Name: extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc
Uploaded: 2020-06-26T15:00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC at JoVE.com

Detta arbete finansierades av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Tyska forskningsstiftelsen) inom ramen för Tysklands excellence strategy - EXC-2070 – 390732324 (PhenoRob), forskningsutbildningsgruppen GRK2064 och individuella forskningsanslag SCHA1274/4-1 och SCHA1274/5-1 till G.S.. Vi tackar också Li Schlüter och Brigitte Ueberbach för tekniskt bistånd.

Författarna har inget att avslöja.

Här presenterar vi en mångsidig och känslig metod för att kvantifiera InsPs inklusive PP-InsPs i växtextrakt och ger praktiska tips om hur man får denna metod etablerad. Även om protokollet i allmänhet är robust kan suboptimala körningar och analyser uppstå. I de flesta fall kan dessa körningar identifieras genom en kraftig minskning eller till och med fullständig förlust av starkt fosforylerade InsPs, särskilt PP-InsP-arten InsP7 och InsP8. Möjliga orsaker kan vara mikrobiella föroreningar av växtmaterialet och otillräcklig deaktivering av endogen växt PP-InsP-hydrolaser vid extraktion på grund av otillräcklig slipning och upptining av växtmaterial som inte kommer att vara i omedelbar kontakt med extraktionsbuffert. Ytterligare skäl inkluderar felaktig pH-justering genom otillräcklig eller överskottstillskott av neutraliseringsbuffert, eller helt enkelt otillräckligt provmaterial. Det senare kan göra det svårt att upptäcka PP-InsPs, eftersom de ofta finns i mycket låga mängder i cellerna. Ett överskott av provmaterial eller ineffektiv torkning under steg 3.5 kan orsaka utspädning av perklorsyran, vilket därför också leder till otillräcklig enzymavaktivering och en specifik förlust av InsP6 och PP-InsPs. Mängden växtmaterial, samt radiolabel som används i detta protokoll optimerades baserat på kostnader och prestanda, och är därför nära det lägsta belopp som fortfarande är tillräckligt för att ge optimala resultat. Dessutom kommer kolonnharts gradvis lös sin upplösningskapacitet. Det första tecknet på denna process är (av skäl som inte helt klart för författarna) en specifik förlust av högre fosforylerade InsP arter som PP-InsPs i HPLC spektrumet. Med ytterligare åldrande, kommer inte ens InsP6 lösas ordentligt av kolumnen (Bild 1D). Därför är användningen av en adekvat kolumn, samt noggrann hantering av provet och korrekt underhåll av HPLC-komponenterna avgörande för att säkerställa korrekta resultat.
När man jämför prover och körningar, särskilt när de genereras med olika utrustning (t.ex., HPLC-system och kolumner) eller på olika dagar, är det avgörande att normalisera proverna till varandra (som beskrivs i steg 7.3) och att analysera dem på samma sätt. Endast genom normalisering är det möjligt och exakt att visa flera prover i samma graf (Bild 3). För kvantifiering av enskilda InsP:er i förhållande till totala InsP-skivor, eller till en annan specifik InsP-art, är det inte nödvändigt att normalisera, så länge som endast relativa värden och inte absolutvärden visas. Helst visas både InsP-profilerna och kvantifieringarna. I vissa fall är det dock inte möjligt att på ett tillfredsställande sätt visa två eller flera körningar i samma graf. Olika kvarhållningstider eller olika nivåer av bakgrundsaktivitet kan göra det svårt att jämföra okvantifierade SAX-HPLC-profiler ensam. Detsamma är det sanna när många prover måste jämföras. I sådana fall är en ytterligare utvärdering med hjälp av ytterligare en programvara (t.ex. Origin) för individuell toppkvantifiering nödvändig.
Författarna är medvetna om att det protokoll som beskrivs här kan optimeras och behöver anpassas till varje enskild forskningsfråga. Även om optimeras för Arabidopsis extrakt 7,17 i detta protokoll, denna metod är mångsidig och kan hjälpa till att bestämma InsP profiler av andra växtarter också. Här exemplifierar vi denna möjlighet genom att för första gången presentera en InsP-profil för L. japonicus, som inte krävde några modifieringar av märkningsförhållandena, InsP-utsug eller SAX-HPLC-körning (Figur 2). Noterbart, medan övergripande liknande, skillnader observeras mellan L. japonicus och Arabidopsis InsP profiler. Till exempel i L. japonicus InsP5 [4-OH] eller dess enantiomeriska form InsP5 [6-OH] är rikligare än InsP5 [1-OH] eller dess enantiomeriska form InsP5 [3-OH] i jämförelse med Arabidopsis, där InsP5 [1-OH] eller dess enantiomeriska form InsP5 [3-OH] är den dominerande InsP5 arter. På samma sätt räknar vi med att förändringar i mediesammansättningen, [3H]- myo-inositol-koncentration, växtålder, miljöförhållanden (t.ex. ljus och temperatur), tillsats av kemiska föreningar eller analyser av växt-mikrobiella interaktioner bland andra faktorer, kan behöva testas och anpassas.myo
En viktig nackdel med denna metod som måste beaktas är att märkningen sker i en (steril) flytande kultur, som inte representerar en fysiologisk miljö för de flesta landväxter. Dessutom, på grund av de höga kostnaderna för [³H]-myo-inositol, volymen av märkningslösningen och storleken på odlingskärlet är i allmänhet begränsad, vilket också begränsar storleken på de växter som kan användas. Odling i flytande kultur kan undvikas genom att direkt infiltrera för exempel blad av jord-odlade växter med [³H]-myo-inositol och därefter efter det protokoll som beskrivs här, som tidigarerapporterats 10.
Det finns flera nackdelar med detta protokoll i jämförelse med alternativa metoder, såsom TiO2 pull-down följt av SIDA eller masspektrometri baserade tekniker. På grund av den [3H]-myo-inositol-märkning, kommer endast InsP-arter som direkt härstammar från radiolabeled myo-inositol att upptäckas till. Den metod som beskrivs här är blind för andra Ins isomerer såsom scyllo-inositol och andra isomerer varav några har identifierats i vissa växter44. Vidare kommer myo-InsPs som härrör från andra vägar att uteslutas, inklusive de som syntetiseras av de novo syntes av myo-inositol och myo-inositol-3-fosfat via isomerisering av glukos-6-fosfat, katalyseras av myo-inositol-3-fosfatsyntas (MIPS) proteiner45. Även om [32P] eller [33P]-orto-fosfat kan användas som alternativa etiketter, utgör deras användning en stor nackdel, eftersom varje fosfathaltig molekyl, inklusive de rikliga nukleotider och dess derivat, kommer att märkas. Dessa molekyler kan också extraheras med detta protokoll och binda till SAX kolumnen, vilket kommer att resultera i en hög nivå av bakgrundsaktivitet som kommer att störa identifieringen av enskilda InsP toppar5. Dessutom kan kvantifiering av [32P]- eller [33P] -märkta InsPs och PP-InsPs påverkas starkt av fosfat och pyrofosfat moiety omsättning och kanske inte rapportera en massa avläsning för inositol arter.
Å andra sidan, [3H]-myo-inositol specifikt etiketter myo-inositol-innehållande molekyler. InsPs, inositol-innehållande lipider, såsom fosfositider, och galactinol är i detta fall märkt. Endast InsPs kommer dock att analyseras med detta protokoll, eftersom lipider är olösliga i extraktionsbufferten och galactinol inte binder till SAX-kolumnen.
Hittills är skillnaderna från en anläggning InsP profil som genereras av [3H]-myo-inositol märkning jämfört med en bestäms av TiO2 pulldown / PAGE fortfarande okänd, eftersom sådana jämförelser inte har utförts i växter. En nyligen genomförd studie i djurceller tog upp denna fråga46. I det arbetet identifierades en pool av InsP6 som är osynlig genom [3H]-myo-inositol-märkning, som därigenom direkt bör härledas från glukos-6-fosfat, genom att jämföra SAX-HPLC-profiler med PAGE geler av däggdjurscelllinjer. 24 h av fosfat svält resulterade i en 150% ökning av InsP6 när kvantifiera SIDA geler av InsPs renas med hjälp av TiO2 pulldown. SAX-HPLC-analyser av [3H]-myo-inositol-märkta celler som behandlades identiskt bara visade en ökning med 15% av [3H]-InsP6. Som tidigare nämnts, InsPs lägre än InsP5 är omöjlig att upptäcka med PAGE analys i de flesta fall. Radiolabeling följt av SAX-HPLC verkar vara den metod för val, så länge masspektrometriska protokoll inte är optimerade för att upptäcka denna grupp av mycket negativt laddade molekyler.
En annan kvarvarande utmaning är att skilja enantiomerer i SAX-HPLC-analyser (eller i någon annan metod för InsP-analys)10,17. Denna utmaning kan hanteras genom tillägg av kirala väljare, dvs, enantiopure föreningar som L-arginin amid som interagerar med respektive enantiomeriska molekyler för att bilda diastereomeric komplex som kan separeras10. Vår kännedom om detta tillvägagångssätt har bara genomförts för att diskriminera den enantiomeriska InsP5 isomerer InsP5 [1-OH] och InsP5 [3-OH] av NMR analyser10. Diskriminering av andra enantiomeriska par eller framgångsrik diskriminering av enantiomerer genom kiral SAX-HPLC-analys eller kirala PAGE-baserade metoder har ännu inte rapporterats och bör utvecklas ytterligare. Med tanke på den bevarade syntesen och den bevarade regleringen av PP-InsPs genom fosfor tillgänglighet, föreställer vi oss att särskilt icke-radioaktiva metoder som PAGE eller MS-baserade metoder, tillsammans med näringsanalyser, kommer att hjälpa marken truthing ansträngningar för att kalibrera fjärranalys data som syftar till att diagnostisera näringsbrist i grödor17,18,24,25. Men den metod som presenteras här kan för närvarande fortfarande anses vara guldmyntfoten för InsP analyser och kommer att vara avgörande för att upptäcka nya funktioner av dessa spännande budbärare i växter.

Nästan fyra decennier sedan, inositol fosfater (InsPs) fram som signalering molekyler, efter Ins(1,4,5)P3 (InsP3) identifierades som en andra budbärare som aktiverar receptor-medierad frisättning av Ca2 + i djurceller1,2. Hittills har ingen InsP3-receptor (IP3-R) identifierats i växter, som ifrågasätter en direkt signalering roll för InsP3 i växtceller3. Oavsett, InsP3 fungerar som en föregångare för andra InsPs som deltar i flera växtutvecklingsprocesser, inklusive reglering av specifika signalering vägar3,4,5,6,7,8. Till exempel kan InsP3 ytterligare fosforyleras till InsP6, även känd som "fytinsyra", som representerar en viktig källa till fosfat, myo-inositoloch katjoner, och visades spela nyckelroller i växtförsvar mot patogener, mRNA export och fosfat homeostas5,9,10,11,12.
Inositol pyrofosfater (PP-InsPs) är en klass av InsPs som innehåller minst en högenergi di-fosfosbindning, ursprungligen identifierade i djurceller, amöba och jäst, där de spelar kritiska roller i olika cellulära processer13,14,15. Trots banbrytande arbete på PP-InsPs i växter16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, de biologiska funktioner och isomer identitet dessa molekyler fortfarande i stort sett gåtfulla. I modellen anläggningen Arabidopsis thaliana, cellulära InsP8 föreslogs att reglera försvar mot insektssmakar och nekrotrofa svampar via sammanträffande-detektion av InsP8 och aktiv jasmonate av ASK1-COI1-JAZ receptor komplexa17. Vidare har roller insP8 och andra PP-InsPs i energi homeostas och näringsämnen avkänning, samt fosfat homeostas föreslagits17,23,24,25,26.
Oavsett vilket biologiskt system som används har en stor metodologisk utmaning vid studier av InsPs varit tillförlitlig detektion och exakt kvantifiering av dessa molekyler. Masspektrometribaserade metoder har använts för att upptäcka InsPs, inklusive PP-InsPs, från cellextrakt. Emellertid, dessa studier misslyckades med att skilja distinkta isomerer26,27. En annan metod för att analysera InsPs sysselsätter pull-down av InsPs från cell lysates med TiO2 pärlor, följt av polyakrylamide gel elektrofores (SIDA) av eluted InsPs. Insp:erna kan sedan färgas av antingen toluidinblått eller DAPI24,28,29. Det är dock än så länge inte möjligt att på ett tillförlitligt sätt upptäcka InsPs lägre än InsP5 från växtextrakt med denna metod. Nyligen publicerades en metod med hjälp av [13C]-myo-inositol för kärnmagnetisk resonans (NMR) analys av InsPs som ett alternativ till stark anjon utbyte högpresterande vätskekromatografi (SAX-HPLC)30. Denna teknik har rapporterats för att uppnå en liknande känslighet jämfört med SAX-HPLC och att tillåta detektion av 5-InsP7, samt diskriminering av olika icke-enantiomeriska InsP5 isomerer från cellextrakt. Genomförandet av den NMR-baserade metoden kräver dock kemiskt syntetiserade och kommersiellt inte tillgängliga [13C]-myo-inositol. Därför är den metod som används i de flesta fall radiolabeling prover med [3H]-myo-inositol, följt av SAX-HPLC31,32,33. Denna teknik är baserad på upptag av radioaktiva myo-inositol i anläggningen och dess omvandling till olika InsPs av den kombinerade aktiviteten av dedikerade cellulära kinaser och fosfataser.
Den [3H]-märkta InsPs är sedan syra-extraherade och fraktionerad med hjälp av SAX-HPLC. På grund av deras negativa laddning interagerar InsPsna starkt med det positivt laddade stationärt arrangerar gradvis av SAX-HPLC kolonnen och kan eluteds med en buffertgradient som innehåller ökande fosfatkoncentrationer för att konkurrera ut InsPs från kolonnen. Elutionstider beror således på laddning och geometri av Den InsP-art som ska avskiljas. I avsaknad av kirala kolumner kan endast icke-enantiomeriska isomerer genom åtskilda av detta protokoll. Men radiolabeled standarder kan användas för att tilldela isomeric karaktär av en specifik InsP topp. Flera insatser i det förflutna av olika laboratorier för att generera märkta och omärkta standarder med (bio)kemiska metoder eller att rena dem från olika celler och organismer har hjälpt tilldela toppar till vissa InsP arter, och även att begränsa den isomeriska identiteten hos enskilda InsP-arter5,7,21,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Också, den senaste klarläggandet av enzymatiska vägar som leder till bildandet av PP-InsPs i växter, samt upptäckten av en bakteriell typ III-effektor med en specifik 1-phytase aktivitet, ge information om hur man genererar användbara standarder för dessa analyser10,17,18,22,23.
De resulterande fraktionerna kan mätas i en vätskescintillationsräknare på grund av β-sönderfall av tritium (3H). Med ökande märkningstid nås en isotopic jämvikt, varefter de erhållna InsP-profilerna ska representera InsP-statusen för anläggningen31. Den stora fördelen med detta protokoll i jämförelse med andra tillgängliga tekniker är den höga känslighet som uppnås genom användning av den direkta föregångaren för InsPs och mätning av en radioaktiv signal.
SAX-HPLC av prover som extraherats från [3H]-myo-inositol-märkta växter eller andra organismer används vanligen för detektion och kvantifiering av InsPs som sträcker sig från lägre InsP-arter till PP-InsPs, vilket representerar ett värdefullt verktyg för att bättre förstå Metabolism, funktion och verkningssätt hos InsPs. Hittills är denna metod också det lämpligaste valet för forskare med särskilt intresse för lägre InsP-arter. Medan grunderna i detta förfarande, på vilket det protokoll som beskrivs här bygger på, har tidigare beskrivits7,21,31,34, ett detaljerat protokoll som är anpassat till analysen av växt-härledda InsPs och särskilt av PP-InsPs saknas fortfarande. Tidigare publikationer rapporterade svårigheter att på ett tillförlitligt sätt upptäcka de låga rikliga PP-InsPs, särskilt InsP8, på grund av en eller flera av följande faktorer: relativt låga mängder växtmaterial, [3H]-myo-inositol med låg specifik aktivitet (> 20 Ci/mmol), användning av extraktionsbuffertar som antingen inte är baserade på perklorsyra eller är mindre koncentrerade än 1 M, olika neutraliserande buffertar, samt suboptimala gradienter eller detektion av [3H] med en on-line detektor. I jämförelse med dessa studier, det protokoll som presenteras här är utformad för tillförlitlig upptäckt av PP-InsPs7,21,34.
Här presenterar vi ett detaljerat arbetsflöde, med början från inställningen av utrustningen till växtodling och märkning, InsP extraktion och SAX-HPLC köra själv. Även om metoden var optimerad till modellen anläggningen A. thaliana, det kan enkelt modifieras för att studera andra växtarter, som visas här med den första rapporterade InsP-profilen av modellen baljväxter Lotus japonicus. Även om användningen av en annan växtart kan kräva viss optimering, vi räknar med att de kommer att vara mindre, vilket gör detta protokoll en bra utgångspunkt för ytterligare forskning i anläggningen InsPs. För att underlätta eventuella optimeringar anger vi varje steg inom protokollet där modifieringar är möjliga, samt alla kritiska steg som kan vara utmanande vid upprättande av metoden för första gången. Dessutom rapporterar vi hur data som erhålls med den här metoden kan användas för kvantifiering av specifika Insp: er och hur olika prover kan analyseras och jämföras.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>model: 5430 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diammonium hydrogen phosphate, &#8805;97 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0268.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, &#8805;99 %, p.a., ACS</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>LAMBDA Instruments GmbH</td>
			<td>model: OMNICOLL single channel collector</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth incubator</td>
			<td>poly klima GmbH</td>
			<td>model: PK 520-LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC pumps</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector for HPLC</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>model: Rheodyne 9725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol, myo-[1,2-3H(N)]</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals Inc.</td>
			<td>ART 0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>University, Chemistry Department</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>model: TRI-CARB 2900TR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pestle</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>CXH7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 &#181;m pore size, 47 mm circle</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>10401770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer for HPLC</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: M 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium, salt mixture</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro software</td>
			<td>OriginLab Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthophosphoric acid, &#8805;85 %, p.a., ISO</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>6366.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partisphere 5 &#181;m SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4621-0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile</td>
			<td>Greiner Bio One International GmbH</td>
			<td>688161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-indicator paper pH 5.5 - 9.0, Neutralit</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>109564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>P743.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>57648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL</td>
			<td>Simport Scientific Inc.</td>
			<td>S207-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench</td>
			<td>LaboGene</td>
			<td>model: ScanLaf MARS 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, &#8805;99,5 %, p.a.</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>6013599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure deionized water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrenchless WVS End Fitting Kit</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4631-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc

Fosfat estrar av myo-inositol, också benämns inositol fosfater (InsPs), är en klass av cellulära regulatorer spelar viktiga roller i växtfysiologi. På grund av deras negativa laddning, låga överflöd och mottaglighet för hydrolytiska aktiviteter, är detektion och kvantifiering av dessa molekyler utmanande. Detta gäller särskilt starkt fosforylerade former som innehåller "högenergibindningar" diphospho obligationer, även benämns inositol pyrofosfater (PP-InsPs). På grund av dess höga känslighet, är stark anjon utbyte högpresterande vätskekromatografi (SAX-HPLC) av växter märkta med [3H]-myo-inositol är för närvarande den metod för val att analysera dessa molekyler. Genom att använda [3H]-myo-inositol till radiolabel växt plantor, olika InsP arter inklusive flera icke-enantiomeriska isomerer kan upptäckas och diskrimineras med hög känslighet. Här beskrivs uppställningen av ett lämpligt SAX-HPLC-system, liksom det kompletta arbetsflödet från växtodling, radiolabeling och InsP-extraktion till SAX-HPLC-körningen och efterföljande dataanalys. Det protokoll som presenteras här möjliggör diskriminering och kvantifiering av olika InsP-arter, inklusive flera icke-enantiomeriska isomerer och av PP-InsPs, InsP7 och InsP8, och kan lätt anpassas till andra växtarter. Som exempel utförs SAX-HPLC analyser av Arabidopsis thaliana och Lotus japonicus plantor och komplett InsP profiler presenteras och diskuteras. Den metod som beskrivs här utgör ett lovande verktyg för att bättre förstå InsPs biologiska roller i växter.

De resultat som visas här syftar till att illustrera möjliga utfall som erhållits enligt variationer på tekniska och biologiska nivåer. Den första exemplifieras genom analyser med hjälp av nya mot åldrade kolumner (figur 1) och färska kontra lagrade prover (figur 3), och den andra genom att utvärdera utdrag ur två olika växtsystem, A. thaliana (Figur 1, Figur 3) och L. japonicus (Figur 2).
En optimal SAX-HPLC kör avbildas på figur 1A\u2012C, som visar en komplett inositol polyfosfat spektrum som erhållits från A. thaliana extrakt efter scintillation räkna. Observera att toppar är fint separerade och kan tilldelas olika isomerer (eller enantiomer-par) baserat på kromatografiska mobiliteter som beskrivstidigare 5,7.
Figur 2 visar det representativa resultatet av en SAX-HPLC-analys av L. japonicus plantor som odlades och var märkta under samma förhållanden som de Arabidopsis plantor. Medan förmodligen alla InsP arter och toppar som är kända från Arabidopsis kan ses, det finns betydande skillnader när det gäller den relativa (t.ex. nyckeltal mellan isomerer) mängd specifika InsP isomerer, vid jämförelse av profiler av båda arterna. Till exempel visade Lotus extrakt ökade InsP3c, InsP4b, InsP5b och minskade InsP3a, InsP4a, InsP5a och InsP5c jämfört med Arabidopsis som lämnar utrymme för ytterligare undersökningar. Bild 2D illustrerar de olika nyckeltalen mellan InsP-isomerer mellan Arabidopsis och Lotus.
Bild 3 visar två InsP-profiler av ett prov som delades efter extraktionen. Första halvlek analyserades omedelbart och den andra halvan en dag senare, efter förvaring vid -80 °C. Observera att endast mindre skillnader observeras mellan de olika proverna (dvs. svarta och röda linjer på figur 3A\u2012C, och bild 3D). Detta illustrerar att en frys-töcykel inte skadar provet och att själva metoden genererar reproducerbara resultat.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig01.jpg"> Bild 1: Typisk InsP-profil för en lyckad och av en misslyckad SAX-HPLC-analys som utförs med detta protokoll. (A\u2012C) SAX-HPLC profil av 17-dagsgamla vild-typ (Col-0) Arabidopsis plantor radiolabeled med [3H]-myo-inositol. Global InsP utvinning och SAX-HPLC köras utfördes samma dag. (A) Full spektra; (B, C) Zoom-ins av profilen som visas i A. Alla synliga toppar markeras och tilldelas motsvarande InsP-arter. Baserat på publicerade kromatografiska mobiliteter5,7, representerar InsP4a sannolikt Ins(1,4,5,6)P4 eller Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a representerar InsP5 [2-2-2-6 OH], Representerar InsP5b 5 [4-OH] eller dess enantiomeriska form InsP5 [6-OH], och InsP5c representerar InsP5 [1-OH] eller dess enantiomeriska form InsP5 [3-OH]. Den isomeric natures av InsP3a-c, InsP4b, InsP7, och InsP8 är fortfarande okända. Panel (D) visar en SAX-HPLC profil av identiskt odlade växter men med hjälp av en åldrad kolumn (>40 körningar). En tydlig minskning av InsP6 jämfört med andra InsP-arter och frånvaron av PP-InsPs är synlig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig01large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2.jpg"> Figur 2: Representativ InsP-profil för L. japonicusväxter.  SAX-HPLC profil (A\u2012C) av 17-dagsgamla vild-typ (Gifu) L. japonicus plantor radiolabeled med [3H]-myo-inositol. (A) Full spektra; (B, C) Zoom-ins av profilen som visas i A. Alla synliga toppar markeras och tilldelas motsvarande InsP-arter. Baserat på publicerade kromatografiska mobiliteter5,7, representerar InsP4a sannolikt Ins(1,4,5,6)P4 eller Ins(3,4,5,6)P4, InsP5b sannolikt representerars InsP5 [4-OH] eller dess enantiomeriska form InsP5 [6-OH], och InsP5c sannolikt representerar InsP5 [1-OH] eller dess enantiomeriska form InsP5 [3-OH]. Den isomeric naturer av InsP3a-c, InsP4b, InsP7, och InsP8 är okända. (D) Jämförelse mellan de enskilda InsP-arterna (i % av total aktivitet från eluering 25\u201296) av A. thaliana (uppgifter från figur 1A\u2012C) och L. japonicus (uppgifter från figur 2A–C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig03.jpg"> Figur 3: InsP-profiler av ett delat prov som illustrerar reproducerbarheten hos SAX-HPLC-analyser. (A\u2012C) SAX-HPLC profiler av 17-dagsgamla vild-typ (Col-0) Arabidopsis plantor radiolabeled med [3H]-myo-inositol. Före körningen delades provet och ena halvkörningen omedelbart och den andra hälften en dag senare efter lagring vid -80 °C. (A) Fullspektra; (B, C) Zoom-ins av profilen som visas i A. Alla synliga toppar markeras och tilldelas motsvarande InsP-arter. Baserat på publicerade kromatografiska mobiliteter5,7, Representerar InsP4a sannolikt Ins(1,4,5,6)P4 eller Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a represents InsP5 [2-OH], InsP5a represents InsP5 [2-OH], InsP5b representerar InsP5 [4-OH] eller dess enantiomeriska form InsP5 [6-OH], och InsP5c representerar InsP5 [1-OH] eller dess enantiomeriska form InsP5 [3-OH]. Den isomeric natures av InsP3a-c, InsP4b, InsP7, och InsP8 är fortfarande okända. Panel D visar kvantifieringen av InsP6 och PP-InsPs InsP7 och InsP8 av båda körningarna. Värdena representerar beloppet (i %) av respektive InsP-art i förhållande till alla InsP (total aktivitet från eluering 25–96). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig03large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
Kompletterande figur 1: Programvaruinställningar för vätskescintillationsräkning med hjälp av en ljusscintillationsräknare. Skärmdumpar som visar programvaruversionen, samt inställningar som används för scintillation räkning av [3H] prover som utförs med detta protokoll avbildas. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig01.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.</a>
Kompletterande figur 2: Representativt exempel på data normalisering. En skärmbild av ett kalkylblad visar alla steg och formler som används för att normalisera SAX-HPLC körs till varandra. För förenkling visas endast bråk 25–35 av prov. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig02.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.</a>
Kompletterande figur 3: Peak bestämning, bakgrund subtraktion och integration med hjälp av analys programvara. (A) Data från SAX-HPLC-analys läses in i programvaran (minuter 28–96) och toppanalyserverktyget är valt. (B\u2012E) Baslinjen definieras manuellt genom att poäng mellan enskilda toppar och bakgrunden subtraheras. (F) Toppar bestäms manuellt baserat på utseende och publicerade kromatografisk mobiliteter5,7. (G) Toppintervall definieras manuellt av CPM-värden. (H) Toppar är integrerade och beräknas som % av alla toppar. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig03.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC at JoVE.com

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

Här beskriver vi starka anjon utbyte högpresterande flytande kromatografi av [3H]-myo-inositol-märkt plantor som är en mycket känslig metod för att upptäcka och kvantifiera inositol polyfosfater i växter.

Utvinning och kvantifiering av Lösliga, Radiolabeled Inositol Polyfosfater från Olika Växtarter med hjälp av SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

Protokollet som demonstreras här kan hjälpa till att klarlägga biosyntesen av inositol polyfosfater av växter och för att svara på frågor angående deras roll i vissa aspekter av växternas metabolism och utveckling. Denna metod är mycket känslig eftersom användningen av den radioaktivt märkta föregångaren till inositolfosfater möjliggör tillförlitlig upptäckt av alla inositolfosfatarter i växter. Visuell demonstration av denna metod är viktig eftersom de flesta växtbiologer är obekanta med HPLC-analys och den nödvändiga inställningen.Dessutom kritiska steg i detta protokoll, som utvinning av inositol fosfater, är svåra att följa utan ordentlig demonstration. Börja med att ställa in ett system som består av två oberoende HPLC-pumpar, en för buffert A och en för buffert B.Båda pumparna behöver styras tillsammans via en dator eller en masterpump. Implementera en kolvstälstvätt för båda pumparna, antingen via gravitationskraft eller genom en tredje lågtryckspump.Anslut båda pumparna till en dynamisk mixer, anslut sedan mixern till en insprutningsventil med en provslinga som har minst en milliliterkapacitet. Använd kapillärer för att ansluta injektionsventilen till kolonnen och kolonnen till fraktionssamlaren. Sugga ut lotusfrön i en rad på kvadrat petriskålar fyllda med solida tillväxtmedia bestående av 0,8%bakteriologisk agar i avjoniserat vatten.Låt fröna att stratifiera i minst tre dagar vid fyra grader Celsius i mörkret. Placera fröna i en tillväxtinkubator. Överför 10 till 20 plantor i en brunn av en 12-väl tydlig platt botten cellkultur tallrik fylld med två milliliter halvstyrka MS saltlösning som kompletteras med 1%sackaros och justeras till pH 5,7.Tillsätt 45 mikrokuri av 3H myo-inositol till plattan och snurra den försiktigt. Täck plattan med ett lock och försegla den med mikroporös operationstejp. Placera sedan tillbaka den i tillväxtinkubatorn.Efter fem dagars märkning, ta bort plantor från media och tvätta dem kort med avjoniserat vatten. Torka dem med hushållspapper och överför dem till en 1,5 milliliter microcentrifug röret, se till att inte överfylla röret. Snap frysa röret i flytande kväve och förvara den på minus 80 grader Celsius tills extraktion.Ta proverna från frysen och förvara dem i flytande kväve tills de är färdiga att användas. Mala dem med en microcentrifug röret mortelstöt tills de börjar tina, tillsätt sedan 500 mikroliter av iskall extraktion buffert. Fortsätt slipningen tills provet är homogeniserat och lösningen är färgad.Centrifugera proverna i 10 minuter vid 18, 000 gånger G och fyra grader Celsius. Överför sedan supernatanten till ett färskt 1,5 milliliterrör. De rör som används för extraktion anses vara fast radioaktivt avfall och behöver kasseras i enlighet med detta.Tillsätt försiktigt 300 mikroliter av neutraliseringsbuffert till extraktet, vilket omedelbart kommer att orsaka utfällning av proteiner och bubblande. Efter en minut, blanda provet med en pipettspets och pipetter fem mikroliter på pH-papper för att se till att pH-värdet är mellan sju och åtta. Om det behövs, tillsätt små mängder av antingen neutraliseringsbuffert eller extraktionsbuffert tills önskat pH-värde har uppnåtts och låt proverna vila på is i minst en timme med öppet lock.Sedan centrifug dem i 10 minuter och överföra supernatanten i en färsk 1,5 milliliter rör. Utrusta fraktionsuppsamlaren med 96 små scintillationsdrinaler och fyll varje injektionsflaska med två milliliter av en lämplig scintillationscocktail som är kompatibel med låga pH-buffertar och höga ammoniumfosfatkoncentrationer. Starta HPLC-systemet, aktivera sedan kolvtätningens tvätt och håll den aktiverad under hela körningen.Injicera provet manuellt med en lämplig spruta. Starta pumparna och lutningen. Medan HPLC-körningen pågår, kontrollera trycket regelbundet.Starttrycket bör ligga runt 18 till 24 bar och bör långsamt stiga till 50 till 60 bar när 100%buffert B har uppnåtts. Efter körningen, stäng injektionsflaskan tätt och kraftigt skaka fraktionerna med scintillation cocktail att blanda. Om du inte fortsätter direkt med mätningen, håll injektionsflaskan i upprätt läge i mörker.För att mäta fraktionerna, sätt in injektionsflaskan i scintillationsdiskracken med hjälp av rack som passar de små injektionsflaskan och mäter varje injektionsflaska i fem minuter i en vätskescintillationsräknare. Förbered ett 2D-linjediagram där de uppmätta antalen per minut eller CPM ritas mot kvarhållningstiden. För att jämföra prover med varandra normaliserar du uppgifterna genom att summera CPM från varje eluterad fraktion från minut 25 till 96 för varje enskilt prov och genom att dividera det totala CPM:en från det provet med de andra provernas totala CPM.För att utföra relativa kvantifieringar av vissa inositol polyfosfattoppar och för att därefter skapa stapeldiagram som innehåller data av replikationer för statistiska analyser, fortsätt analysen med en specialiserad programvara som kan beräkna toppområden av kromatogram. En komplett inositol polyfosfat spektrum som erhållits från A.thaliana extrakt efter scintillation räkna visas här. Topparna är fint separerade och kan tilldelas olika isomerer.När en åldrad kolonn används, en tydlig minskning av inositol hexakisfosfat och frånvaron av inositol pyrofosfat är synlig. SAX-HPLC analys utfördes också på L.japonica plantor som odlades och märkt under samma villkor som de Arabidopsis plantor. Medan förmodligen alla inositol polyfosfat arter och toppar som är kända från Arabidopsis kan ses, det finns skillnader i de relativa mängderna av specifika inositol polyfosfat isomerer mellan de två arterna.För att visa att prover inte behöver analyseras omedelbart efter extraktion, delades ett prov i två och hälften av det analyserades nästa dag efter lagring vid minus 80 grader Celsius. Skillnaderna mellan SAX-HPLC-profilerna för de färska och frysta proverna var inte signifikanta, vilket visar att en frys-töcykel inte skadar provet och att själva metoden genererar reproducerbara resultat. När du försöker detta protokoll, slipa alltid proverna noggrant, fryst och med extraktionsbuffert, och sikta på nära neutralt pH efter neutralisering för att säkerställa en maximal återhämtning av radio-märkt inositolfosfat för SAX-HPLC-analys.Det är möjligt att rena radiomärkta från en SAX-HPLC-körning för senare användning, till exempel i ömsesidiga reaktioner genom att samla fraktioner utan scintillationscocktails och endast mäta små alikvoter.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Experimentell design för Laser Microdissection RNA-Seq: Lektionerna från en analys av majs Leaf utveckling

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

En enkel fraktionerad extraktionsmetod för den omfattande analysen av metaboliter, lipider och proteiner från en enda prov

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA-interaktomfångst från plant protoplaster

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolering och respiratoriska mätningar av mitokondrier från Arabidopsis thaliana.

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fraktionering för upplösning av lösliga och olösliga Huntingtin arter

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Leaf Spray masspektrometri: En snabb omgivande jonisering teknik för att direkt bedöma metaboliter från växt vävnader

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Koffein utvinning, enzymaktivitet och genuttryck av koffein syntas från växten cellsuspensioner

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Använda i Vitro fluorescens resonans energiöverföring att studera dynamiken i proteinkomplex på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

RNA Blot Analys för detektion och kvantifiering av Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Uppskattning av växtbiomassa Ligninhalt med tioglykolsyra (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...