Name: systems analysis of the neuroinflammatory and hemodynamic response to traumatic brain injury
Uploaded: 2022-05-27T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Systems Analysis of the Neuroinflammatory and Hemodynamic Response to Traumatic Brain Injury at JoVE.com

Ce projet a été soutenu par les National Institutes of Health R21 NS104801 (EMB) et R01 NS115994 (LBW/EB) et Children’s Healthcare of Atlanta Junior Faculty Focused Award (EMB). Ce travail a également été soutenu par le département de la Défense des États-Unis par le biais des programmes de recherche médicale dirigés par le Congrès sous le numéro de bourse. W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB). Les opinions, interprétations, conclusions et recommandations sont celles de l’auteur et ne sont pas nécessairement approuvées par le ministère de la Défense. Ce matériel est basé sur des travaux soutenus par le Programme de bourses de recherche pour diplômés de la National Science Foundation dans le cadre de la subvention n ° 1937971. Toutes les opinions, constatations et conclusions ou recommandations exprimées dans ce document sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les points de vue de la National Science Foundation.

Toutes les procédures animales sont approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Emory (IACUC) et ont suivi les lignes directrices des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.
1. Modèle de perte de poids d’une lésion cérébrale traumatique légère
<ol><li>Préparez la configuration du poids. Montez une visière sur une surface plane avec un tube de guidage de 1 m (2,54 cm de diamètre intérieur) aligné ve...

<ol>
	<li>Langlois, J. A., Rutland-Brown, W., Wald, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+and+impact+of+traumatic+brain+injury:+a+brief+overview.">The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview.</a> Journal of Head Trauma Rehabilitation. 21 (5), 375-378 (2006).</li><li>Iraji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+State+Functional+Connectivity+in+Mild+Traumatic+Brain+Injury+at+the+Acute+Stage:+Independent+Component+and+Seed-Based+Analyses.">Resting State Functional Connectivity in Mild Traumatic Brain Injury at the Acute Stage: Independent Component and Seed-Based Analyses.</a> Journal of Neurotrauma. 32 (14), 1031-1045 (2015).</li><li>Guskiewicz, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cumulative+effects+associated+with+recurrent+concussion+in+collegiate+football+players:+the+NCAA+Concussion+Study.">Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study.</a> Journal of the American Medical Association. 290 (19), 2549-2555 (2003).</li><li>Longhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+window+of+vulnerability+to+repetitive+experimental+concussive+brain+injury.">Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury.</a> Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).</li><li>Committee on Sports-Related Concussions in Youth, Board on Children, Youth, and Families, Institute of Medicine, National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sports-Related Concussions in Youth: Improving the Science, Changing the Culture. , (2014).</li><li>Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Molecular+Pathophysiology+of+Concussive+Brain+Injury+-+an+Update.">The Molecular Pathophysiology of Concussive Brain Injury - an Update.</a> Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 27 (2), 373-393 (2016).</li><li>McCrory, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+statement+on+concussion+in+sport--the+4th+International+Conference+on+Concussion+in+Sport+held+in+Zurich,+November+2012.">Consensus statement on concussion in sport--the 4th International Conference on Concussion in Sport held in Zurich, November 2012.</a> Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (2), 89-117 (2012).</li><li>Belanger, H. G., Vanderploeg, R. D., Curtiss, G., Warden, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+neuroimaging+techniques+in+mild+traumatic+brain+injury.">Recent neuroimaging techniques in mild traumatic brain injury.</a> Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences. 19 (1), 5-20 (2007).</li><li>Sours, C., Zhuo, J., Roys, S., Shanmuganathan, K., Gullapalli, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+in+Resting+State+Functional+Connectivity+and+Cerebral+Blood+Flow+in+Mild+Traumatic+Brain+Injury+Patients.">Disruptions in Resting State Functional Connectivity and Cerebral Blood Flow in Mild Traumatic Brain Injury Patients.</a> PLoS ONE. 10 (8), 0134019 (2015).</li><li>Buckley, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+Microvascular+Cerebral+Blood+Flow+Assessed+by+Diffuse+Correlation+Spectroscopy+after+Repetitive+Concussions+in+Mice.">Decreased Microvascular Cerebral Blood Flow Assessed by Diffuse Correlation Spectroscopy after Repetitive Concussions in Mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 35 (12), 1995-2000 (2015).</li><li>Sankar, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+cerebral+blood+flow+is+a+non-invasive+biomarker+of+neuroinflammation+after+repetitive+mild+traumatic+brain+injury.">Low cerebral blood flow is a non-invasive biomarker of neuroinflammation after repetitive mild traumatic brain injury.</a> Neurobiology of Disease. 124, 544-554 (2019).</li><li>Vagnozzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+window+of+metabolic+brain+vulnerability+to+concussions:+mitochondrial-related+impairment--part+I.">Temporal window of metabolic brain vulnerability to concussions: mitochondrial-related impairment--part I.</a> Neurosurgery. 61, 379-388 (2007).</li><li>Longhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+window+of+vulnerability+to+repetitive+experimental+concussive+brain+injury.">Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury.</a> Neurosurgery. 56, 364-374 (2005).</li><li>Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intensity-+and+interval-specific+repetitive+traumatic+brain+injury+can+evoke+both+axonal+and+microvascular+damage.">Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage.</a> Journal of Neurotrauma. 29, 2172-2180 (2012).</li><li>Angoa-Perez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+sports-related+head+injury:+bridging+the+gap+between+preclinical+research+and+clinical+reality.">Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between preclinical research and clinical reality.</a> Journal of Neurochemistry. 129, 916-931 (2014).</li><li>Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+traumatic+brain+injury+in+the+juvenile+rat+is+associated+with+increased+axonal+injury+and+cognitive+impairments.">Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments.</a> Developmental Neuroscience. 32, 510-518 (2010).</li><li>Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Saljo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concussion+in+professional+football:+animal+model+of+brain+injury--part+15.">Concussion in professional football: animal model of brain injury--part 15.</a> Neurosurgery. 64, 1162-1173 (2009).</li><li>Kane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+human+repetitive+mild+traumatic+brain+injury.">A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).</li><li>Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Recovery+Time+Between+Injuries+Improves+Cognitive+Outcome+After+Repetitive+Mild+Concussive+Brain+Injuries+in+Mice.">Increasing Recovery Time Between Injuries Improves Cognitive Outcome After Repetitive Mild Concussive Brain Injuries in Mice.</a> Neurosurgery. 71 (4), 885-892 (2012).</li><li>Durduran, T., Yodh, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+correlation+spectroscopy+for+non-invasive,+micro-vascular+cerebral+blood+flow+measurement.">Diffuse correlation spectroscopy for non-invasive, micro-vascular cerebral blood flow measurement.</a> NeuroImage. 85, 51-63 (2014).</li><li>Sathialingam, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+separation+diffuse+correlation+spectroscopy+for+measurement+of+cerebral+blood+flow+in+rodents.">Small separation diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow in rodents.</a> Biomedical Optics Express. 9 (11), 5719 (2018).</li><li>Lee, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+optical+assessment+of+resting-state+cerebral+blood+flow+in+children+with+sickle+cell+disease.">Noninvasive optical assessment of resting-state cerebral blood flow in children with sickle cell disease.</a> Neurophotonics. 6 (03), 1 (2019).</li><li>Wang, H., Liu, Q., Tu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+partial+least-squares+regression+models+with+VARIMAX+rotation.">Interpretation of partial least-squares regression models with VARIMAX rotation.</a> Partial Least Squares. 48 (1), 207-219 (2005).</li><li>Eriksson, L., Byrne, T., Johansson, E., Trygg, J., Vikstr&#246;m, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-+and+Megavariate+Data+Analysis+Basic+Principles+and+Applications.">Multi- and Megavariate Data Analysis Basic Principles and Applications.</a> Umetrics Academy. , (2013).</li><li>Conzen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+and+regional+hemodynamics+of+isoflurane+and+sevoflurane+in+rats.">Systemic and regional hemodynamics of isoflurane and sevoflurane in rats.</a> Anesthesia and Analgesia. 74 (1), 79-88 (1992).</li><li>Durduran, T., Choe, R., Baker, W. B., Yodh, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+optics+for+tissue+monitoring+and+tomography.">Diffuse optics for tissue monitoring and tomography.</a> Reports on Progress in Physics. 73 (7), 076701 (2010).</li><li>Lee, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+separation+frequency-domain+near-infrared+spectroscopy+for+the+recovery+of+tissue+optical+properties+at+millimeter+depths.">Small separation frequency-domain near-infrared spectroscopy for the recovery of tissue optical properties at millimeter depths.</a> Biomedical Optics Express. 10 (10), 5362-5377 (2019).</li><li>. plsRglm: Partial Least Squares Regression for Generalized Linear Models Available from: <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=pplsRglm">https://CRAN.R-project.org/package=pplsRglm</a> (2019)</li><li>White, B. R., Bauer, A. Q., Snyder, A. Z., Schlaggar, B. L., Lee, J. M., Culver, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+functional+connectivity+in+the+mouse+brain.">Imaging of functional connectivity in the mouse brain.</a> PLoS One. 6, 16322 (2011).</li><li>Buckley, E. M., Parthasarathy, A. B., Grant, P. E., Yodh, A. G., Franceschini, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+correlation+spectroscopy+for+measurement+of+cerebral+blood+flow:+future+prospects.">Diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow: future prospects.</a> Neurophotonics. 1 (1), 011009 (2014).</li><li>Rowan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrovascular+reactivity+measured+in+awake+mice+using+diffuse+correlation+spectroscopy.">Cerebrovascular reactivity measured in awake mice using diffuse correlation spectroscopy.</a> Neurophotonics. 8 (1), (2021).</li><li>Tate, J., Ward, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferences+in+immunoassay.">Interferences in immunoassay.</a> The Clinical Biochemist. Reviews. 25 (2), 105-120 (2004).</li><li>Staples, E., Ingram, R. J. M., Atherton, J. C., Robinson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+the+quantification+of+cytokines+present+at+low+concentrations+in+small+human+mucosal+tissue+samples+using+Luminex+assays.">Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays.</a> Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).</li><li>Gierut, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network-level+effects+of+kinase+inhibitors+modulate+TNF-&#945;-induced+apoptosis+in+the+intestinal+epithelium.">Network-level effects of kinase inhibitors modulate TNF-&#945;-induced apoptosis in the intestinal epithelium.</a> Science Signaling. 8 (407), 129 (2015).</li></ol>

Nous détaillons ici les méthodes d’évaluation de la réponse hémodynamique et neuroinflammatoire à une lésion cérébrale traumatique légère répétitive. De plus, nous avons montré comment intégrer ces données dans le cadre d’une analyse de systèmes multivariés utilisant la régression partielle des moindres carrés. Dans le texte ci-dessous, nous discuterons de certaines des étapes clés et des limites associées au protocole ainsi que des avantages / inconvénients des méthodes par rapport aux méth...

Aperçu Les lésions cérébrales traumatiques légères (TBI) touchent environ 1,6 à 3,8 millions d’athlètes chaque année1. Ces blessures, y compris les commotions cérébrales et commotionnelles, peuvent laisser les patients avec des symptômes physiques, émotionnels, psychologiques et cognitifs transitoires2. De plus, les ITM répétitifs (ITMR) maintenus dans une « fenêtre de vulnérabilité » peuvent entraîner une gravité et une durée cumulatives des conséquences cognitives qui durent plus longtemps que les effets d’un seul TCC seul3, et finalement même à une perte permanente de la fonction 4,5,6. Bien que de nombreux patients se rétablissent dans un délai relativement court (<1 semaine), 10 à 40% des patients souffrent d’effets plus durables du TCC pendant > 1 mois, certains pouvant durer jusqu’à 1 an 3,7,8,9. Malgré la prévalence élevée et les conséquences durables de ces blessures, les mécanismes des blessures sont mal compris et aucune stratégie de traitement efficace n’existe.
Compte tenu de la grande variabilité des résultats après un TCC/ITRM, l’un des défis à relever pour identifier les déclencheurs moléculaires à un stade précoce des tissus obtenus dans les études sur les ITCm/ITRM en phase terminale est le manque de données longitudinales démontrant des « liens moléculaires aigus » définitifs de ces déclencheurs moléculaires avec des résultats à plus long terme. Pour surmonter ce défi, notre groupe a découvert que le débit sanguin cérébral extrêmement réduit mesuré de manière aiguë à l’aide d’un outil optique appelé spectroscopie de corrélation diffuse (DCS) est fortement corrélé avec les résultats cognitifs à long terme dans un modèle murin de rmTBI10. En utilisant ce biomarqueur hémodynamique, nous avons montré que les souris ayant un flux sanguin cérébral extrêmement bas (et, par extension, un résultat à long terme prédit pire) ont des augmentations aiguës concomitantes de la signalisation phospho neuronale dans les voies MAPK et NFκB, une augmentation de l’expression neuronale des cytokines pro-inflammatoires et une augmentation de l’expression du marqueur phagocytaire / microglial Iba111 . Ces données suggèrent un rôle possible pour la signalisation neuronale des phosphos, l’expression des cytokines et l’activation microgliale à la fois dans la régulation aiguë du flux sanguin cérébral après une blessure ainsi que dans le déclenchement d’une cascade de signalisation qui conduit à un dysfonctionnement neuronal et à des résultats cognitifs pires. Ici, nous détaillons notre approche pour sonder simultanément l’environnement hémodynamique et neuroinflammatoire après rmTBI et comment intégrer ces ensembles de données complexes. Plus précisément, nous décrivons les procédures pour quatre étapes clés de cette approche globale : (1) un modèle de perte de poids de lésion cérébrale traumatique légère, (2) l’évaluation du flux sanguin cérébral avec spectroscopie de corrélation diffuse, (3) la quantification de l’environnement neuroinflammatoire et (4) l’intégration des données (Figure 1). Ci-dessous, nous fournissons une brève introduction à chacune de ces étapes clés pour aider à guider les lecteurs à travers la raison d’être de nos méthodes. Le reste du manuscrit fournit un protocole détaillé pour chacune de ces étapes clés.
Modèle de perte de poids d’une lésion cérébrale traumatique légère Bien qu’il existe de nombreux excellents modèles précliniques de TCC légerrépétitifs 12,13,14,15,16,17,18, nous utilisons un modèle de lésion de la tête fermée bien établi et cliniquement pertinent. Les principales caractéristiques de ce modèle comprennent (1) l’impact contondant du crâne et du cuir chevelu intact suivi d’une rotation sans restriction de la tête autour du cou, (2) aucune lésion cérébrale structurelle manifeste, œdème, lésion de la barrière hémato-encéphalique, mort cellulaire aiguë ou perte chronique de tissu cérébral, et (3) déficits cognitifs persistants (jusqu’à 1 an) qui n’apparaissent qu’après plusieurs coups19 (Figure 2).
Évaluation du flux sanguin cérébral par spectroscopie de corrélation diffuse La spectroscopie de corrélation diffuse (DCS) est une technique optique non invasive qui mesure le flux sanguin 5,20,21. Dans DCS, une source de lumière proche infrarouge est placée à la surface du tissu. Un détecteur est placé à une distance fixe de la source à la surface du tissu pour détecter la lumière qui s’est multipliée diffusée à travers le tissu (Figure 3). La diffusion des globules rouges en mouvement fait fluctuer l’intensité lumineuse détectée avec le temps. Un modèle analytique simple connu sous le nom de théorie de la diffusion de corrélation est utilisé pour relier ces fluctuations d’intensité à un indice de flux sanguin (CBFi, Figure 4). Bien que les unités de CBFi (cm2/s) ne soient pas les unités traditionnelles de débit (mL/min/100 g), une étude antérieure chez la souris a montré que la CBFi est fortement corrélée au flux sanguin cérébral mesuré par IRM21 marquée par spin artériel.
À titre de référence, l’instrument DCS utilisé ici a été construit en interne et est composé d’un laser de 852 nm de longueur de cohérence, d’un réseau de photodiodes d’avalanche de comptage de 4 photons et d’une carte d’autocorrélation matérielle (tau unique, 8 canaux, temps d’échantillonnage minimum de 100 ns)21,22. Les données sont acquises avec un logiciel maison écrit en LabView. L’interface animale de l’appareil se compose d’une fibre source multimode de 400 μm (gamme de longueurs d’onde de 400 à 2200 nm, noyau de silice pure, revêtement dur TECS) et d’une fibre de détection monomode de 780 nm (gamme de longueurs d’onde de 780 à 970 nm, noyau de silice pure, revêtement dur TECS, coupure de 730 ± de 30 nm en deuxième mode) espacée de 6 mm et intégrée dans un capteur noir imprimé en 3D (4 mm x 8 mm, Graphique 3).
Quantification de l’environnement neuro-inflammatoire Bien que la neuroinflammation soit régulée par divers processus cellulaires, deux mécanismes clés pertinents sont la signalisation extracellulaire par les cytokines/chimiokines et la signalisation intracellulaire par les phospho-protéines. Pour étudier l’environnement neuro-inflammatoire du cerveau après une lésion, les cerveaux sont extraits de souris, microdisséqués, et les cytokines/chimiokines et les phospho-protéines sont quantifiées à l’aide de Luminex (Figure 5, Figure 6, Figure 7). Les immunoessais multiplexés Luminex permettent la quantification simultanée d’une collection diversifiée de ces protéines en couplant des tests immuno-enzymatiques (ELISA) à des billes magnétiques marquées par fluorescence. Des étiquettes fluorescentes distinctes sont utilisées pour chaque protéine d’intérêt, et les perles de chaque étiquette sont fonctionnalisées avec un anticorps de capture contre cette protéine particulière. Des centaines de perles pour capturer chaque protéine sont mélangées ensemble, placées dans une plaque de 96 puits et incubées avec un échantillon. Après l’incubation de l’échantillon, un aimant est utilisé pour piéger les perles dans le puits pendant que l’échantillon est lavé. Ensuite, l’anticorps de détection biotinylé se lie à l’analyte d’intérêt pour former un sandwich anticorps-antigène similaire à un ELISA traditionnel, mais avec l’ELISA pour chaque protéine se produisant sur une perle différente marquée par fluorescence. L’ajout de streptavidine conjuguée à la phycoérythrine (SAPE) complète chaque réaction. L’instrument Luminex lit ensuite les perles et sépare le signal en fonction de chaque étiquette fluorescente / protéine.
Intégration des données En raison du grand nombre d’analytes (p. ex. cytokines) mesurés dans le test Luminex, l’analyse des données peut être difficile à interpréter si chaque protéine quantifiée est analysée individuellement. Pour simplifier l’analyse et saisir les tendances observées chez les analytes, nous utilisons une méthode d’analyse multivariée appelée régression partielle des moindres carrés (PLSR, Figure 8)23. Le PLSR fonctionne en identifiant un axe de poids correspondant à chaque protéine mesurée (c.-à-d. cytokines ou phospho-protéines, appelées « variables prédictives ») qui, ensemble, expliquent de manière optimale la co variance des protéines mesurées avec une variable de réponse (p. ex., le flux sanguin cérébral). Les poids sont appelés « charges » et sont assemblés en un vecteur connu sous le nom de variable latente (LV). En projetant (ce qu’on appelle le « scoring ») les données sur les protéines mesurées sur chacune des deux LV, les données peuvent être retracées en termes de ces LV. Après avoir calculé le PLSR, nous utilisons une rotation varimax pour identifier un nouveau LV qui maximise la covariance entre les projections de l’échantillon sur le LV et la variable prédictive24. Cette approche nous permet de définir LV1 comme l’axe pour lequel la variance de la variable de réponse est la mieux expliquée. La VL2 maximise la copartisance entre la variable de réponse et les données résiduelles de la VL1, qui peuvent être associées à une variabilité biologique ou technique entre les échantillons. Enfin, nous effectuons une validation croisée LOOCV (Leave One Out Cross Validation) pour nous assurer que le modèle PLSR ne dépend pas fortement d’un échantillon23.
Dans ce protocole, nous détaillons les méthodes pour caractériser la réponse des tissus neuro-inflammatoires et hémodynamiques au TCC. Le flux de travail général est décrit à la figure 1. Dans ce protocole, les souris sont soumises à un ou plusieurs TLIS en utilisant un modèle de traumatisme crânien fermé en chute libre. Le débit sanguin cérébral est mesuré longitudinalement avant et à plusieurs moments après la blessure. Au moment de l’interrogation des changements neuro-inflammatoires, l’animal est euthanasié et le cerveau est extrait. Les régions cérébrales d’intérêt sont isolées par microdissection, puis lysées pour extraire des protéines. Les lysats sont ensuite utilisés à la fois pour les immunoessais multiplexés Luminex de l’expression des cytokines et des phospho-protéines ainsi que pour le Transfert Western. Enfin, cet ensemble de données holistique est intégré à l’aide d’une analyse de régression partielle des moindres carrés.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adjustable pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any adjustable pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89107-726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex cell lysis kit</td>
			<td>C Bio-Rad</td>
			<td>171304012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile</td>
			<td>BrandTech</td>
			<td>781602 96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini protease inhibitor tablet</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiH2O</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRL0200-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates</td>
			<td>Millipore Sigma Catalogue</td>
			<td>40-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware Autocorrelator Board</td>
			<td>www.correlator.com</td>
			<td>Flex05-8ch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 250 mL</td>
			<td>MED-VET INTERNATIONAL</td>
			<td>RXISO-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe (11.2 x 21.3 cm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21905-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabView</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>LabVIEW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software</td>
			<td>Luminex Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Drive Fluid</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>MPXDF-4PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex sheath fluid</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SHEATHFLUID</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Premixed 32 Plex - Immunology Multiplex Assay</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MCYTMAG-70K-PX32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>48-660MAG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini LabRoller rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Sealer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microfuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20901-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini LabRoller</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z674591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoirs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Programming Language</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio</td>
			<td>www.rstudio.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titer plate shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 m acrylic guide tube</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>49035K85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 photon counting avalanche photodiode</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>SPCM-AQ4C-IO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 um multimode source fiber</td>
			<td>Thorlabs Inc.</td>
			<td>FT-400-EMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>54 g bolt</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td></td>
			<td>0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>780 nm single mode detector fiber</td>
			<td>Thorlabs Inc.</td>
			<td>780HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>852 nm long-coherence length laser</td>
			<td>TOPTICA Photonics</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

systems analysis of the neuroinflammatory and hemodynamic response to traumatic brain injury

Les lésions cérébrales traumatiques légères (TBI) constituent un problème de santé publique important. Une exposition répétée au TCC peut entraîner des déficits fonctionnels cumulatifs et durables. De nombreuses études menées par notre groupe et d’autres ont montré que le TCC stimule l’expression des cytokines et active la microglie, diminue le flux sanguin cérébral et le métabolisme et altère la réactivité cérébrovasculaire. De plus, plusieurs travaux ont rapporté une association entre les dérangements dans ces marqueurs neuro-inflammatoires et hémodynamiques et les troubles cognitifs. Nous détaillons ici les méthodes permettant de caractériser la réponse des tissus neuro-inflammatoires et hémodynamiques au TCC chez la souris. Plus précisément, nous décrivons comment effectuer un modèle de perte de poids de l’ITCm, comment mesurer longitudinalement le flux sanguin cérébral à l’aide d’une technique optique non invasive appelée spectroscopie de corrélation diffuse, et comment effectuer un immunodosage multiplexé Luminex sur des échantillons de tissu cérébral pour quantifier les cytokines et les phospho-protéines immunomodulatrices (par exemple, dans les voies MAPK et NFκB) qui répondent et régulent l’activité de la microglie et d’autres cellules immunitaires neurales. Enfin, nous détaillons comment intégrer ces données à l’aide d’une approche d’analyse de systèmes multivariés pour comprendre les relations entre toutes ces variables. Comprendre les relations entre ces variables physiologiques et moléculaires nous permettra en fin de compte d’identifier les mécanismes responsables de l’ITM.

Les données précédemment recueillies ont été tirées de travaux antérieurs dans lesquels un groupe de huit souris C57BL/6 ont été soumises à trois blessures à la tête fermée (figure 2) espacées une fois par jour11. Dans ce travail, le flux sanguin cérébral a été mesuré par spectroscopie de corrélation diffuse 4 h après la dernière blessure (Figure 3, Figure 4). Après l’évaluation du C...

Watch this Scientific Journal Video about Systems Analysis of the Neuroinflammatory and Hemodynamic Response to Traumatic Brain Injury at JoVE.com

Systems Analysis of the Neuroinflammatory and Hemodynamic Response to Traumatic Brain Injury

Ce protocole présente des méthodes pour caractériser la réponse neuro-inflammatoire et hémodynamique à une lésion cérébrale traumatique légère et pour intégrer ces données dans le cadre d’une analyse des systèmes multivariés utilisant la régression partielle des moindres carrés.

Analyse systémique de la réponse neuroinflammatoire et hémodynamique aux lésions cérébrales traumatiques

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a significant public health problem. Repeated exposure to mTBI can lead to cumulative, long-lasting functional ...

Ces méthodes peuvent être utilisées pour caractériser les réponses neuro-inflammatoires et hémodynamiques aux lésions cérébrales dans le cadre d’une analyse multivariée du système utilisant la régression partielle des moindres carrés. Ces techniques sont utilisées pour donner une vision plus holistique de la réponse du cerveau aux blessures. Pour induire une blessure, confirmez un manque de réponse au pincement des orteils chez une souris anesthésiée et placez la souris en position couchée au centre d’une membrane mince.En utilisant les deux mains pour tenir le tissu enseigné, fixez la queue de la souris sous un pouce et positionnez-la sur la tête de la souris sous le tube guide. Lorsque la souris est en position, visant l’impact entre l’arrière des yeux et l’avant des oreilles, déposez le boulon du haut du tube guide sur l’aspect dorsal de la tête de la souris. Lors de l’impact, la souris percera le tissu, permettant une accélération rapide de la tête autour du cou.Après la blessure, laissez la souris récupérer en position couchée sur un coussin chauffant de 37 degrés Celsius. Après une période de stabilisation de deux minutes, placez doucement le capteur DCS sur l’hémisphère droit du crâne de la souris, de sorte que le bord supérieur du capteur optique s’aligne avec l’arrière de l’œil et le côté du capteur s’aligne le long de la ligne médiane. Passez une main sur le capteur pour le protéger de la lumière ambiante et acquérir cinq secondes de données.Ensuite, repositionnez le capteur sur l’hémisphère gauche et acquérez cinq secondes de données de l’hémisphère gauche. Pour évaluer la production multiplexée de cytokines et de phosphoprotéines, ajoutez 150 microlitres de tampon de lyse mixte pour environ trois milligrammes de tissu cérébral animal récolté. Et utilisez une pointe de pipette de 1 000 microlitres pour triturer mécaniquement le tissu 15 à 20 fois.Placer les échantillons homogénéisés sur un rotateur pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius avant de prélever les débris tissulaires par centrifugation. Transférer les surnageants dans de nouveaux tubes et centrifuger les échantillons pour éliminer tout précipité restant. Transférer les surnageants dans de nouveaux tubes et déterminer la concentration en protéines par dosage BCA selon des protocoles standard.Préparer 25 microlitres de chaque échantillon à la concentration optimale en protéines déterminée par l’analyse de la gamme linéaire dans de nouveaux tubes. Utilisation d’un tampon d’essai pour normaliser le volume total de chaque échantillon à 25 microlitres. Pour préparer une plaque d’essai, ajoutez 200 microlitres de tampon de lavage à chaque puits d’une plaque de 96 puits et secouez la plaque sur un agitateur pendant 10 minutes à 750 tours par minute.À la fin de l’incubation, décantez le tampon de lavage et tapotez la plaque sur une serviette en papier pour éliminer tout résidu. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de tampon d’essai à chaque puits, suivis de 25 microlitres supplémentaires de tampon aux puits de fond. Ajouter 25 microlitres d’échantillons dilués aux puits d’échantillonnage appropriés et faire passer par tourbillon de billes magnétiques multiplexées pendant une minute, avant d’ajouter 25 microlitres de perles soigneusement remises en suspension à chaque puits.Lorsque toutes les perles ont été ajoutées, scellez la plaque avec un scellant à plaques et recouvrez la plaque de papier d’aluminium pour une incubation nocturne avec agitation à deux à huit degrés Celsius. Le lendemain matin, placez la plaque sur un séparateur magnétique, en vous assurant que les puits sont alignés avec les aimants. Après deux minutes, décantez le contenu du puits avec la plaque encore attachée au séparateur magnétique et ajoutez 200 microlitres de tampon de lavage à chaque puits.Après l’avoir fait trembler pendant deux minutes, placez la plaque sur le séparateur magnétique pendant deux minutes. Ensuite, décantez le contenu du puits avec la plaque toujours attachée au séparateur magnétique et lavez la plaque avec un tampon de lavage frais de 200 microlitres par puits, comme cela vient d’être démontré. Après le deuxième lavage, ajoutez 25 microlitres d’anticorps de détection par puits et recouvrez à nouveau de papier d’aluminium pour une incubation d’une heure à 750 tours par minute à température ambiante.À la fin de l’incubation, ajouter 25 microlitres de streptavidine phycoérythrine à chaque puits et remettre la plaque dans le shaker pendant 30 minutes supplémentaires à température ambiante. À la fin de l’incubation, placez la plaque sur le séparateur magnétique pendant deux minutes avant de décanter le contenu du puits. Lavez la plaque deux fois avec 200 microlitres de tampon de lavage frais par lavage et ajoutez 75 microlitres du fluide d’entraînement approprié à chaque puits.Ensuite, remettez les billes sur le shaker à plaque pendant cinq minutes à température ambiante et lisez les plaques sur l’analyseur conformément aux instructions du fabricant. Dans cette analyse, le débit sanguin cérébral a été mesuré par spectroscopie de corrélation diffuse quatre heures après la dernière blessure. L’indice de flux sanguin cérébral et l’indice de flux cérébral moyen pour chaque hémisphère peuvent ensuite être déterminés.Une analyse linéaire de l’aire de répartition peut être effectuée pour déterminer une masse de charge protéique appropriée avant de recueillir des données à partir de tous les échantillons. Les données sur les cytokines peuvent être préparées en soustrayant les mesures de fond des données de l’échantillon, puis en calculant les données Z-score pour chaque anolyte. La régression partielle des moindres carrés peut être réalisée en utilisant un marqueur d’activation microgliale phagocytaire ou une autre variable d’intérêt comme variable de réponse, et les mesures de cytokines comme variables prédictives.La rotation Varimax peut être effectuée pour maximiser la covariance des données sur la variable latente un, avec les mesures du marqueur d’activation. Les poids de charge élevés dans la variable latente un correspondent aux expressions de cytokines les plus associées à une expression élevée du marqueur d’activation. Les régressions linéaires entre le marqueur d’activation et les cytokines montrent que les cytokines ayant les poids de charge les plus élevés dans la variable latente un étaient également statistiquement significatives pour cette analyse.Bien que nous ayons axé ce protocole sur les lésions cérébrales traumatiques, ces méthodes sont largement généralisables à l’étude d’une pléthore de conditions pathologiques qui affectent le cerveau. Nous utilisons ces techniques pour nous aider à identifier des cibles traitables à moduler dans de futures expériences afin d’établir des relations mécanistes causales et, en fin de compte, dans le but de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les lésions cérébrales traumatiques légères.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Percussion Fluide latéral: modèle de lésions cérébrales traumatiques chez la souris

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Recherche

Neurosciences

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Enquêtes sur les altérations de la fonction hippocampique Circuit suite de traumatisme craniocérébral léger

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Une méthode d&#39;infliger Fermé chef Traumatic Brain Injury dans<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Un modèle novateur In Vitro de Blast traumatisme crânien

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Effets de neurotraumatologie induite par le souffle sur les rongeurs sous pression du milieu des artères cérébrales

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Investigating Alterations in Caecum Microbiota After Traumatic Brain Injury in Mice

Enquêter sur les altérations dans le microbiote de Caecum après une lésion cérébrale traumatique chez les souris

Increasing evidence shows that the microbiota-gut-brain axis plays an important role in the pathogenesis of brain diseases. Several studies also ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Imagerie avancée de diffusion dans l'hippocampe des rats avec la blessure cérébrale traumatique douce

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous ...

Murine Model of Controlled Cortical Impact for the Induction of Traumatic Brain Injury

Modèle murine de l'impact cortical contrôlé pour l'induction des dommages traumatiques de cerveau

The Centers for Disease Control and Injury Prevention estimate that almost 2 million people sustain a traumatic brain injury (TBI) every year in the ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Livraison intra-artérielle de cellules souches neuronales au cerveau du rat et de la souris : application à l’ischémie cérébrale

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

A Metric Test for Assessing Spatial Working Memory in Adult Rats Following Traumatic Brain Injury

Un test métrique pour évaluer la mémoire de travail spatiale chez les rats adultes après une lésion cérébrale traumatique

Impairments to sensory, short-term, and long-term memory are common side effects after traumatic brain injury (TBI). Due to the ethical limitations of ...