Name: extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc
Uploaded: 2020-06-26T15:00:00
Duration: 9 min 1 s
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Este trabalho foi financiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) sob a Estratégia de Excelência da Alemanha - EXC-2070 - 390732324 (PhenoRob), o Grupo de Treinamento de Pesquisa GRK2064 e bolsas de pesquisa individuais SCHA1274/4-1 e SCHA1274/5-1 para a G.S.. Agradecemos também li Schlüter e Brigitte Ueberbach por assistência técnica.

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui apresentamos um método versátil e sensível para quantificar o InsPs, incluindo PP-InsPs em extratos vegetais e fornecer dicas práticas sobre como estabelecer esse método. Embora o protocolo seja geralmente robusto, corridas e análises subótimas podem ocorrer. Na maioria dos casos, essas corridas podem ser identificadas por uma forte redução ou até mesmo perda completa de InsPs altamente fosforiladas, especialmente as espécies PP-InsP InsP7 e InsP8. As possíveis razões podem ser contaminações microbianas do material vegetal e desativação insuficiente das hidrolases pp-insp da planta endógena durante a extração devido à moagem e degelo insuficientes de material vegetal que não estará em contato imediato com o tampão de extração. Outras razões incluem ajuste de pH impreciso por adição insuficiente ou excessiva de tampão de neutralização, ou simplesmente material amostral insuficiente. Este último pode dificultar a detecção de PP-InsPs, uma vez que muitas vezes estão presentes em quantidades muito baixas nas células. Um excesso de material amostral ou secagem ineficiente durante a etapa 3.5 pode causar diluição do ácido polemóico, levando também à desativação insuficiente da enzima e a uma perda específica de InsP6 e PP-InsPs. A quantidade de material vegetal, bem como o rótulo de rádio utilizado neste protocolo foram otimizados com base em custos e desempenho, e, portanto, é próximo do menor valor que ainda é suficiente para fornecer resultados ótimos. Além disso, a resina da coluna perderá gradualmente sua capacidade de resolução. O primeiro sinal desse processo é (por razões não totalmente claras para os autores) uma perda específica de espécies insp mais fosforiladas como as PP-InsPs no espectro HPLC. Com mais envelhecimento, mesmo o InsP6 não será resolvido adequadamente pela coluna(Figura 1D). Portanto, o uso de uma coluna adequada, bem como o manuseio meticuloso da amostra e a manutenção adequada dos componentes HPLC é crucial para garantir resultados precisos.
Ao comparar amostras e corridas, especialmente quando geradas com diferentes equipamentos (por exemplo, sistemas e colunas HPLC) ou em dias diferentes, é crucial normalizar as amostras umas às outras (conforme descrito na etapa 7.3) e analisá-las da mesma forma. Somente através da normalização é possível e preciso mostrar múltiplas amostras no mesmo gráfico(Figura 3). Para quantificação de InsPs individuais relativos ao InsPs total, ou a outra espécie específica do InsP, não é necessário normalizar, desde que apenas valores relativos e não valores absolutos sejam mostrados. Idealmente, tanto os perfis insP quanto as quantificações são mostrados. No entanto, em alguns casos não é possível mostrar adequadamente duas ou mais corridas no mesmo gráfico. Diferentes tempos de retenção ou diferentes níveis de atividade de fundo podem dificultar a comparação apenas de perfis SAX-HPLC não quantificados. O mesmo é o verdadeiro quando muitas amostras precisam ser comparadas. Nesses casos, é necessária uma nova avaliação usando um software adicional (por exemplo, Origin) para quantificação de pico individual.
Os autores estão cientes de que o protocolo aqui descrito pode ser otimizado e precisa ser adaptado a cada questão de pesquisa individual. Apesar de ser otimizado para extratos arabidopsis 7,17 neste protocolo, este método é versátil e pode ajudar a determinar perfis insP de outras espécies vegetais também. Aqui exemplificamos essa possibilidade apresentando pela primeira vez um perfil insP para L. japonicus, que não exigiu modificações das condições de rotulagem, extração insP ou execução SAX-HPLC(Figura 2). Notavelmente, embora globalmente semelhantes, diferenças são observadas entre os perfis L. japonicus e Arabidopsis InsP. Por exemplo, em L. japonicus InsP5 [4-OH] ou sua forma esantiomerica InsP5 [6-OH] são mais abundantes do que InsP5 [1-OH] ou sua forma estérica InsP5 [3-OH] em comparação com arabidopsis, onde InsP5 [1-OH] ou sua forma enantiomerica InsP5 [3-OH] são as espécies insp5 dominantes. Da mesma forma, prevemos que alterações na composição da mídia, [3H]- concentraçãode mio-inositol, idade vegetal, condições ambientais (por exemplo, luz e temperatura), adição de compostos químicos ou análises de interações vegetais-microbianas, entre outros fatores, podem precisar ser testadas e adaptadas.
Uma desvantagem importante desse método que precisa ser considerado é que a rotulagem é feita em uma cultura líquida (estéril), que não representa um ambiente fisiológico para a maioria das plantas terrestres. Além disso, devido aos altos custos demyo[³H]- myo-inositol, o volume da solução de rotulagem e o tamanho do vaso cultural é geralmente limitado, o que também restringe o tamanho das plantas que podem ser utilizadas. O cultivo na cultura líquida pode ser evitado infiltrando-se diretamente, pormyoexemplo, folhas de plantas cultivadas no solo com [³H]- myo-inositol e, posteriormente, seguindo o protocolo aqui descrito, como relatado anteriormente10.
Existem várias desvantagens deste protocolo em comparação com métodos alternativos, como tiO2 pull-down seguido por técnicas baseadas em PAGE ou espectrometria de massa. Devido à rotulagemdemyo-inositol, apenas as espécies insP que se originam diretamente do myo-inositolradiolabeled serão detectadas no final.myo O método descrito aqui é cego para outros isômeros ins, como scyllo-inositol e outros isômeros alguns dos quais foram identificados em certas plantas44. Além disso, serão excluídos myo-InsPs derivados de outras vias, incluindo aquelas sintetizadas por de novo síntese de mio-inositol e mio-inositol-3-fosfato via isomerização de glicose-6-fosfato, catalisada por proteínas mio-inositol-3-fosfato (MIPS)45. myo Embora [32P] ou [33P]-ortopedia-fosfato possa ser usado como rótulos alternativos, seu uso representa uma grande desvantagem, uma vez que cada molécula contendo fosfato, incluindo os nucleotídeos abundantes e seus derivados, será rotulada. Essas moléculas também podem ser extraídas com este protocolo e se ligam à coluna SAX, o que resultará em um alto nível de atividade de fundo que interferirá na identificação dos picos insp individuais5. Além disso, a quantificação de [32P]- ou [33P] rotulado InsPs e PP-InsPs pode ser fortemente influenciada por fosfato e pifosfato moiety turnover e pode não relatar uma leitura em massa para espécies inositol.
Por outro lado, [3H]-myo-inositol especificamente rotula moléculas contendo mio-inositol. InsPs, lipídios contendo inositol, como fosforinositídeos, e galactinol são, neste caso, rotulados. No entanto, apenas os InsPs serão analisados com este protocolo, uma vez que os lipídios são insolúveis no tampão de extração e o galactinol não se liga à coluna SAX.
Até agora, as diferenças em relação ao perfil insp da planta gerada pela rotulagem inositoldemyo-inositol em comparação com uma determinada por TiO2 pulldown/PAGE permanecem desconhecidas, uma vez que tais comparações não foram realizadas em plantas.myo Um estudo recente em células animais abordou essa questão46. Nesse trabalho, foi identificada uma piscina de InsP6 invisível por [3H]- rotulagem myo-inositol, que deve ser diretamente derivada da glicose-6-fosfato, comparando-se perfis sax-HPLC com géis PAGE de linhas celulares de mamíferos.myo 24 h de fome de fosfato resultou em um aumento de 150% do InsP6 ao quantificar géis PAGE de InsPs purificados usando a retirada de TiO2. As análises sax-HPLC de [3H]-myo-inositol-labels cells que foram tratadas de forma idêntica apenas mostraram um aumento de 15% de [3H]-InsP6. Como mencionado anteriormente, os InsPs inferiores ao InsP5 são indetectáveis com a análise page na maioria dos casos. O radiolabeling seguido pelo SAX-HPLC parece ser o método de escolha, desde que os protocolos espectrométricos de massa não sejam otimizados para detectar esse grupo de moléculas altamente carregadas negativamente.
Outro desafio restante é distinguir os enantiomers nas análises sax-HPLC (ou em qualquer outro método de análise do INSS)10,17. Este desafio pode ser enfrentado pela adição de seletores quiral, ou seja, compostos de enantiopure como L-arginina amide que interagem com as respectivas moléculas egnâneas para formar complexos diastereomericos que podem ser separados10. Pelo que sabemos, essa abordagem só foi implementada para discriminar os isômeros InsP5 e InsP5 [1-OH] e InsP5 [3-OH] pelas análises NMR10. A discriminação de outros pares eantiomericos ou a discriminação bem-sucedida de enantiomers por análise quiral sax-HPLC ou métodos baseados em PAGE quiral ainda não foram relatados e devem ser desenvolvidos. Considerando a síntese conservada e a regulação conservada das PP-InsPs pela disponibilidade de fósforo, imaginamos que especialmente métodos não radioativos, como métodos baseados em PAGE ou MS, juntamente com análises de nutrientes, ajudarão os esforços de veracidade do solo para calibrar dados de sensoriamento remoto projetados para diagnosticar deficiências de nutrientes nas culturas17,,18,,24,,25. No entanto, o método aqui apresentado ainda pode ser considerado o padrão-ouro para análises do INSS e será fundamental para descobrir novas funções desses mensageiros intrigantes nas plantas.

Há quase quatro décadas, fosfatos inositol (InsPs) emergiram como moléculas de sinalização, depois que o Ins(1,4,5)P3 (InsP3) foi identificado como um segundo mensageiro que ativa a liberação mediada por receptores de Ca2+ em células animais1,,2. Até o momento, nenhum receptor InsP3 (IP3-R) foi identificado nas plantas, o que questiona um papel de sinalização direta para o InsP3 nas células vegetais3. Independentemente disso, o INSP3 serve como precursor para outros InsPs envolvidos em diversos processos de desenvolvimento de plantas, incluindo a regulamentação de vias de sinalização específicas3,,4,,5,,6,,7,,8. Por exemplo, o InsP3 pode ser ainda mais fosfoilado ao InsP6, também conhecido como "ácido fítico", que representa uma grande fonte de fosfato, mio-inositol e cáations, e foi mostrado para desempenhar papéis-chave na defesa vegetal contra patógenos, exportação de mRNA e homeostase fosfato5,9,,10,11,12.
Pirofosfatos inositol (PP-InsPs) são uma classe de InsPs que contêm pelo menos uma ligação di-fosfo de alta energia, inicialmente identificada em células animais, ameba e levedura, onde desempenham papéis críticos em diversos processos celulares13,,14,,15. Apesar do trabalho seminal em PP-InsPs nas plantas16,,17,,18,,19,20,21,22,23,,24,,25,,26,as funções biológicas e a identidade isômera dessas moléculas ainda permanecem em grande parte enigmáticas. Na planta modelo Arabidopsis thaliana, o InsP8 celular foi proposto para regular defesas contra herbívoros de insetos e fungos necrotróficos através da detecção de coincidência do InsP8 e jasmonato ativo pelo complexo receptor ASK1-COI1-JAZ17. Além disso, foram propostos papéis do INSP8 e de outras PP-InsPs em homeostase energética e sensoriamento de nutrientes, bem como homeostase fosfato17,23,24,,25,26.
Independentemente do sistema biológico empregado, um grande desafio metodológico ao estudar insPs tem sido a detecção confiável e quantificação precisa dessas moléculas. Métodos baseados em espectrometria de massa têm sido usados para detectar InsPs, incluindo PP-InsPs, a partir de extratos celulares. No entanto, esses estudos não conseguiram diferenciar isômeros distintos26,27. Outra abordagem para analisar o InsPs emprega a retirada de InsPs de lises celulares usando contas TiO2, seguida de eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) dos InsPs elucidos. Os InsPs podem então ser manchados por azul toluidina ou DAPI24,28,29. No entanto, até agora não é possível detectar insPs de forma confiável inferior ao InsP5 a partir de extratos vegetais usando este método. Recentemente, um método queutilizavaa análise de ressonância magnética nuclear (RMR) de ressonância magnética nuclear (RMN) foi publicado como alternativa à forte cromatografia líquida de alto desempenho (SAX-HPLC)30.myo Esta técnica tem sido relatada para alcançar uma sensibilidade semelhante em relação ao SAX-HPLC e permitir a detecção de 5-InsP7, bem como a discriminação de diferentes isômeros insp5 não enantiomericos de extratos celulares. No entanto, a implementação do método baseado em RMN requer quimicamente sintetizado e comercialmente não disponível [13C]-myo-inositol. Portanto, o método empregado na maioria dos casos é a radiolabelagem de amostras com [3H]-myo-inositol, seguido por SAX-HPLC31,32,33. Esta técnica baseia-se na myoabsorção de mio-inositol radioativo na planta e sua conversão em diferentes InsPs pela atividade combinada de quinases celulares dedicadas e fosfattases.
Os InsPs com etiqueta de3H são então extraídos com ácido e fracionados usando SAX-HPLC. Devido à sua carga negativa, os InsPs interagem fortemente com a fase estacionária positivamente carregada da coluna SAX-HPLC e podem ser elucidadas com um gradiente tampão contendo concentrações crescentes de fosfato para superar InsPs da coluna. Assim, os tempos de eluição dependem da carga e geometria das espécies insp a serem separadas. Na ausência de colunas quirais, apenas isômeros não enantióricos podem se separar por este protocolo. No entanto, os padrões de radiolabeled podem ser usados para atribuir a natureza isomeric de um pico insp específico. Múltiplos esforços no passado por vários laboratórios para gerar padrões rotulados e não rotulados com métodos (bio)químicos ou para purificá-los de várias células e organismos ajudaram a atribuir picos a determinadas espécies insP, e também reduzir a identidade isomerica das espécies insp individuais5,,7,21,34,35,36,37,38,,39,40,,41,42,43. Além disso, a recente elucidação de vias enzimáticas que levam à formação de PP-InsPs nas plantas, bem como a descoberta de um efeito bacteriano tipo III com uma atividade específica de 1-phytase, fornecem informações sobre como gerar padrões úteis para essas análises10,,17,,18,,22,,23.
As frações resultantes podem ser medidas em um contador de cintilação líquida devido à β-decadência do trítio(3H). Com o aumento do tempo de rotulagem, é alcançado um equilíbrio isotópico de estado estável, após o qual os perfis insP obtidos devem representar o status insP da planta31. A maior vantagem deste protocolo em comparação com outras técnicas disponíveis é a alta sensibilidade alcançada pelo uso do precursor direto para InsPs e a medição de um sinal radioativo.
Sax-HPLC de amostras extraídas de [3H]- plantas rotuladas de mio-inositol ou outros organismos é comumente usado para a detecção e quantificação de InsPs que vão desde espécies insP mais baixas até PP-InsPs, representando uma ferramenta valiosa para entender melhor o metabolismo, função e modos de ação do InsPs.myo Até agora, este método também é a escolha mais apropriada para pesquisadores com especial interesse em espécies insP mais baixas. Embora o básico deste procedimento, no qual o protocolo aqui descrito se baseia, tenha sido previamente descrito7,21,31,34, um protocolo detalhado adaptado à análise de InsPs derivados de plantas e especialmente de PP-InsPs ainda está faltando. Publicações anteriores relataram dificuldades para detectar de forma confiável as PP-InsPs baixas abundantes, especialmente o InsP8,devido a um ou mais dos seguintes fatores: quantidades relativamente baixas de material vegetal, [3H]-myo-inositol com baixa atividade específica (> 20 Ci/mmol), uso de buffers de extração que não são baseados em ácido polemónico ou são menos concentrados que 1 M, diferentes tampões neutralizantes, bem como gradientes sub-ideais ou detecção de [3H] com um detector on-line. Em comparação com esses estudos, o protocolo aqui apresentado destina-se à detecção confiável das PP-InsPs7,,21,34.
Aqui apresentamos um fluxo de trabalho detalhado, desde a configuração do equipamento até o cultivo e rotulagem da planta, extração insP e o próprio SAX-HPLC. Embora o método tenha sido otimizado para a planta modelo A. thaliana,ele pode ser facilmente modificado para estudar outras espécies vegetais, como mostrado aqui com o perfil insP relatado pela primeira vez do modelo leguminosa Lotus japonicus. Embora o uso de uma espécie de planta diferente possa exigir alguma otimização, prevemos que elas serão menores, tornando este protocolo um bom ponto de partida para novas pesquisas em InsPs vegetais. Para facilitar possíveis otimizações, indicamos cada passo dentro do protocolo em que as modificações são possíveis, bem como todas as etapas críticas que podem ser desafiadoras ao estabelecer o método pela primeira vez. Além disso, relatamos como os dados obtidos por este método podem ser utilizados para a quantificação de InsPs específicos e como diferentes amostras podem ser analisadas e comparadas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>model: 5430 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diammonium hydrogen phosphate, &#8805;97 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0268.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, &#8805;99 %, p.a., ACS</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>LAMBDA Instruments GmbH</td>
			<td>model: OMNICOLL single channel collector</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth incubator</td>
			<td>poly klima GmbH</td>
			<td>model: PK 520-LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC pumps</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector for HPLC</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>model: Rheodyne 9725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol, myo-[1,2-3H(N)]</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals Inc.</td>
			<td>ART 0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>University, Chemistry Department</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>model: TRI-CARB 2900TR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pestle</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>CXH7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 &#181;m pore size, 47 mm circle</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>10401770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer for HPLC</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: M 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium, salt mixture</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro software</td>
			<td>OriginLab Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthophosphoric acid, &#8805;85 %, p.a., ISO</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>6366.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partisphere 5 &#181;m SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4621-0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile</td>
			<td>Greiner Bio One International GmbH</td>
			<td>688161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-indicator paper pH 5.5 - 9.0, Neutralit</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>109564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>P743.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>57648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL</td>
			<td>Simport Scientific Inc.</td>
			<td>S207-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench</td>
			<td>LaboGene</td>
			<td>model: ScanLaf MARS 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, &#8805;99,5 %, p.a.</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>6013599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure deionized water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrenchless WVS End Fitting Kit</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4631-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc

Os ésteres fosfatos do mio-inositol, também denominados fosfatos inositol (InsPs), são uma classe de reguladores celulares desempenhando papéis importantes na fisiologia vegetal. Devido à sua carga negativa, baixa abundância e suscetibilidade às atividades hidrolíticas, a detecção e quantificação dessas moléculas é desafiadora. Este é particularmente o caso de formas altamente fosfoiladas contendo ligações difosfo 'de alta energia', também denominadas pirofosfatos inositol (PP-InsPs). Devido à sua alta sensibilidade, a forte cromatografia líquida de alto desempenho (SAX-HPLC) de plantas rotuladas com [3H]-myo-inositol é atualmente o método de escolha para analisar essas moléculas. Usando [3H]-myo-inositol para radiolabel planta mudas, várias espécies insP incluindo vários isômeros não-etéreoricos podem ser detectados e discriminados com alta sensibilidade. Aqui, descreve-se a configuração de um sistema SAX-HPLC adequado, bem como o fluxo de trabalho completo desde o cultivo da planta, a rotulagem de radiolabeling e a extração insP até a execução sax-HPLC e a análise subsequente de dados. O protocolo aqui apresentado permite a discriminação e quantificação de várias espécies do InsP, incluindo vários isômeros não enantióricos e das PP-InsPs, InsP7 e InsP8, e pode ser facilmente adaptado a outras espécies vegetais. Como exemplos, são realizadas e discutidas análises sax-HPLC de arabidopsis thaliana e lotus japonicus e perfis insP completos são apresentados e discutidos. O método aqui descrito representa uma ferramenta promissora para entender melhor os papéis biológicos dos InsPs nas plantas.

Os resultados aqui apresentados visam ilustrar possíveis desfechos obtidos de acordo com variações nos níveis técnico e biológico. A primeira é exemplificada por análises utilizando colunas novas versus envelhecidas(Figura 1) e amostras frescas versus armazenadas(Figura 3),e a segunda pela avaliação de extratos de dois sistemas vegetais diferentes, A. thaliana (Figura 1, Figura 3) e L. japonicus (Figura 2).
Uma execução SAX-HPLC ideal é retratada na Figura 1A\u2012C,que mostra um espectro de polifosfato inositol completo obtido a partir de extratos de A. thaliana após a contagem de cintilação. Observe que os picos são bem separados e podem ser atribuídos a diferentes isômeros (ou pares de enantiomer) com base em mobilidades cromatográficas descritas anteriormente5,,7.
A Figura 2 mostra o resultado representativo de uma análise sax-hplc das mudas L. japonicus que foram cultivadas e rotuladas nas mesmas condições das mudas arabidopsis. Embora, presumivelmente, todas as espécies insp e picos que são conhecidos a partir de Arabidopsis possam ser vistos, há diferenças substanciais em relação à quantidade relativa (por exemplo, entre isômeros isômeros específicos do InsP), ao comparar os perfis de ambas as espécies. Por exemplo, os extratos de Lótus apresentaram aumento do InsP3c, InsP4b, InsP5b e reduzido InsP3a, InsP4a,InsP5a e InsP5c em comparação com Arabidopsis, o que deixa espaço para novas investigações. A Figura 2D ilustra as diferentes proporções entre isômeros insp entre Arabidopsis e Lotus.
A Figura 3 mostra dois perfis insp de uma amostra que foi dividida após a extração. O primeiro tempo foi imediatamente analisado e o segundo tempo um dia depois, após armazenamento a -80 °C. Observe que apenas pequenas diferenças são observadas entre as diferentes amostras (ou seja, linhas pretas e vermelhas na Figura 3A\u2012C, e Figura 3D). Isso ilustra que um ciclo de congelamento não prejudica a amostra e que o próprio método gera resultados reprodutíveis.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig01.jpg"> Figura 1: Perfil típico do InsP de uma análise sax-HPLC mal sucedida realizada com este protocolo. (A\u2012C) Perfil SAX-HPLC de 17 dias de idade wild-type (Col-0) mudas arabidopsis radiolabeled com [3H]-myo-inositol. A extração global do INSP e a execução do SAX-HPLC foram realizadas no mesmo dia. (A) Espectro completo; (B, C) Zoom-ins do perfil mostrado em A. Todos os picos visíveis são destacados e atribuídos às espécies insp correspondentes. Com base nas mobilidades cromatográficas publicadas5,7, InsP4a provavelmente representa Ins(1,4,5,6)P4 ou Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a representa InsP5 [2-OH], InsP5b representa InsP5 [4-OH] ou sua forma enantiomerica InsP5 [6-OH], e InsP5c representa InsP5 [1-OH] ou sua forma enantiomerica InsP5 [3-OH]. As naturezas isomeric do InsP3a-c, InsP4b, InsP7e InsP8 ainda são desconhecidas. O painel (D) mostra um perfil SAX-HPLC de plantas cultivadas de forma idêntica, mas usando uma coluna envelhecida (>40 corridas). Uma clara redução do InsP6 em comparação com outras espécies do InsP e a ausência de PP-InsPs é visível. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2.jpg"> Figura 2: Perfil representativo do INSP das plantas L. japonicus.  Perfil SAX-HPLC (A\u2012C) de 17 dias de idade wild-type (Gifu) L. japonicus mudas radiolabeled com [3H]-myo-inositol. (A) Espectro completo; (B, C) Zoom-ins do perfil mostrado em A. Todos os picos visíveis são destacados e atribuídos às espécies insp correspondentes. Com base nas mobilidades cromatográficas publicadas5,7, InsP4a provavelmente representa Ins(1,4,5,6)P4 ou Ins(3,4,5,6)P4, InsP5b provavelmente representa InsP5 [4-OH] ou sua forma enantiomemérica InsP5 [6-OH], e InsP5c provavelmente representa InsP5 [1-OH] ou sua forma enantiomerica InsP5 [3-OH]. As naturezas isomeric de InsP3a-c, InsP4b, InsP7e InsP8 são desconhecidas. (D) Comparação entre as espécies insp individuais (em % da atividade total da elução 25\u201296) de A. thaliana (dados da Figura 1A\u2012C) e L. japonicus (dados da Figura 2A-C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig03.jpg"> Figura 3: Perfis insp de uma amostra dividida ilustrando a reprodutibilidade das análises SAX-HPLC. (A\u2012C) Perfis SAX-HPLC de 17 dias de idade wild-type (Col-0) mudas arabidopsis radiolabeled com [3H]-myo-inositol. Antes da execução, a amostra foi dividida e metade executada imediatamente e a outra metade um dia depois após o armazenamento a -80 °C.(A) Espectro completo; (B, C) Zoom-ins do perfil mostrado em A. Todos os picos visíveis são destacados e atribuídos às espécies insp correspondentes. Com base nas mobilidades cromatográficas publicadas5,7, InsP4a provavelmente representa Ins(1,4,5,6)P4 ou Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a representa InsP5 [2-OH], InsP5a representa InsP5 [2-OH], InsP5b representa InsP5 [4-OH] ou sua forma enantiomerica InsP5 [6-OH], e InsP5c representa InsP5 [1-OH] ou sua forma enantiomerica InsP5 [3-OH]. As naturezas isomeric do InsP3a-c, InsP4b, InsP7e InsP8 ainda são desconhecidas. O painel D mostra a quantificação do InsP6 e do INSS7 e do InsP8 de ambas as corridas. Os valores representam a quantidade (em %) das respectivas espécies insP relativas a todas as InsP (atividade total da elução 25-96). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Configurações de software para contagem de cintilação líquida usando um contador de cintilação leve. Capturas de tela que mostram a versão do software, bem como configurações usadas para a contagem de cintilação de [3H] amostras realizadas com este protocolo são retratadas. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig01.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar este número.</a>
Figura Suplementar 2: Exemplo representativo da normalização dos dados. Uma captura de tela de uma planilha mostra todas as etapas e fórmulas usadas para normalizar as corridas do SAX-HPLC entre si. Para simplificação, apenas frações 25-35 de amostras são mostradas. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig02.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar este número.</a>
Figura suplementar 3: Determinação de pico, subtração de fundo e integração usando software de análise. (A) Os dados da análise SAX-HPLC são carregados no software (minutos 28-96) e a ferramenta de analisador de pico é selecionada. (B\u2012E) A linha de base é definida manualmente por pontos de definição entre picos individuais e o fundo é subtraído. (F) Os picos são determinados manualmente com base na aparência e mobilidades cromatográficas publicadas5,,7. (G) As faixas de pico são definidas manualmente pelos valores do CPM. (H) Os picos são integrados e calculados como % de todos os picos. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig03.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar este número.</a>

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Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

Aqui descrevemos a forte cromatografia líquida de alta performance de [3H]- mio-inositol-labelelings que é um método altamente sensível para detectar e quantificar polifosfatos inositol em plantas.myo

Extração e Quantificação de Polifosfatos inositol solúveis e radiolabelados de diferentes espécies vegetais usando SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

O protocolo aqui demonstrado pode ajudar a elucidar a biossíntese de polifosfatos inositol das plantas e a responder perguntas sobre seu papel em certos aspectos do metabolismo e desenvolvimento das plantas. Este método é altamente sensível porque o uso do precursor radioativo de fosfatos inositol permite a detecção confiável de todas as espécies de fosfato inositol em plantas. A demonstração visual deste método é importante porque a maioria dos biólogos de plantas não está familiarizada com a análise do HPLC e a configuração necessária.Além disso, passos críticos deste protocolo, como a extração de fosfatos inositol, são difíceis de seguir sem demonstração adequada. Comece configurando um sistema composto por duas bombas HPLC independentes, uma para buffer A e outra para buffer B.Ambas as bombas precisam ser controladas juntas através de um computador ou de uma bomba mestre. Implemente uma lavagem de vedação de pistão para ambas as bombas, seja via força gravitacional ou através de uma terceira bomba de baixa pressão.Conecte ambas as bombas a um misturador dinâmico e conecte a batedeira a uma válvula de injeção com um laço de amostra que tenha pelo menos um mililitro de capacidade. Use capilares para conectar a válvula de injeção à coluna e à coluna ao coletor de frações. Semear sementes de lótus em uma fileira em pratos de Petri quadrados cheios de mídia de crescimento sólido consistindo de 0,8% de ágar bacteriológico em água deionizada.Permita que as sementes estratifiquem por pelo menos três dias a quatro graus Celsius no escuro. Coloque as sementes em uma incubadora de crescimento. Transfira de 10 a 20 mudas em um poço de uma placa de cultura de célula inferior plana de 12 poços, preenchida com dois mililitros de solução de sal MS de meia resistência que é suplementada com 1%de sacarose e ajustada para pH 5.7.Adicione 45 microcurie de 3H myo-inositol ao prato e gire-o suavemente. Cubra a placa com uma tampa e sele-a com fita cirúrgica microporosa. Em seguida, colocá-lo de volta na incubadora de crescimento.Após cinco dias de rotulagem, remova as mudas da mídia e lave-as brevemente com água deionizada. Seque-os com toalhas de papel e transfira-as para um tubo de microcentrífugo de 1,5 mililitro, certificando-se de não encher demais o tubo. Encaixe congelar o tubo em nitrogênio líquido e armazená-lo a menos 80 graus Celsius até a extração.Retire as amostras do congelador e mantenha-as em nitrogênio líquido até que estejam prontas para uso. Triture-os com um pilão de tubo de microcentrifuge até que comecem a descongelar, em seguida, adicione 500 microliters de tampão de extração gelada. Continue moendo até que a amostra seja homogeneizada e a solução seja colorida.Centrifugar as amostras por 10 minutos a 18.000 vezes G e 4 graus Celsius. Em seguida, transfira o supernasal para um tubo fresco de 1,5 mililitro. Os tubos utilizados para extração são considerados resíduos radioativos sólidos e precisam ser descartados em conformidade.Adicione cuidadosamente 300 microliters de tampão de neutralização ao extrato, o que causará imediatamente a precipitação de proteínas e borbulha. Após um minuto, misture a amostra com uma ponta de pipeta e pipeta cinco microliters no papel pH para ter certeza de que o pH está entre sete e oito. Se necessário, adicione pequenas quantidades de tampão de neutralização ou tampão de extração até que o pH desejado seja atingido e deixe as amostras descansarem no gelo por pelo menos uma hora com uma tampa aberta.Em seguida, centrifuá-los por 10 minutos e transferir o supernante para um tubo fresco de 1,5 mililitro. Equipar o coletor de frações com 96 pequenos frascos de cintilação e encher cada frasco com dois mililitros de um coquetel de cintilação adequado que é compatível com tampões de pH baixos e altas concentrações de fosfato de amônio. Inicie o sistema HPLC e, em seguida, ative a lavagem da vedação do pistão e mantenha-a ativada durante toda a execução.Injete manualmente a amostra com uma seringa adequada. Ligue as bombas e o gradiente. Enquanto a corrida do HPLC estiver em andamento, verifique a pressão regularmente.A pressão inicial deve ser em torno de 18 a 24 barras e deve subir lentamente para 50 a 60 bar uma vez que 100% tampão B é atingido. Após a corrida, feche os frascos com força e vigorosamente agite as frações com o coquetel de cintilação para misturar. Se não prosseguir diretamente com a medição, mantenha os frascos em posição vertical no escuro.Para medir as frações, insira os frascos nos racks do contador de cintilação usando racks que se encaixam nos frascos pequenos e meça cada frasco por cinco minutos em um contador de cintilação líquida. Prepare um gráfico de linha 2D onde as contagens medidas por minuto ou CPM são plotadas contra o tempo de retenção. Para comparar amostras entre si, normalize os dados somando o CPM de cada fração elucidada do minuto 25 ao 96 para cada amostra individual e dividindo o CPM total dessa amostra pelo CPM total das outras amostras.Para realizar quantificações relativas de certos picos de polifosfato inositol e, posteriormente, criar gráficos de barras que contenham dados de replicações para análises estatísticas, continue a análise com um software especializado que possa calcular áreas de pico de cromatógramas. Um espectro completo de polifosfato inositol obtido a partir de extratos de A.thaliana após a contagem de cintilação é mostrado aqui. Os picos são bem separados e podem ser atribuídos a diferentes isômeros.Quando uma coluna envelhecida é usada, uma clara redução do hexakisfosfato inositol e a ausência de pirofosfato inositol é visível. A análise sax-HPLC também foi realizada em mudas L.japonica que foram cultivadas e rotuladas nas mesmas condições das mudas arabidopsis. Embora presumivelmente todas as espécies de polifosfato inositol e picos conhecidos da Arabidopsis possam ser vistos, há diferenças nas quantidades relativas de isômeros de polifosfato inositol específicos entre as duas espécies.Para demonstrar que as amostras não devem ser analisadas imediatamente após a extração, uma amostra foi dividida em duas e metade foi analisada no dia seguinte após o armazenamento a menos 80 graus Celsius. As diferenças entre os perfis SAX-HPLC das amostras frescas e congeladas não foram significativas, demonstrando que um ciclo de congelamento não prejudica a amostra e que o próprio método gera resultados reprodutíveis. Ao tentar este protocolo, triture sempre as amostras completamente, congeladas e com tampão de extração, e almeire para o pH próximo ao pH neutro após a neutralização para garantir uma recuperação máxima do fosfato inositol rotulado por rádio para análise sax-HPLC.É possível purificar o rádio rotulado a partir de uma corrida SAX-HPLC para uso posterior, por exemplo, em reações mútuas, coletando frações sem coquetéis de cintilação e medindo apenas pequenas alíquotas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Projeto Experimental de Laser Microdissecção RNA-Seq: Lições de uma análise do desenvolvimento foliar do milho

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

Bioquímica

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Um Método de Extração Fracionada Simples para a Análise Abrangente de Metabolitos, Lípidos e Proteínas de uma única amostra

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Capacidade de interactomo do mRNA a partir de protoplastos de plantas

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolamento e medições respiratória de mitocôndrias de Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fracionamento para resolução das espécies de Huntingtin solúvel e insolúvel

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Espectrometria de massa folha Spray: Uma técnica de ionização ambiente rápida para avaliar diretamente a metabolitos de tecidos vegetais

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Extração de cafeína, atividade enzimática e expressão gênica de cafeína sintase de suspensões celulares de planta

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Usando na transferência de energia de ressonância de fluorescência de Vitro para estudar a dinâmica dos complexos de proteínas em uma escala de tempo de milissegundo

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

Análise de blot de RNA para detecção e quantificação de MicroRNAs vegetais

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Estimativa do Teor de Lignina de Biomassa Vegetal usando Ácido Tioglicólico (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...