Name: extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc
Uploaded: 2020-06-26T15:00:00
Duration: 9 min 1 s
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Este trabajo fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania - EXC-2070 – 390732324 (PhenoRob), el Grupo de Formación en Investigación GRK2064 y las becas de investigación individuales SCHA1274/4-1 y SCHA1274/5-1 a G.S.. Agradecemos también a Li Schláter y Brigitte Ueberbach por su asistencia técnica.

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí presentamos un método versátil y sensible para cuantificar los InsPs incluyendo PP-InsPs en extractos vegetales y proporcionamos consejos prácticos sobre cómo establecer este método. Aunque el protocolo es generalmente robusto, pueden producirse corridas y análisis subóptimos. En la mayoría de los casos, esas corridas pueden identificarse mediante una fuerte reducción o incluso una pérdida completa de InsPs altamente fosforilados, especialmente las especies PP-InsP InsP7 e InsP8. Las posibles razones pueden ser la contaminación microbiana del material vegetal y la desactivación insuficiente de las hidrolasas PP-InsP de la planta endógena durante la extracción debido a la molienda y descongelación insuficientes de material vegetal que no entrará en contacto inmediato con el tampón de extracción. Otras razones incluyen un ajuste inexacto del pH por adición insuficiente o excesiva de tampón de neutralización, o simplemente material de muestra insuficiente. Esto último puede dificultar la detección de PP-InsPs, ya que a menudo están presentes en cantidades muy bajas en las células. Un exceso de material de la muestra o un secado ineficiente durante el paso 3.5 puede causar dilución del ácido perclorico, lo que también conduce a una desactivación insuficiente de la enzima y a una pérdida específica de InsP6 y PP-InsPs. La cantidad de material vegetal, así como la etiqueta radioeléctrico utilizada en este protocolo se optimizaron en función de los costos y el rendimiento, y por lo tanto está cerca de la cantidad más baja que todavía es suficiente para proporcionar resultados óptimos. Además, la resina de columna perderá gradualmente su capacidad de resolución. El primer signo de este proceso es (por razones no del todo claras para los autores) una pérdida específica de especies de InsP más fosforiladas como las PP-insPs en el espectro HPLC. Con el envejecimiento adicional, incluso InsP6 no se resolverá correctamente por la columna (Figura 1D). Por lo tanto, el uso de una columna adecuada, así como el manejo meticuloso de la muestra y el mantenimiento adecuado de los componentes HPLC es crucial para garantizar resultados precisos.
Al comparar muestras y corridas, especialmente cuando se generan con diferentes equipos (por ejemplo, sistemas y columnas HPLC) o en días diferentes, es crucial normalizar las muestras entre sí (como se describe en el paso 7.3) y analizarlas de la misma manera. Sólo a través de la normalización es posible y preciso mostrar varias muestras en el mismo gráfico (Figura 3). Para la cuantificación de InsPs individuales en relación con el total de InsPs, o a otra especie específica de InsP, no es necesario normalizar, siempre y cuando solo se muestren valores relativos y no valores absolutos. Idealmente, se muestran tanto los perfiles InsP como las cuantificaciones. Sin embargo, en algunos casos no es posible mostrar adecuadamente dos o más corridas en el mismo gráfico. Diferentes tiempos de retención o diferentes niveles de actividad en segundo plano pueden dificultar la comparación de perfiles SAX-HPLC no fortificados solos. Lo mismo ocurre cuando hay que comparar muchas muestras. En tales casos, es necesaria una evaluación adicional utilizando un software adicional (por ejemplo, Origen) para la cuantificación de picos individuales.
Los autores son conscientes de que el protocolo descrito aquí puede optimizarse y debe adaptarse a cada pregunta de investigación individual. Aunque está optimizado para extractos de Arabidopsis 7,,17 en este protocolo, este método es versátil y puede ayudar a determinar los perfiles InsP de otras especies de plantas también. Aquí ejemplificamos esta posibilidad presentando por primera vez un perfil InsP para L. japonicus,que no requirió modificaciones de las condiciones de etiquetado, extracción InsP o ejecución SAX-HPLC (Figura 2). En particular, aunque en general se observan diferencias entre los perfiles L. japonicus y Arabidopsis InsP. Por ejemplo, en L. japonicus InsP5 [4-OH] o su forma enantiomérica InsP5 [6-OH] son más abundantes que InsP5 [1-OH] o su forma enantiomérica InsP5 [3-OH] en comparación con Arabidopsis, donde InsP5 [1-OH] o su forma enantiomérica InsP5 [3-OH] son las especies dominantes de InsP5. Del mismo modo, prevemos que las alteraciones en la composición de los medios,[3H]- concentraciónde myo-inositol, edad de las plantas, condiciones ambientales (por ejemplo, luz y temperatura), adición de compuestos químicos o análisis de interacciones entre plantas y microbianos entre otros factores, podrían necesitar ser probadas y adaptadas.
Un inconveniente importante de este método que debe tenerse en cuenta es que el etiquetado se realiza en un cultivo líquido (estéril), que no representa un entorno fisiológico para la mayoría de las plantas terrestres. Además, debido a los altos costos de [3H]-myo-inositol, el volumen de la solución de etiquetado y el tamaño del recipiente de cultivo es generalmente limitado, lo que también restringe el tamaño de las plantas que se pueden utilizar. El cultivo en cultivo líquido se puede evitar infiltrando directamente, por ejemplo, hojas de plantas cultivadas en el suelo con [3H]-myo-inositol y posteriormente siguiendo el protocolo descrito aquí, como se informó previamente10.
Hay varios inconvenientes de este protocolo en comparación con métodos alternativos, como tiO2 pull-down seguido de PAGE o técnicas basadas en espectrometría de masas. Debido al[3H]-etiquetado myo-inositol, sólo las especies de InsP que se originan directamente de mio-inositol radiomarcado se detectarán al final. El método descrito aquí es ciego a otros isómeros Ins como scyllo-inositol y otros isómeros algunos de los cuales han sido identificados en ciertas plantas44. Además, myo-InsPs derivados de otras vías serán excluidos, incluyendo los sintetizados por síntesis de novo de myo-inositol y myo-inositol-3-fosfato a través de la isomerización de glucosa-6-fosfato, catalizado por myo-inositol-3-fosfato sintasa (MIPS) proteínas45. Aunque [32P] o [33P]-ortofoto-fosfato se puede utilizar como etiquetas alternativas, su uso plantea una desventaja importante, ya que cada molécula que contiene fosfato, incluyendo los nucleótidos abundantes y sus derivados, será etiquetado. Esas moléculas también se pueden extraer con este protocolo y unirse a la columna SAX, lo que dará lugar a un alto nivel de actividad en segundo plano que interferirá con la identificación de los picos individuales de InsP5. Además, la cuantificación de [32P]- o [33P] -etiquetada InsPs y PP-InsPs puede estar fuertemente influenciada por la rotación de la mitad del fosfato y pirofosfato y podría no informar de una lectura masiva para las especies de inositol.
Por otro lado, [3H]-myo-inositol etiqueta específicamente moléculas quecontienen myo -inositol. InsPs, lípidos que contienen inositol, como fosfoinositides, y galactinol son en este caso etiquetados. Sin embargo, sólo insPs serán analizados con este protocolo, ya que los lípidos son insolubles en el búfer de extracción y galactinol no se une a la columna SAX.
Hasta ahora, las diferencias con un perfil de InsP de la planta generado por [3H]-etiquetado myo-inositol en comparación con uno determinado por TiO2 pulldown/PAGE sigue siendo desconocido, ya que tales comparaciones no se han realizado en plantas. Un estudio reciente realizado en células animales abordó esta pregunta46. En ese trabajo, se identificó un conjunto de InsP6 que es invisible por [3H]-myo-inositol etiquetado, que por lo tanto debe derivarse directamente de glucosa-6-fosfato, se identificó comparando perfiles SAX-HPLC con geles PAGE de líneas celulares de mamíferos. 24 h de inanición de fosfato resultaron en un aumento del 150% de InsP6 al cuantificar geles PAGE de InsPs purificados usando TiO2 pulldown. Los análisis SAX-HPLC de [3H]- células etiquetadaspor io-inositol-etiquetadas que fueron tratadas de forma idéntica sólo mostraron un aumento en un 15% de [3H]-InsP6. Como se mencionó anteriormente, insPs inferiores a InsP5 son indetectables con el análisis PAGE en la mayoría de los casos. El radioetiquetado seguido de SAX-HPLC parece ser el método de elección, siempre y cuando los protocolos espectrométricos de masa no estén optimizados para detectar este grupo de moléculas altamente cargadas negativamente.
Otro reto restante es distinguir los enantiómeros en los análisis SAX-HPLC (o en cualquier otro método para el análisis InsP)10,,17. Este desafío puede abordarse mediante la adición de selectores quirales, es decir, compuestos enantiopur como la amida de L-arginina que interactúan con las moléculas enantioméricas respectivas para formar complejos diaesteroméricos que se pueden separar10. Hasta donde sabemos, este enfoque sólo se ha implementado para discriminar los isómeros InsP5 enantioméricos InsP5 [1-OH] e InsP5 [3-OH] mediante los análisis de RMN10. La discriminación de otros pares enantioméricos o la discriminación exitosa de enantiómeros por análisis CHIral SAX-HPLC o métodos quirales basados en PAGE aún no se han divulgado y deben desarrollarse más. Teniendo en cuenta la síntesis conservada y la regulación conservada de los PP-InsP por disponibilidad de fósforo, concebimos que especialmente los métodos no radiactivos como los métodos basados en PAGE o MS, junto con los análisis de nutrientes, ayudarán a los esfuerzos de verdad del suelo para calibrar los datos de teledetección diseñados para diagnosticar deficiencias de nutrientes en los cultivos17,,18,,24,,25. Sin embargo, el método presentado aquí todavía puede ser considerado el estándar de oro para los análisis de InsP y será instrumental para descubrir nuevas funciones de estos mensajeros intrigantes en las plantas.

Hace casi cuatro décadas, los fosfatos de inositol (InsPs) surgieron como moléculas de señalización, después de Que Ins(1,4,5)P3 (InsP3) fue identificado como un segundo mensajero que activa la liberación mediada por el receptor de Ca2+ en células animales1,2. Hasta la fecha, no se ha identificado ningún receptor InsP3 (IP3-R) en las plantas, lo que cuestiona un papel de señalización directa para InsP3 en las células vegetales3. A pesar de todo, InsP3 sirve como precursor para otros InsPs involucrados en varios procesos de desarrollo de plantas, incluyendo la regulación de vías de señalización específicas3,4,5,6,7,8. Por ejemplo, InsP3 puede ser más fosforilado a InsP6, también conocido como "ácido fítico", que representa una fuente importante de fosfato, myo-inositol y cationes, y se demostró que juegan un papel clave en la defensa de la planta contra patógenos, exportación de ARNm y homeostasis fosfato5,9,10,11,12.
Los pirofosfatos de inositol (PP-InsPs) son una clase de InsPs que contienen al menos un enlace di-fosfo de alta energía, identificado inicialmente en células animales, ameba y levadura, donde desempeñan un papel crítico en varios procesos celulares13,,14,,15. A pesar del trabajo seminal sobre los PP-InsPs en las plantas16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, las funciones biológicas y la identidad isómero de estas moléculas siguen siendo en gran medida enigmáticas. En la planta modelo Arabidopsis thaliana, se propuso el celular InsP8 para regular las defensas contra los herbívoros de insectos y hongos necrotróficos a través de la detección de coincidencias de InsP8 y jasmonato activo por el complejo receptor ASK1-COI1-JAZ17. Además, se han propuesto funciones de InsP8 y otros PP-InsPs en la homeostasis energética y la detección de nutrientes, así como la homeostasis de fosfato17,,23,,24,,25,,26.
Independientemente del sistema biológico empleado, uno de los principales desafíos metodológicos al estudiar InsPs ha sido la detección fiable y la cuantificación precisa de estas moléculas. Se han utilizado métodos basados en espectrometría de masas para detectar InsPs, incluidos los PP-InsP, a partir de extractos de celdas. Sin embargo, estos estudios no lograron diferenciar distintos isómeros26,,27. Otro enfoque para analizar InsPs emplea la extracción de InsPs de los lysates celulares usando cuentas TiO2, seguido de electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE) del InsPs eluido. Los InsPs pueden ser manchados por toluidine azul o DAPI24,28,29. Sin embargo, hasta ahora no es posible detectar de forma fiable InsPs inferior a InsP5 de extractos vegetales utilizando este método. Recientemente, un método que utiliza [13C]-myo-inositol para el análisis de resonancia magnética nuclear (NMR) de InsPs fue publicado como una alternativa a la cromatografía líquida fuerte de aniones de alto rendimiento (SAX-HPLC)30. Esta técnica se ha divulgado para lograr una sensibilidad similar en comparación con SAX-HPLC y para permitir la detección de 5-InsP7, así como la discriminación de diferentes isómeros No enantioméricos InsP5 de extractos celulares. Sin embargo, la implementación del método basado en RMN requiere sintetizado químicamente y comercialmente no disponible [13C]-myo-inositol. Por lo tanto, el método empleado en la mayoría de los casos es el radioetiquetado de muestras con [3H]-myo-inositol, seguido de SAX-HPLC31,32,33. Esta técnica se basa en la absorción de myo-inositolradiactivo en la planta y su conversión en diferentes InsPs por la actividad combinada de quinasas celulares dedicadas y fosfatasas.
Los InsP con etiqueta de [3H] se extraen y fraccionan con ácido mediante SAX-HPLC. Debido a su carga negativa, los InsPs interactúan fuertemente con la fase estacionaria cargada positivamente de la columna SAX-HPLC y se pueden eluerar con un gradiente tampón que contenga concentraciones de fosfato crecientes para ecompetear a Los InsP de la columna. Por lo tanto, los tiempos de elución dependen de la carga y la geometría de las especies de InsP que se van a separar. En ausencia de columnas quirales, sólo los isómeros no enantioméricos pueden separarse por este protocolo. Sin embargo, las normas radiomarcadas se pueden utilizar para asignar la naturaleza isomérica de un pico InsP específico. Múltiples esfuerzos en el pasado por parte de diversos laboratorios para generar normas etiquetadas y no etiquetadas con métodos (bio)químicos o para purificarlos de diversas células y organismos han ayudado a asignar picos a ciertas especies de InsP, y también para acotar la identidad isomérica de las especies individuales de InsP5,7,21,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Asimismo, el reciente esclarecimiento de vías enzimáticas que conducen a la formación de PP-InsPs en las plantas, así como el descubrimiento de un efector bacteriano tipo III con una actividad específica de 1-phytasa, proporcionan información sobre cómo generar normas útiles para estos análisis10,,17,18,22,23.
Las fracciones resultantes se pueden medir en un contador de centelleo líquido debido a la β-decaimiento del tritio (3H). Con el aumento del tiempo de etiquetado, se alcanza un equilibrio isotópico de estado estacionario, después de lo cual los perfiles InsP obtenidos deben representar el estado InsP de la planta31. La principal ventaja de este protocolo en comparación con otras técnicas disponibles es la alta sensibilidad lograda por el uso del precursor directo para los InsPs y la medición de una señal radiactiva.
SAX-HPLC de muestras extraídas de [3H]-myo-plantas etiquetadas con inositol u otros organismos se utiliza comúnmente para la detección y cuantificación de InsPs que van desde especies insP más bajas a PP-InsPs, que representan una herramienta valiosa para comprender mejor el metabolismo, la función y los modos de acción de los InsPs. Hasta ahora, este método es también la opción más adecuada para los investigadores con especial interés en especies inferiores de InsP. Si bien los fundamentos de este procedimiento, sobre el que se basa el protocolo aquí descrito, se han descrito previamente7,21,31,34, todavía falta un protocolo detallado adaptado al análisis de los InsPs derivados de plantas y especialmente de los PP-InsPs. Publicaciones anteriores informaron de dificultades para detectar de manera fiable los especialmente InsP8, debido a uno o más de los siguientes factores: cantidades relativamente bajas de material vegetal, [3H]-myo-inositol con baja actividad específica (> 20 Ci/mmol), uso de tampones de extracción que no se basan en ácido perclórico o están menos concentrados que 1 M, diferentes buffers neutralizantes, así como gradientes subópticos o detección de [3H con un detector. En comparación con estos estudios, el protocolo presentado aquí está diseñado para la detección fiable de PP-InsPs7,21,34.
Aquí presentamos un flujo de trabajo detallado, desde la configuración del equipo hasta el cultivo y etiquetado de plantas, la extracción InsP y la propia ejecución SAX-HPLC. Aunque el método fue optimizado para la planta modelo A. thaliana,se puede modificar fácilmente para estudiar otras especies de plantas, como se muestra aquí con el primer perfil InsP reportado del modelo leguminosa Lotus japonicus. Aunque el uso de una especie vegetal diferente podría requerir cierta optimización, prevemos que serán menores, haciendo de este protocolo un buen punto de partida para la investigación posterior en insp de plantas. Con el fin de facilitar posibles optimizaciones, indicamos cada paso dentro del protocolo en el que las modificaciones son posibles, así como todos los pasos críticos que pueden ser difíciles al establecer el método por primera vez. Además, informamos de cómo se pueden utilizar los datos obtenidos por este método para la cuantificación de InsP específicos y cómo se pueden analizar y comparar diferentes muestras.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>model: 5430 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diammonium hydrogen phosphate, &#8805;97 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0268.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, &#8805;99 %, p.a., ACS</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>LAMBDA Instruments GmbH</td>
			<td>model: OMNICOLL single channel collector</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth incubator</td>
			<td>poly klima GmbH</td>
			<td>model: PK 520-LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC pumps</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector for HPLC</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>model: Rheodyne 9725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol, myo-[1,2-3H(N)]</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals Inc.</td>
			<td>ART 0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>University, Chemistry Department</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>model: TRI-CARB 2900TR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pestle</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>CXH7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 &#181;m pore size, 47 mm circle</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>10401770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer for HPLC</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: M 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium, salt mixture</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro software</td>
			<td>OriginLab Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthophosphoric acid, &#8805;85 %, p.a., ISO</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>6366.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partisphere 5 &#181;m SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4621-0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile</td>
			<td>Greiner Bio One International GmbH</td>
			<td>688161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-indicator paper pH 5.5 - 9.0, Neutralit</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>109564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>P743.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>57648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL</td>
			<td>Simport Scientific Inc.</td>
			<td>S207-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench</td>
			<td>LaboGene</td>
			<td>model: ScanLaf MARS 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, &#8805;99,5 %, p.a.</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>6013599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure deionized water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrenchless WVS End Fitting Kit</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4631-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc

Los ésteres de fosfato de myo-inositol, también llamados fosfatos de inositol (InsPs), son una clase de reguladores celulares que juegan un papel importante en la fisiología de la planta. Debido a su carga negativa, baja abundancia y susceptibilidad a las actividades hidrolíticas, la detección y cuantificación de estas moléculas es un reto. Este es particularmente el caso de las formas altamente fosforiladas que contienen enlaces difosfos de 'alta energía', también llamados pirofosfatos de inositol (PP-InsPs). Debido a su alta sensibilidad, fuerte anión intercambio de cromatografía líquida de alto rendimiento (SAX-HPLC) de plantas etiquetadas con [3H]-myo-inositol es actualmente el método de elección para analizar estas moléculas. Mediante el uso de [3H]-myo-inositol para la planta de radioetiqueta plant seedlings, varias especies de InsP incluyendo varios isómeros no enantioméricos pueden ser detectados y discriminados con alta sensibilidad. Aquí se describe la configuración de un sistema SAX-HPLC adecuado, así como el flujo de trabajo completo desde el cultivo de plantas, radioetiquetado y extracción InsP hasta la ejecución SAX-HPLC y el posterior análisis de datos. El protocolo presentado aquí permite la discriminación y cuantificación de varias especies de InsP, incluyendo varios isómeros no enantioméricos y de los PP-InsPs, InsP7 e InsP8,y se puede adaptar fácilmente a otras especies vegetales. Como ejemplos, se realizan análisis SAX-HPLC de las plántulas de Arabidopsis thaliana y Lotus japonicus y se presentan y discuten perfiles completos de InsP. El método descrito aquí representa una herramienta prometedora para comprender mejor las funciones biológicas de InsPs en las plantas.

Los resultados que se muestran aquí tienen como objetivo ilustrar los posibles resultados obtenidos de acuerdo con las variaciones a nivel técnico y biológico. El primero se ejemplifica mediante análisis utilizando columnas nuevas frente a envejecidas (Figura 1) y muestras frescas frente a almacenadas (Figura 3), y la segunda mediante la evaluación de extractos de dos sistemas vegetales diferentes, A. thaliana (Figura 1, Figura 3) y L. japonicus (Figura 2).
Una ejecución óptima SAX-HPLC se representa en la Figura 1A-u2012C, que muestra un espectro completo de polifosfato de inositol obtenido de extractos de A. thaliana después del conteo de centelleo. Tenga en cuenta que los picos están muy bien separados y se pueden asignar a diferentes isómeros (o pares de enantiómeros) basados en las movilidades cromatográficas descritas anteriormente5,7.
La Figura 2 muestra el resultado representativo de un análisis SAX-HPLC de las plántulas de L. japonicus que fueron cultivadas y etiquetadas en las mismas condiciones que las plántulas de Arabidopsis. Aunque presumiblemente se pueden observar todas las especies y picos de InsP que se conocen a partir de Arabidopsis, existen diferencias sustanciales con respecto a la cantidad relativa (por ejemplo, las relaciones entre los isómeros) de isómeros InsP específicos, al comparar los perfiles de ambas especies. Por ejemplo, los extractos de Lotus mostraron un aumento de InsP3c, InsP4b, InsP5b y reducido InsP3a, InsP4a, InsP5a e InsP5c en comparación con Arabidopsis que deja espacio para investigaciones posteriores. La Figura 2D ilustra las diferentes relaciones entre los isómeros InsP entre Arabidopsis y Lotus.
La figura 3 muestra dos perfiles InsP de una muestra que se dividió después de la extracción. La primera mitad se analizó inmediatamente y la segunda mitad un día después, después del almacenamiento a -80 oC. Tenga en cuenta que sólo se observan diferencias menores entre las diferentes muestras (es decir, líneas negras y rojas en la Figura 3Ade u2012Cy la Figura 3D). Esto ilustra que un ciclo de congelación-descongelación no daña la muestra y que el propio método genera resultados reproducibles.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig01.jpg"> Figura 1: Perfil InsP típico de un análisis SAX-HPLC exitoso y de un análisis SAX-HPLC fallido realizado con este protocolo. (A.u2012C) PERFIL SAX-HPLC de 17 días de edad tipo salvaje (Col-0) Plántulas Arabidopsis radiomarcadas con [3H]-myo-inositol. La extracción Global InsP y la ejecución SAX-HPLC se realizaron el mismo día. (A) Espectros completos; (B, C) Zoom-ins del perfil que se muestra en A. Todos los picos visibles se resaltan y se asignan a las especies InsP correspondientes. Sobre la base de las movilizaciones cromatográficas publicadas5,7, InsP4a probablemente representa Ins(1,4,5,6)P4 o Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a representa InsP5 [2-OH], InsP5b representa InsP5 [4-OH] o su forma enantiomérica InsP5 [6-OH], e InsP5c representa InsP5 [1-OH] o su forma enantiomérica InsP5 [3-OH]. Las naturalezas isoméricas de InsP3a-c, InsP4b, InsP7e InsP8 aún son desconocidas. Panel (D) muestra un perfil SAX-HPLC de plantas cultivadas de forma idéntica pero utilizando una columna envejecida (>40 corridas). Una clara reducción de InsP6 en comparación con otras especies de InsP y la ausencia de PP-InsPs es visible. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2.jpg"> Figura 2: Perfil insp representativo de las plantas de L. japonicus.  Perfil SAX-HPLC (A.u2012C) de tipo salvaje de 17 días de edad (Gifu) L. japonicus plántulas radiomarcadas con [3H]-myo-inositol. (A) Espectros completos; (B, C) Zoom-ins del perfil que se muestra en A. Todos los picos visibles se resaltan y se asignan a las especies InsP correspondientes. Basado en las movilizaciones cromatográficas publicadas5,7, InsP4a probablemente representa Ins(1,4,5,6)P4 o Ins(3,4,5,6)P4, InsP5b probablemente representa InsP5 [4-OH] o su forma enantiomérica InsP5 [6-OH], e InsP5c probablemente representa InsP5 [1-OH] o su forma enantiomérica InsP5 [3-OH]. Se desconocen las naturalezas isoméricas de InsP3a-c, InsP4b, InsP7e InsP8. (D) Comparación entre las especies individuales de InsP (en % de la actividad total a partir de la elución 25-u201296) de A. thaliana (datos de la Figura 1A-u2012C)y L. japonicus (datos de la Figura 2A–C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig03.jpg"> Figura 3: Perfiles insP de una muestra dividida que ilustra la reproducibilidad de los análisis SAX-HPLC. (A.u2012C) Perfiles SAX-HPLC de tipo salvaje de 17 días de edad (Col-0) Plántulas Arabidopsis radiomarcadas con [3H]-myo-inositol. Antes de la ejecución, la muestra se dividió y la mitad se ejecutó inmediatamente y la otra mitad un día después del almacenamiento a -80 oC. (A) Espectros completos; (B, C) Zoom-ins del perfil que se muestra en A. Todos los picos visibles se resaltan y se asignan a las especies InsP correspondientes. Sobre la base de las movilizaciones cromatográficas publicadas5,7, InsP4a probablemente representa Ins(1,4,5,6)P4 o Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a representa InsP5 [2-OH], InsP5a representa InsP5 [2-OH], InsP5b representa InsP5 [4-OH] o su forma enantiomérica InsP5 [6-OH], e InsP5c representa InsP5 [1-OH] o su forma enantiomérica InsP5 [3-OH]. Las naturalezas isoméricas de InsP3a-c, InsP4b, InsP7e InsP8 aún son desconocidas. El Panel D muestra la cuantificación del InsP6 y los PP-InsPs InsP7 e InsP8 de ambas ejecuciones. Los valores representan la cantidad (en %) de las respectivas especies de InsP en relación con todas las InsP (actividad total de la elución 25–96). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura suplementaria 1: Configuración del software para el recuento de centelleo líquido utilizando un contador de centelleo ligero. Se representan las capturas de pantalla que muestran la versión del software, así como los ajustes utilizados para el recuento de centelleo de muestras de[3H] realizadas con este protocolo. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig01.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta figura.</a>
Figura complementaria 2: Ejemplo representativo de la normalización de datos. Una captura de pantalla de una hoja de trabajo muestra todos los pasos y fórmulas utilizados para normalizar las ejecuciones SAX-HPLC entre sí. Para simplificar, solo se muestran las fracciones 25–35 de las muestras. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig02.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta figura.</a>
Figura suplementaria 3: Determinación de picos, resta de fondo e integración mediante software de análisis. (A) Los datos del análisis SAX-HPLC se cargan en el software (minutos 28–96) y se selecciona la herramienta de analizador de picos. (Bá52012E) La línea base se define manualmente estableciendo puntos entre picos individuales y se resta el fondo. (F) Los picos se determinan manualmente en función de la apariencia y las movilidades cromatográficas publicadas5,7. LosGrangos de picos se definen manualmente mediante valores cpm. (H) Los picos se integran y calculan como % de todos los picos. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig03.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta figura.</a>

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Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

Aquí describimos fuerte anión intercambio de cromatografía líquida de alto rendimiento de [3H]-myo-inositol-etiquetado plántulas que es un método altamente sensible para detectar y cuantificar polifosfatos de inositol en las plantas.

Extracción y cuantificación de polifosfatos de inositol solubles y radiomarcados de diferentes especies vegetales utilizando SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

El protocolo demostrado aquí puede ayudar a dilucidar la biosíntesis de polifosfatos de inositol de las plantas y responder a preguntas sobre su papel en ciertos aspectos del metabolismo y desarrollo de la planta. Este método es altamente sensible porque el uso del precursor etiquetado radioactivamente de fosfatos de inositol permite la detección confiable de todas las especies de fosfato de inositol en las plantas. La demostración visual de este método es importante porque la mayoría de los biólogos de plantas no están familiarizados con el análisis de HPLC y la configuración necesaria.Además, pasos críticos de este protocolo, como la extracción de fosfatos de inositol, son difíciles de seguir sin la demostración adecuada. Comience por configurar un sistema que consta de dos bombas HPLC independientes, una para el búfer A y otra para el búfer B.Ambas bombas deben ser controladas juntas a través de un ordenador o una bomba maestra. Implemente un lavado de sello de pistón para ambas bombas, ya sea a través de la fuerza gravitacional o a través de una tercera bomba de baja presión.Conecte ambas bombas a un mezclador dinámico y, a continuación, conecte el mezclador a una válvula de inyección con un bucle de muestra que tenga al menos un mililitro de capacidad. Utilice capilares para conectar la válvula de inyección a la columna y la columna al colector de fracciones. Siembre las semillas de loto en una fila en platos cuadrados de Petri llenos de medios de crecimiento sólido que consisten en 0.8%agar bacteriológico en agua desionizada.Permita que las semillas estratifiquen durante al menos tres días a cuatro grados centígrados en la oscuridad. Coloque las semillas en una incubadora de crecimiento. Transfiera de 10 a 20 plántulas en un pozo de una placa de cultivo de célula inferior plana de 12 pozos y clara llena con dos mililitros de solución de sal MS de media resistencia que se complementa con 1% de sacarosa y se ajusta a pH 5.7.Añadir 45 microcurie de 3H myo-inositol a la placa y girar suavemente. Cubra la placa con una tapa y séquela con cinta quirúrgica microporosa. A continuación, vuelva a colocarlo en la incubadora de crecimiento.Después de cinco días de etiquetado, retire las plántulas de los medios de comunicación y lávelas brevemente con agua desionizada. Secarlos con toallas de papel y transferirlos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, asegurándose de no llenar demasiado el tubo. Enganche el tubo en nitrógeno líquido y guárdelo a menos 80 grados Celsius hasta la extracción.Tome las muestras del congelador y manténgalas en nitrógeno líquido hasta que estén listas para usar. Molerlos con un pestillo de tubo de microcentrífuga hasta que comiencen a descongelar, luego agregue 500 microlitros de tampón de extracción de frío helado. Continúe moliendo hasta que la muestra se homogeneice y la solución esté coloreada.Centrifugar las muestras durante 10 minutos a 18.000 veces G y cuatro grados centígrados. A continuación, transfiera el sobrenadante a un tubo fresco de 1,5 mililitros. Los tubos utilizados para la extracción se consideran residuos radiactivos sólidos y deben eliminarse en consecuencia.Añadir cuidadosamente 300 microlitros de tampón de neutralización al extracto, que inmediatamente causará precipitación de proteínas y burbujeo. Después de un minuto, mezcle la muestra con una punta de pipeta y pipetee cinco microlitros en papel de pH para asegurarse de que el pH esté entre siete y ocho. Si es necesario, añada pequeñas cantidades de búfer de neutralización o tampón de extracción hasta que se alcance el pH deseado y deje que las muestras descansen sobre hielo durante al menos una hora con una tapa abierta.A continuación, centrifugarlos durante 10 minutos y transferir el sobrenadante a un tubo fresco de 1,5 mililitros. Equipe el colector de fracción con 96 viales pequeños de centelleo y llene cada vial con dos mililitros de un cóctel de centelleo adecuado que sea compatible con tampones de pH bajo y altas concentraciones de fosfato de amonio. Encienda el sistema HPLC, luego active el lavado del sello del pistón y manténgalo activado durante todo el tramo.Inyecte manualmente la muestra con una jeringa adecuada. Encienda las bombas y el gradiente. Mientras la ejecución de HPLC está en curso, compruebe la presión regularmente.La presión inicial debe ser de alrededor de 18 a 24 bar y debe elevarse lentamente a 50 a 60 bar una vez que se alcanza el 100% de búfer B. Después de la carrera, cierre los viales firmemente y agite vigorosamente las fracciones con el cóctel de centelleo para mezclar. Si no procede directamente con la medición, mantenga los viales en posición vertical en la oscuridad.Para medir las fracciones, inserte los viales en los bastidores de centelleo utilizando bastidores que se ajusten a los viales pequeños y mida cada vial durante cinco minutos en un contador de centelleo líquido. Prepare un gráfico de líneas 2D donde los recuentos medidos por minuto o CPM se tracen con respecto al tiempo de retención. Para comparar muestras entre sí, normalice los datos sumando el CPM de cada fracción eluida del minuto 25 a 96 para cada muestra individual y dividiendo el CPM total de esa muestra por el CPM total de las otras muestras.Para realizar cuantificaciones relativas de ciertos picos de polifosfato de inositol y posteriormente crear gráficos de barras que contengan datos de replicaciones para análisis estadísticos, continúe el análisis con un software especializado que pueda calcular las áreas pico de los cromatogramas. Un espectro completo de polifosfato de inositol obtenido de extractos de A.thaliana después de contar la centelleo se muestra aquí. Los picos están muy bien separados y se pueden asignar a diferentes isómeros.Cuando se utiliza una columna envejecida, una clara reducción de hexakisfosfato de inositol y la ausencia de pirofosfato de inositol es visible. El análisis SAX-HPLC también se realizó en plántulas de L.japonica que fueron cultivadas y etiquetadas en las mismas condiciones que las plántulas de Arabidopsis. Mientras que presumiblemente todas las especies de polifosfato de inositol y picos que se conocen de Arabidopsis se pueden ver, hay diferencias en las cantidades relativas de isómeros específicos de polifosfato de inositol entre las dos especies.Para demostrar que las muestras no tienen que ser analizadas inmediatamente después de la extracción, una muestra se dividió en dos y la mitad de ella se analizó al día siguiente de almacenamiento a menos 80 grados centígrados. Las diferencias entre los perfiles SAX-HPLC de las muestras frescas y congeladas no fueron significativas, lo que demuestra que un ciclo de congelación-descongelación no daña la muestra y que el propio método genera resultados reproducibles. Al intentar este protocolo, siempre moler las muestras a fondo, congelado y con tampón de extracción, y apuntar a un pH cercano a neutro después de la neutralización para asegurar una recuperación máxima de fosfato de inositol radio-etiquetado para el análisis SAX-HPLC.Es posible purificar radioetiquetado a partir de una carrera SAX-HPLC para su uso posterior, por ejemplo en reacciones mutuas mediante la recolección de fracciones sin cócteles de centelleo y la medición de sólo pequeñas alícuotas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Diseño experimental para microdisección láser RNA-Seq: Lecciones de un análisis del desarrollo de la hoja de maíz

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

Investigación

Bioquímica

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Un método de extracción fraccionada simple para el análisis comprensivo de metabolitos, lípidos y proteínas a partir de una sola muestra

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

ARNm Interactome Captura de Planta Protoplastos

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Aislamiento y medidas respiratoria de las mitocondrias de Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fraccionamiento para la resolución de las especies de huntingtina Soluble e Insoluble

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Espectrometría de masa de hoja aerosol: Una técnica rápida ionización ambiental evaluar directamente los metabolitos de los tejidos vegetales

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Extracción de cafeína, la actividad enzimática y la expresión del gen de la sintasa de cafeína de suspensiones celulares de plantas

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Uso en transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de Vitro para el estudio de la dinámica de los complejos de la proteína en una escala de tiempo de milisegundos

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

Análisis de manchas de ARN para la detección y cuantificación de microARN de plantas

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Estimación del contenido de lignina de biomasa vegetal utilizando ácido tioglicólico (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...