Name: obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes
Uploaded: 2020-06-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes at JoVE.com

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منحة JSPS KAKENHI من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (رقم 19K10397 إلى H.K. ورقم 18K09862 إلى I.M.).

تم تنفيذ جميع إجراءات الحيوانات ورعاية الحيوان وفقا لقواعد ولوائح جامعة توهوكو.
1. تشريح حديثي الولادة dmp1-توباز الماوس كالفاريا
<ol><li>بالنسبة لهذا البروتوكول ، استخدم الجراء البالغة من العمر 6 إلى 20127 يوما من الفئران C57BL / 6-Tg (Dmp1-Topaz) 1Ikal / J. القتل الرحيم للفئران باستنشاق الأيزو?...

<ol>
	<li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+and+death+of+bone+cells:+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis.">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells.">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+Transduction+in+Osteocytes.">Mechanosensation and Transduction in Osteocytes.</a> BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).</li><li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism.">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li><li>Lane, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid-Treated+Mice+Have+Localized+Changes+in+Trabecular+Bone+Material+Properties+and+Osteocyte+Lacunar+Size+That+Are+Not+Observed+in+Placebo-Treated+or+Estrogen-Deficient+Mice.">Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).</li><li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Osteocyte:+An+Endocrine+Cell+...+and+More.">The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li><li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+osteocytes.">Isolation and purification of osteocytes.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).</li><li>Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte-specific+monoclonal+antibody+MAb+OB7.3+is+directed+against+Phex+protein.">Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).</li><li>Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikk&#246;, K., V&#228;&#228;n&#228;nen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro.">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).</li><li>Kramer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte+Wnt/&#946;-Catenin+Signaling+Is+Required+for+Normal+Bone+Homeostasis.">Osteocyte Wnt/&#946;-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis.</a> Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).</li><li>Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+Osteocyte-like+Cell+Line,+MLO-Y4.">Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).</li><li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+osteoid+preosteocyte-like+cell+MLO-A5+that+spontaneously+mineralizes+in+culture.">Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).</li><li>Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+Osteocytes+in+Their+3D+Native+Matrix+Versus+2D+In+Vitro+Models.">Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).</li><li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo.">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li><li>Spatz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+Inhibitor+Sclerostin+Is+Up-regulated+by+Mechanical+Unloading+in+Osteocytes+in+Vitro.">The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).</li><li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+relevance+of+cancer+cell+lines.">The clinical relevance of cancer cell lines.</a> Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).</li><li>Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+tumor+characteristic+gene+expression+in+cell+lines+using+a+tissue+similarity+index+(TSI).">Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).</li><li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dentin+matrix+protein+1+expression+during+osteoblastic+differentiation,+generation+of+an+osteocyte+GFP-transgene.">Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene.</a> Bone. 35 (1), 74-82 (2004).</li><li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes.">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> Bone. 45 (4), 682-692 (2009).</li><li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+osteocyte+regulation+of+bone+homeostasis+through+RANKL+expression.">Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).</li><li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte+biology.">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology.</a> Bone. 54 (2), 296-306 (2013).</li><li>Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes.">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li><li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bone Research Protocols. , 55-66 (2012).</li><li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone.">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li></ol>

كانت أول خلية عظمية معزولة من دجاج كالفاريا7 معزولة باستخدام (OB7.3) أو البديل الطيار من PHEX. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة محدودة بسبب توافر الأجسام المضادة القابلة للتطبيق ، حيث يجب تصنيع الأجسام المضادة الخاصة بالخلايا العظمية والتي هي أيضا خاصة بالنوع. استخدم الباحثون تعديلا مختل...

الخلايا العظمية هي خلايا متمايزة نهائيا عن الخلايا السلفية العظمية الأرومية التي أصبحت جزءا لا يتجزأ من المصفوفة المفرزة1. إنها الخلايا الأكثر وفرة والأطول عمرا بين مجموعات الخلايا العظمية. وهي موجودة داخل ثغرات ولها مورفولوجيا نجمية مميزة مع التشعبات التي تمتد عبر قنوات تسمى canaliculi لتشكيل شبكة واسعة من الاتصالات والتبادل الأيضي مع البيئة المحيطة بها وسطح العظام2. تصمم الخلايا العظمية كلا من أدوار بانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم في إعادة تشكيل العظام ، فهي الخلايا الحسية الميكانيكية الأولية التي تمنح التكيف مع التحميل الميكانيكي3 ، وتشارك في توازن الفوسفات4 وتمعدن مصفوفة العظام5 ، وجنبا إلى جنب مع الجهاز الجوفي ، فإنها تعمل كعضو الغدد الصماء الذي يشير إلى الأنسجة البعيدة6.
تقع الخلايا العظمية داخل مصفوفة معدنية ، مما يحد من إمكانية الوصول ويجعل عزلها صعبا ، وبالتالي يعيق التحقيق في المختبر. وصفت إحدى طرق العزل الأولى الخلايا العظمية المعزولة من كالفاريا الدجاج باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة خاص بالخلايا العظمية (OB7.3)7 والذي عرف لاحقا بأنه البديل الطائر من PHEX (الجين المنظم للفوسفات مع التماثل مع Endopeptidases على كروموسوم X)8. استخدم باحثون آخرون الهضم المتسلسل للفأر 9 أو عظام الفأرالطويلة 10 للحصول على الكسور الغنية بالخلايا العظمية التي تم الإبلاغ عن نقاء الخلايا العظمية فيها حوالي 70٪ 9. تشمل قيود هذا الإجراء النقاء دون المستوى الأمثل للمزارع الملوثة بأنواع الخلايا الأخرى إلى جانب الخلايا العظمية وأن الخلايا العظمية يمكن أن تتضخم بواسطة خلايا أخرى في الثقافة لأن الخلايا العظمية فقدت القدرة على الانقسام. هذه التحديات تحد من قابلية استخدام الثقافات طويلة الأجل.
للتغلب على هذه القيود ، تم تطوير خطوط خلايا الخلايا العظمية المختلفة. خط الخلية MLO-Y411 وخط الخلية MLO-A512 هي بشكل ملحوظ خطوط الخلايا الأكثر دراسة على نطاق واسع والتي هي مفيدة لدراسة الخلايا العظمية في المرحلة المبكرة. ومع ذلك ، فهي أقل فائدة لدراسة إشارات الخلايا العظمية الناضجة لأنها تعبر عن مستويات منخفضة من sclerostin و FGF2313 ، وكلاهما علامات الخلايا العظمية الناضجة. خطوط الخلايا الأخرى بما في ذلك IDG-SW3 14 و Ocy45415 ، تعبر عن مستويات عالية من sclerostin و FGF23 وهي مفيدة في دراسة مرحلة الخلايا العظمية المتأخرة. تثبت خطوط الخلايا أنها أدوات بحث مفيدة. ومع ذلك ، فهي لا تأتي بدون قيود لأنها لا تمثل بيولوجيا الخلية الأولية بشكل كامل. تمثل خطوط الخلايا المختلفة مراحل نمو مختلفة من طيف نضج الخلايا العظمية ، وتفشل خطوط الخلايا في تمثيل عدم تجانس الخلايا العظمية الأولية16,17.
للحصول على ثقافات نقية للخلايا العظمية الأولية ، استفاد الباحثون من نموذج الماوس cre الذي يستخدم فيه مروج dmp1 8 كيلو بايت لدفع تعبير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) في الخلايا العظمية18,19. تم استخدام الفئران المعدلة وراثيا المزدوجة (pOB-Col 2.3- GFP-cyan و DMP1-GFP-topaz) بواسطة Paic et al.19 والفئران المعدلة وراثيا dmp1-topaz بواسطة Nakashhima et al.20 للحصول على مجموعات الخلايا العظمية. حيث استخدموا الهضم المتسلسل و FACS للخلايا العظمية التي تعبر عن GFP للحصول على ثقافات الخلايا العظمية الأولية19,20. تبين أن اتجاه cre في الماوس المراسل dmp1 10-kb Ai9 ، الذي ينشط بروتين tdTomato ، موجود في الخلايا العظمية وبانيات العظم والعضلات والخلايا داخل نخاع العظام. كان لمروج dmp1 8 كيلو بايت نفس نمط التعبير ، ولكن نسبة فقط من بانيات العظم وخلايا نخاع العظم عبرت عن البروتين ، مما يشير إلى أن مروج dmp1 8 كيلو بايت أكثر تحديدا21. على الرغم من ذلك ، يجب تفسير النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام مروج dmp1 8 كيلو بايت بحذر ، ويجب إجراء ملفات تعريف التعبير الجيني بشكل روتيني باستخدام الخلايا العظمية مقابل العلامات الخاصة ببانيات العظم للتأكد من أن السكان الذين تم الحصول عليهم يتمتعون بدرجة نقاء عالية.
تم العثور على علامات ناقضة العظم OSCAR و Dcstamp في مجموعات الخلايا العظمية غير المستنفدة للدم مقابل الخلايا العظمية المستنفدة ، وقد قادت هذه النتيجة المؤلفين إلى استنتاج أن الهضم الذي تم الحصول عليه من تجزئة 8 كيلو بايت dmp1-topaz alnatal calvaria وفرز GFP ملوثة بخلايا المكونة للدم. كان من الممكن التخفيف من التلوث بالخلايا المكونة للدم عن طريق تشديد بوابة فرز GFP لأن الخلايا المكونة للدم الإيجابية ل GFP كانت لها كثافة GFP أقل بشكل معقول من خلايا اللحمة المتوسطة الإيجابية ل GFP (الخلايا العظمية)22.
ساهمت طرق دراسة الخلايا العظمية في المختبر في الثروة الحديثة من المعلومات حول بيولوجيا الخلايا العظمية. ومع ذلك ، يظل عزل الخلايا العظمية إجراء كثيف العمالة وطويل مع انخفاض إنتاجية الخلايا. الطريقة الموصوفة لهضم العظام باستخدام كولاجيناز و EDTA غالبا ما تصل إلى الكسر 823 ، تستغرق عدة ساعات يتم فيها فرض ضرائب على صلاحية الخلايا العظمية. أفاد الباحثون باستخدام الكسور (2-20125) لفرز الخلايا 20، وأظهروا أن التعبير عن الجينات المرتبطة بالخلايا العظمية مقابل تلك الخاصة ببانيات العظم يؤكد نجاح عزل مجموعات الخلايا العظمية النقية20. في هذه المقالة، نصف عملية الحصول على الكسور (2-5)، ونقارن مردود الخلايا العظمية من كل كسر بدءا من الكسر 1 إلى 8 لتحديد عودة الخلايا العظمية في كل كسر. كما وصفنا تشريح كالفاريا الفأر dmp1-topaz حديثي الولادة والهضم الكالفاري باستخدام كولاجيناز وحمض إيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) ، بالإضافة إلى تحضير الخلايا ل FACS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Data aquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235</td>
			<td>12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 &#956;m nylon mesh.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Wako, Osaka, Japan</td>
			<td>034-22363</td>
			<td>0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td>
			<td></td>
			<td>5mM EDTA prepared with 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAriaTM II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Filter Unit</td>
			<td>Merck Millipore, Ireland</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>0.22&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon cell strainer</td>
			<td>FALCON, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>40&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>0.5% x10. diluted to x1 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Wako, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 &#956;g/ml streptomycin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes

إن الخلايا العظمية ، التي كان يعتقد في السابق أنها مقيم سلبي في العظام نظرا لوظيفة وراء الكواليس المتمثلة في استشعار التحميل الميكانيكي ، يتم تسليط الضوء عليها الآن وقد ثبت أن لها وظائف رئيسية متعددة مثل التعديل النشط للمصفوفة خارج الخلية وتشكيل عضو الغدد الصماء مع نظام القناة الجوبية الذي يحيط به إرسال رسائل إلى مواقع بعيدة. نظرا للطرق التي جعلت من الممكن اختبار الخلايا العظمية في المختبر من عزل الخلايا العظمية الأولية إلى خطوط الخلايا الشبيهة بالخلايا العظمية ، تشهد الخلايا العظمية الآن اهتماما مدويا وزيادة في المعرفة حول الهيكل والوظيفة. العديد من جوانب بيولوجيا الخلايا العظمية والتفاعل مع المكونات الجزيئية الأخرى لم يتم اكتشافها بعد. في هذا البروتوكول ، نصف بالتفصيل العزل الفعال للخلايا العظمية الأولية من كالفاريا الفأر الوليدية dmp1-topaz ، والتي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر في الخلايا العظمية ، من خلال تجزئة الخلايا وبالتالي الحصول على ثقافات الخلايا العظمية الأولية بواسطة FACS.

الغرض من هذا البروتوكول هو إظهار عملية الحصول على مزارع الخلايا العظمية الأولية من كالفاريا الفأر الوليدي dmp1-topaz من خلال عملية تجزئة باستخدام كولاجيناز لتحلل مصفوفة الكولاجين و EDTA لاستخلاب الكالسيوم ، وبعد ذلك يتم تحضير الخلايا ل FACS لفصل الخلايا العظمية عن مجموعات الخلايا الأخرى.
<p class=...

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes at JoVE.com

Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

يصف هذا البروتوكول تشريح كالفاريا الفأر dmp1-topaz الوليدية وعزل الخلايا العظمية التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر من خلال هضم الخلايا وتجزئتها ، بالإضافة إلى تحضير الخلايا العظمية لفرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS).

الحصول على الخلايا العظمية الأولية من خلال تجزئة الفئران الكلالية للخلايا العظمية المعبرة عن GFP

The osteocyte, once thought to be a passive resident of the bone given the backstage function of sensing mechanical loading, is now brought to the ...

Primary osteocyte isolation is a lengthy procedure that often leaves out in low cell areas. This protocol provides efficient methods for isolating high numbers of primary GFP-expressing osteocytes. This protocol reduces the handling time and allows a higher number of osteocytes to be obtained in a single procedure with minimal contamination from hematopoietic or mesenchymal cells.For the isolation of GFP-expressing osteocytes, place euthanized, postnatal day six to seven, transgenic mouse pups into a non-treated culture dish, and use scissors and tweezers to grasp the skin at the base of one's skull. Use the scissors to make an initial incision in the lifted skin, followed by cuts along both sides of the skull in front of the ears. Remove the skin to expose the calvaria and holding the head from the nasal bridge, cut the calvaria along the lamboid suture and along the edges of the parietal bones to the frontal part of the tissue.Separate the calvaria from the underlying brain tissue and place the bones concave side up in PBS. To obtain fraction one, pool up to five calvaria per 50-milliliter tube in five milliliters of freshly prepared two-milligram per milliliter collagenase, and incubate the tissues at 37 degrees Celsius and 300 revolutions per minute for 20 minutes. At the end of the incubation, discard the digest from fraction one and wash the calvaria with five milliliters of PBS.Replace the wash with five milliliters of five-millimolar EDTA supplemented with one milligram per milliliter of bovine serum albumin in PBS for 15 minutes at 37 degrees Celsius with shaking. At the end of the incubation, transfer the digest to a 50-milliliter conical tube and wash the calveria with five milliliters of PBS. Then transfer the wash solution to the digest.To obtain fraction two, place the digest for centrifugation and discard the supernatant. Re-suspend the pellet in eight milliliters of alpha minimum essential medium containing 10%fetal bovine serum, or FBS, and antibiotics, and seed the cells onto a 10-centimeter culture dish. Then place the fraction two cells into the cell culture incubator.After collecting and culturing fractions three and four as just demonstrated. Incubate the calveria in five milliliters of five-millimolar EDTA supplemented with one milligram per milliliter of bovine serum albumin in PBS for 15 minutes at 37 degrees Celsius with shaking. At the end of the incubation, collect and culture fraction five as demonstrated for fractions two, three, and four.Immediately after fractionation, collect the cells for sorting. Alternatively, collect the cells after 24 hours of culture by aspirating the medium and gently wash the cells two times with 10 milliliters of PBS per dish per wash. After the second wash, treat the cells with five milliliters of 0.5%tripsin EDTA in PBS per plate.After five minutes at 37 degrees Celsius, add five milliliters of complete alpha minimum essential medium to each plate and gently detach the cells with pipetting. To combine the cells in each fraction, filter the cell suspensions through a 40-micron cell strainer into a single 50-milliliter conical centrifuge tube. After washing the cells with 10 milliliters of PBS, add them to the tube.Filter the cells through a strainer and collect the cells by centrifugation. Once the cells are pelleted down, re-suspend the pellet in complete minimal essential medium to a one times 10 to the seventh cells per milliliter of medium concentration and filter the cells through a 35-micron nylon mesh capped tube. To test the efficiency of this method, fractions were separately sorted and cultured for 24 hours to determine the percentage and yield of osteocytes from each fraction.The density of the osteocytes in fractions two to five were higher than that observed for fraction one and decreased remarkably in fractions six, seven, and eight. Although the percentage of osteocytes obtained between all of the fractions is not statistically significant, the density of the osteocytes differs dramatically between fractions. Here the gating strategy for isolating GFP-positive osteocytes from their GFP-negative counterparts by fluorescence-activated cell sorting is shown.After sorting, osteocytes can be analyzed for the expression of osteocyte markers of interest. In this analysis, the osteocyte marker genes were expressed at higher levels in the isolated GFP-positive osteocytes compared to presort fraction two, which is known as a high osteoblast fraction. Here the morphology of a GFP-positive osteocyte retaining a stellate shape with dendrites extending from the cell body after 24 hours of culture on a plastic culture dish, post sort, can be observed.Pay attention when aspirating the digests as the calveria will be reduced to minute pellets. Remember to use a small tip aspirator to avoid cell loss. Osteocytes have been enigmatic because they are entombed in bone.This technique has paved the way to studying osteocyte molecular interactions and their control over osteoclasts and osteoblasts.

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

الحصول على البيض من الإناث المورق القيطم

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

إعداد والتقطير من البيض مقتطفات القيطم المورق

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

الابتدائية الثقافة وElectroporation البلازميد الجهاز الفئران كورتي.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

زرع GFP - معربا عن Blastomeres للتصوير لايف التنمية الشبكية والدماغ في الجنين اسماك الزرد همي

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

تطبيق حمض الريتينويك الحصول الثقافات Osteocytes من الابتدائية ماوس خلايا الأوستيوبلاستس

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

الكهربية كل خلية من خلايا Enterochromaffin موريني مثقف الأولية

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

جيل من المورين الأولي القولون الظهارية Monolayers من سرداب الأمعاء

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

كشف النقاب عن التهاب المفاصل: استكشاف وظائف الخلايا الزليلية

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

تسليط الضوء على المؤلف: عزل وثقافة الضامة الزليلية الأولية والخلايا الليفية من أنسجة التهاب المفاصل الفئران  

عزل وثقافة البلاعم الزليلية الأولية والخلايا الليفية من أنسجة التهاب المفاصل الفئران

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...