er en klasse av cellulære regulatorer spiller viktige roller i plantefysiologi. På grunn av deres negative ladning, lav overflod og mottakelighet for hydrolytiske aktiviteter, er påvisning og kvantifisering av disse molekylene utfordrende. Dette gjelder spesielt for svært fosforylerte former som inneholder "høyenergi" difosfobindinger, også befalt inositol pyrofosfater (PP-InsPs). På grunn av sin høye følsomhet, sterk anion utveksling høy ytelse flytende kromatografi (SAX-HPLC) av planter merket med [3H]-myo-inositol er for tiden metoden for valg for å analysere disse molekylene. Ved å bruke [3H]-myo-inositol til radiolabel planteplanter, kan ulike InsP-arter, inkludert flere ikke-enantiomeriske isomers oppdages og diskrimineres med høy følsomhet. Her er oppsettet av et egnet SAX-HPLC-system beskrevet, samt den komplette arbeidsflyten fra plantedyrking, radiomerking og InsP-ekstraksjon til SAX-HPLC-kjøring og påfølgende dataanalyse. Protokollen som presenteres her tillater diskriminering og kvantifisering av ulike InsP-arter, inkludert flere ikke-enantiomeriske isomers og av PP-InsPs, InsP7 og InsP8, og kan enkelt tilpasses andre plantearter. Som eksempler utføres SAX-HPLC-analyser av Arabidopsis thaliana og Lotus japonicus frøplanter, og komplette InsP-profiler presenteres og diskuteres. Metoden som er beskrevet her representerer et lovende verktøy for å bedre forstå insps biologiske roller i planter.

Resultatene som vises her tar sikte på å illustrere mulige resultater oppnådd i henhold til variasjoner på teknisk og biologisk nivå. Den første eksemplifiseres ved hjelp av nye versus eldre kolonner (figur 1) og ferske versus lagrede prøver (figur 3), og den andre ved å evaluere ekstrakter fra to forskjellige plantesystemer, A. thaliana (figur 1, figur 3) og L. japonicus (figur 2).
En optimal SAX-HPLC-kjøring er avbildet på figur 1A\u2012C, som viser et komplett inositol polyfosfatspektrum hentet fra A. thaliana ekstrakter etter scintillation telling. Merk at topper er pent separert og kan tildeles forskjellige isomers (eller enantiomer-par) basert på kromatografiske mobiliteter beskrevettidligere 5,7.
Figur 2 viser det representative resultatet av en SAX-HPLC-analyse av L. japonicus frøplanter som ble dyrket og merket under samme forhold som Arabidopsis frøplanter. Mens antagelig alle InsP arter og topper som er kjent fra Arabidopsis kan sees, det er betydelige forskjeller om den relative (f.eks, forholdet mellom isomers) mengde spesifikke InsP isomers, når du sammenligner profiler av begge arter. For eksempel viste Lotus-ekstraktene økt InsP3c,InsP4b, InsP5b og redusert InsP3a, InsP4a, InsP5a og InsP5c sammenlignet med Arabidopsis som gir rom for videre undersøkelser. Figur 2D illustrerer de forskjellige forholdene mellom InsP isomers mellom Arabidopsis og Lotus.
Figur 3 viser to InsP-profiler for en prøve som ble delt etter utvinningen. Første halvdel ble umiddelbart analysert og andre halvdel en dag senere, etter lagring ved -80 °C. Vær oppmerksom på at det bare observeres mindre forskjeller mellom de ulike prøvene (dvs. svarte og røde linjer på figur 3A\u2012Cog figur 3D). Dette illustrerer at en fryse-tine syklus ikke skade prøven, og at metoden i seg selv genererer reproduserbare resultater.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig01.jpg"> Figur 1: Typisk InsP-profil for en vellykket og mislykket SAX-HPLC-analyse utført med denne protokollen. (A\u2012C) SAX-HPLC-profil av 17-dagers villtype (Col-0) Arabidopsis frøplanter radiomerket med [3H]-myo-inositol. Global InsP-ekstraksjon og SAX-HPLC-kjøring ble utført samme dag. (A) Full spektra; (B, C) Zoom-inn-inn-til-profilen som vises i A. Alle synlige topper er uthevet og tildelt de tilsvarende InsP-artene. Basert på publiserte kromatografiskemobiliteter 5,7, Representerer InsP4a sannsynligvis Ins (1,4,5,6) P4 eller Ins (3,4,5,6) P4, InsP5a representerer InsP5 [2-OH], InsP5b representerer InsP5 [4-OH] eller dens enantiomeriske form InsP5 [6-OH], og InsP5c representerer InsP5 [1-OH] eller dens enantiomeriske form InsP5 [3-OH]. Den inoiske naturen til InsP3a-c, InsP4b, InsP7og InsP8 er fortsatt ukjente. Panel (D) viser en SAX-HPLC-profil av identisk dyrkede planter, men ved hjelp av en alderen kolonne (> 40 kjører). En klar reduksjon av InsP6 sammenlignet med andre InsP-arter og fraværet av PP-InsPs er synlig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2.jpg"> Figur 2: Representativ InsP-profil av L. japonicus-planter.  SAX-HPLC-profil (A\u2012C) av 17-dagers villtype (Gifu) L. japonicus frøplanter radiomerket med [3H]-myo-inositol. (A) Full spektra; (B, C) Zoom-inn-inn-til-profilen som vises i A. Alle synlige topper er uthevet og tildelt de tilsvarende InsP-artene. Basert på publiserte kromatografiskemobiliteter 5,7, InsP4a representerer sannsynligvis Ins (1,4,5,6) P4 eller Ins (3,4,5,6) P4, InsP5b representerer sannsynligvis InsP5 [4-OH] eller dens enantiomeriske form InsP5 [6-OH], og InsP5c representerer sannsynligvis InsP5 [1-OH] eller dens enantiomeriske form InsP5 [3-OH]. De inoiske natur InsP3a-c, InsP4b,InsP7, og InsP8 er ukjent. (D)Sammenligning mellom de enkelte InsP-artene (i % av total aktivitet fra elution 25\u201296) av A. thaliana (data fra figur 1A\u2012C) og L. japonicus (data fra figur 2A–C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig03.jpg"> Figur 3: InsP-profiler av en delt prøve som illustrerer reproduserbarheten til SAX-HPLC-analyser. (A\u2012C) SAX-HPLC-profiler av 17-dagers gammel villtype (Col-0) Arabidopsis frøplanter radiomerket med [3H]-myo-inositol. Før løpet ble prøven delt og den ene halvdelen kjøres umiddelbart og den andre halvparten en dag senere etter lagring ved -80 °C.(A) Full spektra; (B, C) Zoom-inn-inn-til-profilen som vises i A. Alle synlige topper er uthevet og tildelt de tilsvarende InsP-artene. Basert på publiserte kromatografiskemobiliteter 5,7, Representerer InsP4a sannsynligvis Ins (1,4,5,6) P4 eller Ins (3,4,5,6) P4, InsP5a representerer InsP5 [2-OH], InsP5a representerer InsP5 [2-OH], InsP5b representerer InsP5 [4-OH] eller dens enantiomeriske form InsP5 [6-OH], og InsP5c representerer InsP5 [1-OH] eller dens enantiomeriske form InsP5 [3-OH]. Den inoiske naturen til InsP3a-c, InsP4b, InsP7og InsP8 er fortsatt ukjente. Panel D viser kvantifiseringen av InsP6 og PP-InsPs InsP7 og InsP8 av begge kjører. Verdiene representerer beløpet (i %) av de respektive InsP-artene i forhold til alle InsP (total aktivitet fra elution 25–96). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Supplerende figur 1: Programvareinnstillinger for flytende scintillation telling ved hjelp av en lett scintillation teller. Skjermbilder som viser programvareversjonen, samt innstillinger som brukes til scintillation telling av [3H] prøver utført med denne protokollen er avbildet. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig01.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.</a>
Tilleggstall 2: Representativt eksempel på data normalisering. Et skjermbilde av et regneark viser alle trinn og formler som brukes til å normalisere SAX-HPLC kjører til hverandre. For forenkling vises bare brøkdeler 25–35 av prøvene. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig02.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.</a>
Tilleggs figur 3: Toppbestemmelse, subtraksjon i bakgrunnen og integrering ved hjelp av analyseprogramvare. (A) Data fra SAX-HPLC-analysen lastes inn i programvaren (minutter 28–96), og toppanalysatorverktøyet er valgt. (B\u2012E) Grunnlinjen defineres manuelt ved å angi punkter mellom individuelle topper, og bakgrunnen trekkes fra. (F) Topper bestemmes manuelt basert på utseende og publiserte kromatografiske mobiliteter5,7. (G) Toppområder defineres manuelt av cpm-verdier. (H) Topper er integrert og beregnet som % av alle topper. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig03.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC at JoVE.com

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

Her beskriver vi sterk anionutveksling med høy ytelse flytende kromatografi av [3H]-myo-inositol-merkede frøplanter som er en svært følsom metode for å oppdage og kvantifisere inositol polyfosfater i planter.

Ekstraksjon og kvantifisering av løselige, radiomerkede inositolpolyfosfater fra forskjellige plantearter ved hjelp av SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

Protokollen demonstrert her kan bidra til å belyse biosyntesen av inositol polyfosfater av planter og å svare på spørsmål om deres rolle i visse aspekter av plantemetabolisme og utvikling. Denne metoden er svært følsom fordi bruken av den radioaktivt merkede forløperen til inositolfosfater gir pålitelig påvisning av alle inositolfosfatarter i planter. Visuell demonstrasjon av denne metoden er viktig fordi de fleste plantebiologer ikke er kjent med HPLC-analyse og nødvendig oppsett.I tillegg er kritiske trinn i denne protokollen, som utvinning av inositolfosfater, vanskelige å følge uten riktig demonstrasjon. Begynn med å sette opp et system bestående av to uavhengige HPLC-pumper, en for buffer A og én for buffer B.Begge pumpene må styres sammen via en datamaskin eller en hovedpumpe. Implementer en stempeltetningsvask for begge pumpene, enten via gravitasjonskraft eller gjennom en tredje lavtrykkspumpe.Koble begge pumpene til en dynamisk mikser, og koble deretter mikseren til en injeksjonsventil med en prøvesløyfe som har minst én milliliter kapasitet. Bruk kapillærer til å koble injeksjonsventilen til kolonnen og kolonnen til brøkoppsamleren. Så ut lotusfrø i en rad på firkantede Petri-retter fylt med solide vekstmedier bestående av 0,8% bakteriologisk agar i deionisert vann.La frøene stratifisere i minst tre dager ved fire grader Celsius i mørket. Legg frøene i en vekst inkubator. Overfør 10 til 20 frøplanter til en brønn av en 12-brønns klar flat bunncellekulturplate fylt med to milliliter halvfast MS saltløsning som suppleres med 1% sukrose og justert til pH 5.7.Tilsett 45 mikrokurie av 3H myo-inositol til platen og virvle den forsiktig. Dekk platen med et lokk og forsegle den med mikroporøs kirurgisk tape. Plasser den deretter tilbake i vekstinkubatoren.Etter fem dager med merking, fjern frøplanter fra media og vask dem kort med deionisert vann. Tørk dem med papirhåndklær og overfør dem til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør, og pass på at du ikke overfyller røret. Fest røret i flytende nitrogen og oppbevar det på minus 80 grader Celsius til ekstraksjon.Ta prøvene fra fryseren og hold dem i flytende nitrogen til de er klare til bruk. Grind dem med en mikrocentrifuge tube pestle til de begynner å tine, og legg deretter til 500 mikroliter iskald ekstraksjonsbuffer. Fortsett slipingen til prøven er homogenisert og løsningen er farget.Sentrifuger prøvene i 10 minutter ved 18 000 ganger G og fire grader Celsius. Overfør deretter supernatanten til et friskt 1,5 milliliter rør. Rørene som brukes til utvinning anses som fast radioaktivt avfall og må kastes tilsvarende.Tilsett nøye 300 mikroliter nøytraliseringsbuffer til ekstraktet, noe som umiddelbart vil føre til nedbør av proteiner og boblende. Etter et minutt blander du prøven med en pipettespiss og pipette fem mikroliter på pH-papir for å forsikre deg om at pH-en er mellom syv og åtte. Tilsett eventuelt små mengder nøytraliseringsbuffer eller ekstraksjonsbuffer til ønsket pH er nådd og la prøvene hvile på is i minst en time med åpent lokk.Sentrifuger dem i 10 minutter og overfør supernatanten til et friskt 1,5 milliliter rør. Utstyr fraksjonssamleren med 96 små scintillation hetteglass og fyll hvert hetteglass med to milliliter av en passende scintillation cocktail som er kompatibel med lave pH-buffere og høye ammoniumfosfatkonsentrasjoner. Start HPLC-systemet, og aktiver deretter stempeltetningsvasken og hold den aktivert under hele kjøringen.Injiser prøven manuelt med en passende sprøyte. Start pumpene og graderingen. Mens HPLC-kjøringen pågår, må du kontrollere trykket regelmessig.Starttrykket skal være rundt 18 til 24 bar og bør sakte stige til 50 til 60 bar når 100% buffer B er nådd. Etter løpet, lukk hetteglassene tett og kraftig riste brøkene med scintillation cocktail å blande. Hvis du ikke fortsetter direkte med målingen, må hetteglassene holdes oppreist i mørket.For å måle brøkene, sett hetteglassene inn i scintillation-tellerstativene ved hjelp av stativer som passer til de små hetteglassene og måler hvert hetteglass i fem minutter i en flytende scintillasjonsteller. Klargjør et 2D-linjediagram der de målte tellingene per minutt eller CPM tegnes inn mot oppbevaringstiden. Hvis du vil sammenligne eksempler med hverandre, normaliserer du dataene ved å summere CPM fra hver utskjøde brøk fra minutt 25 til 96 for hvert enkelt utvalg og ved å dele den totale CPM fra det utvalget med den totale CPM-en for de andre prøvene.For å utføre relative kvantifiseringer av visse inositol polyfosfattopper og deretter opprette stolpegrafer som inneholder data om replikeringer for statistiske analyser, fortsett analysen med en spesialisert programvare som kan beregne toppområder av kromatrammer. Et komplett inositol polyfosfatspektrum hentet fra A.thaliana ekstrakter etter scintillation telling er vist her. Toppene er pent separert og kan tildeles forskjellige isomers.Når en eldre kolonne brukes, er en klar reduksjon av inositol hexakisfosfat og fraværet av inositol pyrofosfat synlig. SAX-HPLC-analysen ble også utført på L.japonica frøplanter som ble dyrket og merket under samme forhold som Arabidopsis frøplanter. Mens antagelig alle inositol polyfosfat arter og topper som er kjent fra Arabidopsis kan sees, det er forskjeller i de relative mengder av spesifikke inositol polyfosfat isomers mellom de to artene.For å demonstrere at prøver ikke trenger å analyseres umiddelbart etter ekstraksjon, ble en prøve delt i to og halvparten av det ble analysert neste dag etter lagring på minus 80 grader Celsius. Forskjellene mellom SAX-HPLC-profilene til de ferske og frosne prøvene var ikke signifikante, noe som viste at en frysetinesyklus ikke skader prøven, og at selve metoden genererer reproduserbare resultater. Når du prøver denne protokollen, må du alltid slipe prøvene grundig, frosset og med ekstraksjonsbuffer, og ta sikte på nær nøytral pH etter nøytralisering for å sikre maksimal gjenoppretting av radiomerket inositolfosfat for SAX-HPLC-analyse.Det er mulig å rense radiomerket fra en SAX-HPLC-kjøring for senere bruk, for eksempel i gjensidige reaksjoner ved å samle fraksjoner uten scintillation cocktailer og måle bare små aliquots.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Experimental Design for Laser mikrodisseksjon RNA-Seq: Lærdommer fra en analyse av Mais Leaf Development

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

En enkel fraksjonert ekstraksjonsmetode for den omfattende analysen av metabolitter, lipider og proteiner fra en enkelt prøve

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA Interactome Capture fra Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolasjon og respiratoriske målinger av mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fraksjoneres for løsning av løselig og uløselig Huntingtin arter

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Blad Spray massespektrometri: En rask Ambient ionisering teknikk å vurdere direkte metabolitter fra anlegget vev

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Koffein utvinning, enzymatisk aktivitet og genuttrykk av koffein syntase fra anlegget celle suspensjoner

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruke i Vitro fluorescens resonans energioverføring å studere dynamikken i Protein komplekser på et millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

RNA Blot Analyse for deteksjon og kvantifisering av plante microRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Estimering av plantebiomasse Lignin-innhold ved bruk av thioglykolsyre (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...