Name: extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc
Uploaded: 2020-06-26T15:00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC at JoVE.com

Эта работа финансировалась Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) в рамках Стратегии передового опыта Германии - EXC-2070 - 390732324 (PhenoRob), Исследовательская учебная группа GRK2064 и индивидуальные исследовательские гранты SCHA1274/4-1 и SCHA1274/5-1 Г.С. Мы также благодарим Ли Шлятера и Брижит Убербах за техническую помощь.

Авторов нечего раскрывать.

Здесь мы представляем универсальный и чувствительный метод количественно InsPs в том числе PP-InsPs в растительных экстрактов и предоставить практические советы о том, как получить этот метод создан. Несмотря на то, что протокол, как правило, является надежным, могут происходить неоптимальные запуски и анализы. В большинстве случаев эти пробеги могут быть определены путем сильного сокращения или даже полной потери высоко фосфорилированных insPs, особенно PP-InsP видов InsP7 и InsP8. Возможными причинами могут быть микробное загрязнение растительного материала и недостаточная деактивация эндогенных гидролаз PP-InsP во время добычи из-за недостаточной шлифовки и оттаивания растительного материала, который не будет в непосредственном контакте с буфером добычи. Другие причины включают неточную корректировку рН из-за недостаточного или избыточного добавления буфера нейтрализации или просто недостаточного материала выборки. Последнее может сделать его трудным для обнаружения PP-InsPs, так как они часто присутствуют в очень низких количествах в клетках. Избыток пробного материала или неэффективная сушка во время шага 3.5 может привести к разбавлению перхлорной кислоты, что также приводит к недостаточной деактивации ферментов иконкретной потере InsP 6 и PP-InsPs. Количество растительного материала, а также радиолабеля, используемого в этом протоколе, были оптимизированы на основе затрат и производительности, и поэтому близки к наименьшему объему, которого все еще достаточно для обеспечения оптимальных результатов. Кроме того, смола столбца постепенно теряет свою емкость разрешения. Первым признаком этого процесса является (по причинам, не совсем понятным авторам) специфическая потеря более высоких фосфорилированных видов InsP, таких как PP-InsPs в спектре HPLC. При дальнейшем старении даже InsP6 не будет решен должным образом столбец(рисунок 1D). Поэтому использование адекватной колонки, а также тщательная обработка образца и надлежащее техническое обслуживание компонентов HPLC имеет решающее значение для обеспечения точных результатов.
При сравнении образцов и запусков, особенно при сгенерировании с различным оборудованием (например, системы и столбцы HPLC) или в разные дни, крайне важно нормализовать образцы друг с другом (как описано в шаге 7.3) и проанализировать их таким же образом. Только путем нормализации можно и точно показать несколько образцов на одном графике(рисунок 3). Для количественной оценки отдельных insPs относительно общего insPs, или к другому конкретному виду InsP, нет необходимости нормализовать, до тех пор, пока показаны только относительные значения, а не абсолютные значения. В идеале отображаются как профили InsP, так и количественные оценки. Однако в некоторых случаях невозможно адекватно показать два или более прогов на одном графике. Разное время удержания или различные уровни фоновой активности могут сделать его трудным для сравнения неколичественных профилей SAX-HPLC в одиночку. То же самое верно, когда многие образцы должны быть сопоставлены. В таких случаях необходима дальнейшая оценка с использованием дополнительного программного обеспечения (например, Origin) для индивидуальной пиковой количественной оценки.
Авторы знают, что описанный здесь протокол может быть оптимизирован и нуждается в адаптации к каждому отдельному исследовательскому вопросу. Хотя оптимизация для экстрактов Arabidopsis 7,17 в этом протоколе, этот метод является универсальным и может помочь определить InsP профилей других видов растений, а также. Здесь мы асмифицировать эту возможность, представляя в первый раз InsP профиль для L. japonicus, который не требует никаких изменений условий маркировки, InsP извлечения или SAX-HPLC перспективе (Рисунок 2). Примечательно, что в то время как в целом аналогичные, различия наблюдаются между L. japonicus и Arabidopsis InsP профилей. Например, в Л. japonicus InsP5 (4-OH) или его энантиометрическая форма InsP5 (6-OH) более обильны, чем InsP5 (1-OH) или его энантиомическая форма InsP5 «3-OH» по сравнению с Arabidopsis, где InsP5 (1-OH) или его энантиомеричная форма InsP5 (3-OH) являются доминирующими видами InsP5. Аналогичным образом, мы ожидаем, что изменения в составе средств массовой информации,3H - концентрация мио-инозитол, возраст растений, условия окружающей среды (например, свет и температура), добавление химических соединений или анализ растительно-микробных взаимодействий между другими факторами, возможно, должны быть проверены и адаптированы.myo
Одним из важных недостатков этого метода, который необходимо учитывать, является то, что маркировка делается в (стерильной) жидкой культуре, которая не представляет физиологическую среду для большинства наземных растений. Кроме того,из-завысокой стоимости мио-инозитол, объем маркировки раствора и размер культурного сосуда, как правило, ограничены, что также ограничивает размер растений, которые могут быть использованы. Культивирования в жидкой культуре можно избежать, непосредственно проникая, например,myoлистья почвенных растений с «3H» - мио-инозитол, а затем после протокола, описанного здесь, каксообщалось ранее 10.
Есть несколько недостатков этого протокола по сравнению с альтернативными методами, такими как TiO 2 выдвижнойследуют PAGE или масс-спектрометрии на основе методов. Из-замаркировки мио-инозитолов,только виды InsP, которые непосредственно происходят от радиозаклеевания мио-инозитол,будут обнаружены в конце концов. Метод, описанный здесь, слеп к другим изометерам Ins, таким как сцилло-инозитол и другие изомеры, некоторые из которых были выявлены в некоторыхрастениях 44. scyllo Кроме того, myoмио-InsPs, полученных из других путей будут исключены, в том числе синтеза де Ново мио-инозитол и мио-инозитол-3-фосфат через изомеризации глюкозы-6-фосфат, катализа мио-инозитол-3-фосфатный myoсинтез(MIPS) белки 45. myo myo Несмотря на то, что в качестве альтернативных меток можно использовать орто-фосфат32ПЗ илиortho33ПЗ, их использование представляет собой серьезный недостаток, поскольку каждая фосфатосодержащие молекулы, включая обильные нуклеотиды и их производные, будут маркироваться. Эти молекулы также могут быть извлечены с помощью этого протокола и связываться с колонкой SAX, что приведет к высокому уровню фоновой активности, которая будет мешать идентификации отдельных пиков InsP5. Кроме того, количественная оценка32 ПЗ-или 33ПЗ- помечены InsPs и PP-InsPs может быть сильно зависит от фосфатов и пирофосфата moiety оборота и не может сообщить о массовом считывании для инозитол видов.
С другой стороны,3H -мио-инозитолспециально этикеткимио-инозитол-содержащих молекул. InsPs, инозитол-содержащие липиды, такие как фосфоинозитиды, и галактинол в этом случае помечены. Тем не менее, только InsPs будут проанализированы с этим протоколом, так как липиды нерастворимы в буфере извлечения и галактинол не связывается с колонкой SAX.
До сих пор, различия от завода InsP профиль порожденных 3 H - мио-инозитол маркировки по сравнению с одним определяется TiO2 выдвижной / PAGE остается неизвестным, так кактакиесравнения не были выполнены в растениях.myo Недавнее исследование в клетках животных рассмотрел этот вопрос46. В этой работе, пул InsP6, который невидимна 3H - мио-инозитол маркировки, которые, таким образом, должны быть непосредственно получены из глюкозы-6-фосфат, был определен путем сравнения SAX-HPLC профилей с PAGE гели млекопитающих клеточных линий.myo 24 ч фосфатного голодания привело к 150% увеличение InsP6 при количественной оценке PAGE гели InsPs очищены с помощью TiO2 выдвижной. Анализ SAX-HPLCклеток,помеченныхmyoмио-инозитолом, которые рассматривались одинаково, показал только увеличение на 15%от 3H-InsP6. Как упоминалось ранее, InsPs ниже, чем InsP5 не обнаруживаются с анализом PAGE в большинстве случаев. Радиолабелирование с последующим SAX-HPLC, как представляется, метод выбора, до тех пор, как масс-спектрометрические протоколы не оптимизированы для обнаружения этой группы сильно отрицательно заряженных молекул.
Еще одна по-прежнему проблема заключается в том, чтобы различать энантиомеры в анализах SAX-HPLC (или в любом другом методе для анализа InsP)10,,17. Эта проблема может быть решена путем добавления хиральных селекторов, т.е. enantiopure соединений, таких как L-аргинин амида, которые взаимодействуют с соответствующими энантиометрических молекул для формирования диастереометрических комплексов, которые могут бытьразделены 10. К нашим знаниям, этот подход был реализован только для того, чтобы дискриминировать энантиометрическиеизомеры InsP5 (1-OH) и InsP5 (3-OH) по анализу NMR10. Дискриминация других энантиомических пар или успешная дискриминация энантиомеров с помощью хирального анализа SAX-HPLC или хиральных методов, основанных на PAGE, еще не зарегистрированы и должны быть дополнительно разработаны. Учитывая сохраненный синтез и сохраненное регулирование PP-InsPs по наличию фосфора, мы предполагаем, что особенно нерадиоактивные методы, такие как PAGE или MS-методы, вместе с анализом питательных веществ, помогут заземления правды усилия по калибровке данных дистанционного зондирования, предназначенных для диагностики дефицита питательных веществв сельскохозяйственных культурах 17,18,24,25. Тем не менее, метод, представленный здесь, в настоящее время все еще можно считать золотым стандартом для анализа InsP и будет способствовать открытию новых функций этих интригующих посланников в растениях.

Почти четыре десятилетия назад, инозитол фосфатов (InsPs) появились в качестве сигнальных молекул, после Ins (1,4,5)P3 (InsP3) был определен в качестве второго посланника, который активирует рецептор опосредованного выпуска Ca2 "в клетках животных 1,2. На сегодняшний день, не InsP3 рецептор (IP3-R) был выявлен в растениях, что ставит под сомнение прямую роль сигнализации для InsP3 в клеткахрастений 3. Несмотря на это, InsP3 служит предшественником для других InsPs, участвующих в нескольких процессах развития растений, в том числерегулирование конкретных сигнальных путей 3,,4,,5,,6,,7,,8. Например, InsP3 может быть дополнительно фосфорилирован в InsP6, также известный как "фитовая кислота", которая представляет собой основной источник фосфатов,мио-инозитол и cations, и было показано, играют ключевую роль в защите растений от патогенов, экспорт мРНК и фосфат гомеостаз5,9,10,11,12.
Инозитол пирофосфаты (PP-InsPs) являются классом InsPs, которые содержат по крайней мере один высокой энергии ди-фосфо связи, первоначально определены в клетках животных, амебы и дрожжей, где они играют важную рольв различных клеточных процессов 13,14,15. Несмотря на семенную работу по PP-InsPsв растениях 16,17,18,19,20,21, 22,23,24,2524,,26 , биологические функциии изомер идентичности этих молекул по-прежнему остаются в значительной степени загадочным. В модели растения Arabidopsis thaliana, клеточный InsP8 было предложено регулировать защиту от травоядных насекомых и некротрофических грибов с помощью совпадения обнаружения InsP8 и активного ясмоната на ASK1-COI1-JAЗ рецепторногокомплекса 17. Кроме того, роли InsP8 и других PP-InsPs в энергии гомеостаза и зондирования питательных веществ, а также фосфат гомеостазабыли предложены 17,23,24,25,26.
Независимо от используемой биологической системы, одной из основных методологических проблем при изучении InsPs было надежное обнаружение и точная количественная оценка этих молекул. Методы на основе масс-спектрометрии используются для обнаружения insPs, в том числе PP-InsPs, из клеточных экстрактов. Тем не менее, эти исследования не смогли дифференцировать различныеизомеры 26,27. Другой подход к анализу InsPs использует выдвижной InsPs из клеток лизатов с помощью TiO2 бусы, а затем полиакриламинид гель электрофорез (PAGE) из эластитных InsPs. InsPs могут быть окрашены либо толуидин синий или DAPI24,28,29. Тем не менее, это до сих пор не возможно надежно обнаружить InsPs ниже, чем InsP5 из растительных экстрактов с помощью этого метода. Недавно был опубликованметод, использующий 13C-myo-inositolдля анализа ядерных магнитных резонансов (NMR) InsPs в качестве альтернативы высокой асионной жидкой хроматографии (SAX-HPLC)30. Этот метод, как сообщается, достичь аналогичной чувствительности по сравнению с SAX-HPLC и позволяют обнаружения 5-InsP7, а также дискриминации различных неантиомических изомеров InsP5 из клеточных экстрактов. Тем не менее, внедрение метода, основанного на ЯМР, требует химического синтеза и коммерчески недоступен- 13C - мио-инозитол.myo Таким образом, метод, используемый в большинстве случаев является радиолабеляобразцов с No 3H - мио-инозитол, а затем SAX-HPLC31,32,33.myo Этот метод основан на поглощении радиоактивного мио-инозитол в растение и его преобразовании в различные InsPs по комбинированной активности выделенных клеточных киназы и фосфаты. myo
InsPs с маркировкой3H'S затем извлекаются из кислоты и фракционены с помощью SAX-HPLC. Из-за отрицательного заряда InsPs сильно взаимодействуют с положительно заряженной стационарной фазой колонки SAX-HPLC и могут быть эластимы с буферным градиентом, содержащим увеличение концентраций фосфатов, чтобы outcompete InsPs из столбца. Таким образом, время elution зависит от заряда и геометрии видов InsP, которые будут разделены. При отсутствии хиральных столбцов, только неантиомические изомеры могут быть разделены этим протоколом. Тем не менее, радиозапеваемые стандарты могут быть использованы для присвоения изомерного характера конкретного пика InsP. Многочисленные усилия, предпринятые в прошлом различными лабораториями по созданию маркированных и немаркированных стандартов с помощью (био)химических методов или по их очистке от различных клеток и организмов, помогли назначить пики определенным видам InsP, а также сузить изомерикную идентичность отдельных видов InsP5,,7,,21,,34,,35,,36,,37,,38,,39,,40,,41,,42,,43. Кроме того, недавнее выяснение энзиматических путей, ведущих к образованию PP-InsPs в растениях, а также открытие бактериального типа III эффектор с конкретной 1-phytase деятельности, предоставить информацию о том, как генерировать полезныестандарты для этих анализов 10,17,18,22,23.
Полученные фракции могут быть измерены в жидком счетчике сцинтилляции из-β распада трития(3H). С увеличением времени маркировки, устойчивое состояние изотопного равновесия достигнуто, после чего полученные профили InsP должны представлять статус InsP завода31. Основным преимуществом этого протокола по сравнению с другими доступными методами является высокая чувствительность, достигнутая за счет использования прямого прекурсора для InsPs и измерения радиоактивного сигнала.
SAX-HPLC образцов, извлеченныхиз »3 H»-мио-инозитол помеченных растений или других организмов, обычно используется для обнаружения и количественной оценки InsPs, начиная от более низких видов InsP pp-InsPs, представляющих собой ценный инструмент, чтобы лучше понять метаболизм, функции и способы действия InsPs. До сих пор этот метод также является наиболее подходящим выбором для исследователей с особым интересом к более низким видам InsP. Хотя основы этой процедуры, на которых протокол описан здесь строится на, былиранее описаны 7,21,31,34, подробный протокол с учетом анализа растительных insPs и особенно PP-InsPs по-прежнему отсутствует. Предыдущие публикации сообщали о трудностях, связанных с надежной обнаружением низких обильных PP-InsPs, особенно InsP8,из-заодного или нескольких из следующих факторов: относительно низкое количество растительного материала,3H - мио-инозитол с низкой специфической активностью (Nogt; 20 Ci/mmol), использование буферов экстракции, которые либо не основаны на перхлорной кислоте, либо менее сконцентрированы,чем 1 М, различные нейтрализующие буферы, а также неоптимические градиентыили обнаружение детектора. По сравнению с этими исследованиями, представленный здесь протокол предназначен для надежного обнаружения PP-InsPs7,,21,,34.
Здесь мы представляем подробный рабочий процесс, начиная от установки оборудования для выращивания растений и маркировки, извлечения InsP и SAX-HPLC запустить себя. Хотя метод был оптимизирован для модели завода A. thaliana, он может быть легко изменен для изучения других видов растений, как показано здесь с первым сообщил InsP профиль модели бобовых Lotus japonicus. Хотя использование различных видов растений может потребовать некоторой оптимизации, мы предполагаем, что они будут незначительными, что делает этот протокол хорошей отправной точкой для дальнейших исследований в растительных InsPs. Для того, чтобы облегчить возможную оптимизацию, мы указываем каждый шаг в протоколе, в котором возможны изменения, а также все критические шаги, которые могут быть сложными при создании метода в первый раз. Кроме того, мы сообщаем о том, как данные, полученные с помощью этого метода, могут быть использованы для количественной оценки конкретных insPs и как различные образцы могут быть проанализированы и сопоставлены.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>model: 5430 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diammonium hydrogen phosphate, &#8805;97 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0268.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, &#8805;99 %, p.a., ACS</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>LAMBDA Instruments GmbH</td>
			<td>model: OMNICOLL single channel collector</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth incubator</td>
			<td>poly klima GmbH</td>
			<td>model: PK 520-LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC pumps</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector for HPLC</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>model: Rheodyne 9725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol, myo-[1,2-3H(N)]</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals Inc.</td>
			<td>ART 0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>University, Chemistry Department</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>model: TRI-CARB 2900TR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pestle</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>CXH7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 &#181;m pore size, 47 mm circle</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>10401770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer for HPLC</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: M 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium, salt mixture</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro software</td>
			<td>OriginLab Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthophosphoric acid, &#8805;85 %, p.a., ISO</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>6366.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partisphere 5 &#181;m SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4621-0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile</td>
			<td>Greiner Bio One International GmbH</td>
			<td>688161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-indicator paper pH 5.5 - 9.0, Neutralit</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>109564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>P743.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>57648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL</td>
			<td>Simport Scientific Inc.</td>
			<td>S207-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench</td>
			<td>LaboGene</td>
			<td>model: ScanLaf MARS 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, &#8805;99,5 %, p.a.</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>6013599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure deionized water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrenchless WVS End Fitting Kit</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4631-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc

Фосфатные эфиры мио-инозитол, также называют инозитол фосфатов (InsPs), являются классом клеточных регуляторов, играющих важную роль в физиологии растений. myo Из-за их отрицательного заряда, низкого изобилия и восприимчивости к гидролитической деятельности, обнаружение и количественная оценка этих молекул является сложной задачей. Это особенно касается высоко фосфорилированных форм, содержащих «высокоэнергосбережные» дифосфосфос-связи, также называются инозитол пирофосфатами (PP-InsPs). Из-за своей высокой чувствительности, сильный анионный обмен высокой производительности жидкой хроматографии (SAX-HPLC) растенийпомечены 3H - мио-инозитол в настоящее время метод выбора для анализа этих молекул.myo С помощью3H-myo-inositolдля рассада растений радиолабеля, различные виды InsP, включая несколько неантиомерных изомеров, могут быть обнаружены и дискриминированы с высокой чувствительностью. Здесь описана установка подходящей системы SAX-HPLC, а также полный рабочий процесс от выращивания растений, радиосвязи и извлечения InsP до запуска SAX-HPLC и последующего анализа данных. Протокол, представленный здесь позволяет дискриминации и количественной оценки различных видов InsP, в том числе несколько неантиометрических изомеров и PP-InsPs, InsP7 и InsP8, и могут быть легко адаптированы к другим видам растений. В качестве примеров SAX-HPLC проводятся анализы саженцев арабидопсиса талиана и lotus japonicus и представлены и обсуждены полные профили InsP. Описанный здесь метод представляет собой перспективный инструмент для лучшего понимания биологических ролей insPs в растениях.

Результаты, показанные здесь, направлены на иллюстрацию возможных результатов, полученных в соответствии с вариациями на техническом и биологическом уровнях. Первый примером является анализы с использованием новых по сравнению свозрастом столбцов (рисунок 1) и свежие по сравнениюс сохраненных образцов (рисунок 3), а второй путем оценки экстрактов из двух различных систем растений, A. thaliana (Рисунок 1, Рисунок 3) и L. japonicus (Рисунок 2).
Оптимальный пробег SAX-HPLC изображен на рисунке 1A'u2012C, который показывает полный спектр инозитол полифосфата, полученный из экстрактов A. thaliana после подсчета сцинтилляции. Обратите внимание, что пики хорошо разделены и могут быть назначены различным изомерахмам (или энантиомер-парам) на основе хроматографическихмобилей,описанных ранее 5,,7.
На рисунке 2 показан репрезентативный результат анализа SAX-HPLC саженцев L. japonicus, которые были выращены и помечены на тех же условиях, что и саженцы арабидопсиса. Хотя предположительно все виды InsP и пики, которые известны из Arabidopsis можно увидеть, Есть существенные различия в отношении относительного (например, соотношения между изомерами) количество конкретных изомеров InsP, при сравнении профилей обоих видов. Например, экстракты Lotus показали увеличение InsP3c, InsP4b, InsP5b и уменьшенный InsP3a, InsP4a, InsP5a и InsP5c по сравнению с Arabidopsis, который оставляет место для дальнейших исследований. Рисунок 2D иллюстрирует различные соотношения между изомерами InsP между Arabidopsis и Lotus.
На рисунке 3 показаны два профиля InsP образца, который был разделен после извлечения. Первая половина была немедленно проанализирована, а вторая половина через день, после хранения при -80 градусов по Цельсию. Обратите внимание, что между различными образцами (т.е. черными и красными линиями на рисунке 3Au2012Cи рисунок 3D) наблюдаются лишь незначительные различия. Это свидетельствует о том, что один цикл замораживания-оттепели не вредит образцу и что сам метод генерирует воспроизводимые результаты.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig01.jpg"> Рисунок 1: Типичный профиль InsP успешного и неудачного анализа SAX-HPLC, выполненного с помощью этого протокола. (Au2012C) SAX-HPLC профиль 17-дневного дикого типа (Col-0) Arabidopsis саженцы радиозапись,помеченные с 3H - мио-инозитол.myo В тот же день были выполнены global InsP extraction и SAX-HPLC. (A)Полный спектр; (B, C) Увеличить ва-ряды профиля, показанного в А. Все видимые пики выделены и присвоены соответствующим видам InsP. На основе опубликованных хроматографическихдвижеств5,7, InsP4a, вероятно, представляет Ins (1,4,5,6)P4 или Ins (3,4,5,6)P4, InsP5a представляет InsP5 (2-OH), InsP5b представляет InsP5 (4-OH) или его энантиометрической формой InsP5 (6-OH), а InsP5c представляет InsP5 (1-OH) или его энантиометрической формой InsP5 (3-OH). Изомерика природы InsP3a-c, InsP4b, InsP7, и InsP8 до сих пор неизвестны. Панель(D) показывает профиль SAX-HPLC из одинаково выращенных растений, но с использованием выдержаной колонки (Nogt;40 работает). Очевидное сокращение InsP6 по сравнению с другими видами InsP и отсутствие PP-InsPs видно. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2.jpg"> Рисунок 2: Представитель InsP профиль L. japonicus растений. Профиль SAX-HPLC ( A u2012C) 17-дневного дикого типа (Gifu)A L. japonicus саженцы радиосламелись с 3 H ' -мио-инозитол.3 (A)Полный спектр; (B, C) Увеличить ва-ряды профиля, показанного в А. Все видимые пики выделены и присвоены соответствующим видам InsP. На основе опубликованных хроматографическихмобилей5,7, InsP4a, вероятно, представляет Ins (1,4,5,6)P4 или Ins (3,4,5,6)P4, InsP5b, вероятно, представляет InsP5 (4-OH) или его энантиометрической форме InsP5 (6-OH), и InsP5c, вероятно, представляет InsP5 (1-OH) или его энантиометрической формы InsP5 (3-OH). Изомерик природа InsP3a-c, InsP4b, InsP7, и InsP8 неизвестны. (D)Сравнение между отдельными видами InsP (в % от общей активности от elution 25'u201296) A. thaliana (данные с рисунка 1 A'u2012C)A‒C и L. japonicus (данные с рисунка 2A-C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig03.jpg"> Рисунок 3: Профили InsP разделенного образца, иллюстрирующие воспроизводимость анализов SAX-HPLC. (Au2012C) SAX-HPLC профили 17-дневного дикого типа (Col-0) Arabidopsis саженцы радиозапись,помеченные с 3H - мио-инозитол.myo До запуска образец был разделен, и одна половина была немедленно запущена, а другая половина через день после хранения при -80 градусов по Цельсию(A) Полный спектр; (B, C) Увеличить ва-ряды профиля, показанного в А. Все видимые пики выделены и присвоены соответствующим видам InsP. На основе опубликованных хроматографическихдвижеств5,7, InsP4a, вероятно, представляет Ins (1,4,5,6)P4 или Ins (3,4,5,6)P4, InsP5a представляет InsP5 (2-OH), InsP5a представляет InsP5 (2-OH), InsP5b представляет InsP5 (4-OH) или его энантиометрической формой InsP5 (6-OH), а InsP5c представляет InsP5 (1-OH) или его энантиометрической формы InsP5 (3-OH). Изомерика природы InsP3a-c, InsP4b, InsP7, и InsP8 до сих пор неизвестны. Группа D показывает количественную оценку InsP6 и PP-InsPs InsP7 и InsP8 обоих трасс. Значения представляют сумму (в %) соответствующих видов InsP по отношению ко всем InsP (общая активность от elution 25-96). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Дополнительная цифра 1: Настройки программного обеспечения для подсчета жидких сцинтилляций с помощью счетчика легкого сцинтилляции. Изображены скриншоты, показывающие версию программного обеспечения, а также настройки,используемые дляподсчета сцинтилляции образцов, выполненных с помощью этого протокола. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig01.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.</a>
Дополнительная цифра 2: Репрезентативный пример нормализации данных. На скриншоте листа показаны все шаги и формулы, используемые для нормализации SAX-HPLC работает друг с другом. Для упрощения показаны лишь фракции 25-35 образцов. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig02.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.</a>
Дополнительный рисунок 3: Определение пика, фоновое вычитание и интеграция с использованием программного обеспечения для анализа. (A)Данные анализа SAX-HPLC загружаются в программное обеспечение (минуты 28-96) и выбирается инструмент пикового анализатора. (Bю2012E) Базовый уровень определяется вручную путем установления точек между отдельными пиками и вычитается фон. (F)Пики определяются вручную на основе внешнего вида и опубликованных хроматографическихдвижеств5,7. (G)Пиковые диапазоны определяются вручную значениями cpm. (H)Пики интегрированы и рассчитаны как % от всех пиков. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig03.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC at JoVE.com

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

Здесь мы описываем сильный анионный обмен высокой производительностижидкой хроматографии 3H - мио-инозитол помеченные саженцы, который является очень чувствительным методом для обнаружения и количественной оценки инозитол полифосфатов в растениях.myo

Извлечение и количественная оценка растворимых, радиозамазаемых поликомолокаторов инозитолов различных видов растений с использованием SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

Протокол, продемонстрированый здесь, может помочь прояснить биосинтез инозитол полифосфатов растений и ответить на вопросы об их роли в некоторых аспектах метаболизма и развития растений. Этот метод является весьма чувствительным, поскольку использование радиоактивно маркированного предшественника фосфатов инозитол позволяет надежно выявлять все виды инозитол фосфатов в растениях. Визуальная демонстрация этого метода важна, потому что большинство биологов растений не знакомы с анализом HPLC и необходимой установкой.Кроме того, критические шаги этого протокола, такие как извлечения фосфатов инозитол, трудно следовать без надлежащей демонстрации. Начните с создания системы, состоящей из двух независимых насосов HPLC, один для буфера И один для буфера B.Both насосы должны управляться вместе с помощью компьютера или мастер насоса. Осуществление поршневой уплотнения мыть для обоих насосов, либо с помощью гравитационных сил или через третий насос низкого давления.Подключите оба насоса к динамическому смеситель, а затем подключить смеситель к клапану впрыска с образцом петли, которая имеет по крайней мере один миллилитр мощности. Используйте капилляры для подключения клапана впрыска к столбецу и столбецу к коллектору фракций. Посеять семена лотоса в один ряд на площади Петри блюда заполнены твердых средств роста, состоящий из 0,8% бактериологических агар в деионизированной воде.Разрешить семена стратифицировать, по крайней мере три дня при четырех градусах по Цельсию в темноте. Поместите семена в инкубатор роста. Передача от 10 до 20 саженцев в один колодец из 12-хорошо ясно плоской нижней пластины культуры клеток заполнены двумя миллилитров полу прочности MS соли раствор, который дополняется 1%сахарозы и скорректированы до рН 5,7.Добавьте 45 микрокури 3H мио-инозитол в тарелку и закружить его осторожно. Обложка пластины с крышкой и запечатать его с микропорной хирургической лентой. Затем поместите его обратно в инкубатор роста.После пяти дней маркировки, удалить саженцы из средств массовой информации и мыть их кратко с деионизированной водой. Высушите их бумажными полотенцами и перенесите в 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку, чтобы не перезаполнить трубку. Привязать заморозить трубку в жидком азоте и хранить его при температуре минус 80 градусов по Цельсию до извлечения.Возьмите образцы из морозильной камеры и держать их в жидком азоте до готовности к использованию. Измельчить их с microcentrifuge трубки пестик, пока они не начнут оттаивать, а затем добавить 500 микролитров ледяной буфер добычи. Продолжайте шлифовку, пока образец не гомогенизирован и раствор не будет окрашен.Центрифуга образцов в течение 10 минут при 18000 раз G и четыре градуса по Цельсию. Затем перенесите супернатант в свежую 1,5 миллилитровую трубку. Трубы, используемые для добычи, считаются твердыми радиоактивными отходами и должны быть утилизированы соответствующим образом.Аккуратно добавьте в экстракт 300 микролитров буфера нейтрализации, что сразу же вызовет осадки белков и восходящее. Через минуту смешайте образец с наконечником пипетки и пипеткой пять микролитров на бумаге рН, чтобы убедиться, что рН составляет от семи до восьми. При необходимости добавьте небольшое количество буфера нейтрализации или буфера извлечения до достижения желаемого рН и дайте образцам отдохнуть на льду в течение по крайней мере одного часа с открытой крышкой.Затем центрифугировать их в течение 10 минут и передать супернатант в свежей 1,5 миллилитровой трубки. Оборудуйте коллектор фракции 96 небольшими сцинтилляционными флаконами и заполните каждый флакон двумя миллилитров подходящего сцинтилляционного коктейля, совместимого с низкими буферами рН и высокими концентрациями фосфатов аммония. Запустите систему HPLC, затем активируйте промывку поршневых уплотнеек и активируйте ее в течение всего пробега.Вручную ввит образец подходящим шприцем. Запустите насосы и градиент. В то время как запуск HPLC продолжается, регулярно проверяйте давление.Стартовое давление должно быть около 18 до 24 бар и должны медленно расти до 50 до 60 бар, как только 100%буфер B достигнут. После запуска, закрыть флаконы плотно и энергично встряхнуть фракции с сцинтилляции коктейль для смешивания. Если не продолжать непосредственно с измерением, держать флаконы в вертикальном положении в темноте.Чтобы измерить фракции, вставьте флаконы в стойки счетчика сцинтилляции с помощью стеллажей, которые соответствуют небольшим флаконам и измеряют каждый флакон в течение пяти минут в жидком счетчике сцинтилляции. Подготовье диаграмму 2D-линии, на которой измеренные отсчеты в минуту или CPM построены в соответствии со временем удержания. Для сравнения образцов друг с другом нормализуйте данные путем подведения итогов CPM с каждой элализованной фракции с минуты 25 до 96 для каждой отдельной выборки и путем деления общего CPM от этой выборки на общий CPM других образцов.Для выполнения относительных количественных показателей некоторых пиков поликозола и последующего создания барных графиков, содержащих данные репликаций для статистического анализа, продолжайте анализ с помощью специализированного программного обеспечения, которое может вычислить пиковые области хроматограмм. Полный спектр инозитол полифосфата, полученный из экстрактов A.thaliana после подсчета сцинтилляции, показан здесь. Пики красиво разделены и могут быть назначены различным изоме.При использовании выдержавного столбца видно явное снижение инозитолового гексакифосфата и отсутствие инозитолового пирофосфата. Анализ SAX-HPLC был также проведен на саженцах L.japonica, которые были выращены и помечены в тех же условиях, что и саженцы арабидопсиса. Хотя предположительно все инозитол полифосфат видов и пиков, которые известны из Arabidopsis можно увидеть, Есть различия в относительном количестве конкретных инозитол полифосфат изомеров между двумя видами.Чтобы продемонстрировать, что образцы не должны быть проанализированы сразу после извлечения, один образец был разделен на две части и половина его была проанализирована на следующий день после хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Различия между профилями свежих и замороженных образцов SAX-HPLC не были значительными, что продемонстрировало, что один цикл замораживания-оттепели не вредит образцу и что сам метод дает воспроизводимые результаты. При попытке этого протокола, всегда молоть образцы тщательно, замороженные и с буфером извлечения, и стремиться к близкому к нейтральному рН после нейтрализации, чтобы обеспечить максимальное восстановление радио-помечены инозитол фосфат для анализа SAX-HPLC.Можно очистить радио помечены от SAX-HPLC запустить для более позднего использования, например, во взаимных реакциях путем сбора фракций без сцинтилляции коктейлей и измерения только небольшие aliquots.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Экспериментальный дизайн для лазерных микродиссекция РНК-Seq: уроки из анализа развития листьев кукурузы

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Простой фракционированный метод экстракции для комплексного анализа метаболитов, липидов и белков из одного образца

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Взаимодействие с мРНК из протопластов растений

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Изоляция и дыхательных измерения митохондрий от Резуховидка Таля

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Фракционирование резолюции растворимых и нерастворимых гентингтина видов

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Масс-спектрометрия спрей лист: Быстрое окружающего ионизации техника непосредственно оценить метаболитов из растительных тканей

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Экстракции кофеина, ферментативной активности и экспрессии генов синтетазы кофеин из суспензий клеток растений

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Использование в Vitro флуоресценции резонанс передачи энергии для изучения динамики белковых комплексов в масштабе времени миллисекунду

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

Анализ РНК-блотов для обнаружения и количественной оценки микроРНК растений

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Оценка содержания лигнина в растительной биомассе с использованием тиогликолиновой кислоты (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...