Name: obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes
Uploaded: 2020-06-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een JSPS KAKENHI-beurs van de Japan Society for the Promotion of Science (nr. 19K10397 tot H.K. en nr. 18K09862 tot I.M.).

Alle dierprocedures en dierverzorging werden uitgevoerd in overeenstemming met de regels en voorschriften van de Tohoku University.
1. Dissectie van pasgeboren dmp1-topaas muis calvaria
<ol><li>Gebruik voor dit protocol 6\u20127 eendagsjongen van C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J muizen. Euthanaseer muizen met 5% isofluraaninhalatie en breng de pups vervolgens over in 70% ethanol.</li>
	<li>Breng de geëuthanaseerde pup over in een niet-behandelde kweekschaal.</li>
	<li>Gebruik een schaar en een...

<ol>
	<li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+and+death+of+bone+cells:+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis.">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells.">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+Transduction+in+Osteocytes.">Mechanosensation and Transduction in Osteocytes.</a> BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).</li><li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism.">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li><li>Lane, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid-Treated+Mice+Have+Localized+Changes+in+Trabecular+Bone+Material+Properties+and+Osteocyte+Lacunar+Size+That+Are+Not+Observed+in+Placebo-Treated+or+Estrogen-Deficient+Mice.">Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).</li><li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Osteocyte:+An+Endocrine+Cell+...+and+More.">The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li><li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+osteocytes.">Isolation and purification of osteocytes.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).</li><li>Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte-specific+monoclonal+antibody+MAb+OB7.3+is+directed+against+Phex+protein.">Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).</li><li>Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikk&#246;, K., V&#228;&#228;n&#228;nen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro.">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).</li><li>Kramer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte+Wnt/&#946;-Catenin+Signaling+Is+Required+for+Normal+Bone+Homeostasis.">Osteocyte Wnt/&#946;-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis.</a> Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).</li><li>Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+Osteocyte-like+Cell+Line,+MLO-Y4.">Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).</li><li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+osteoid+preosteocyte-like+cell+MLO-A5+that+spontaneously+mineralizes+in+culture.">Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).</li><li>Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+Osteocytes+in+Their+3D+Native+Matrix+Versus+2D+In+Vitro+Models.">Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).</li><li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo.">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li><li>Spatz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+Inhibitor+Sclerostin+Is+Up-regulated+by+Mechanical+Unloading+in+Osteocytes+in+Vitro.">The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).</li><li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+relevance+of+cancer+cell+lines.">The clinical relevance of cancer cell lines.</a> Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).</li><li>Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+tumor+characteristic+gene+expression+in+cell+lines+using+a+tissue+similarity+index+(TSI).">Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).</li><li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dentin+matrix+protein+1+expression+during+osteoblastic+differentiation,+generation+of+an+osteocyte+GFP-transgene.">Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene.</a> Bone. 35 (1), 74-82 (2004).</li><li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes.">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> Bone. 45 (4), 682-692 (2009).</li><li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+osteocyte+regulation+of+bone+homeostasis+through+RANKL+expression.">Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).</li><li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte+biology.">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology.</a> Bone. 54 (2), 296-306 (2013).</li><li>Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes.">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li><li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bone Research Protocols. , 55-66 (2012).</li><li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone.">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li></ol>

De eerste geïsoleerde osteocyt was van een kippencalvaria7 geïsoleerd met behulp van (OB7.3) of de aviantvariant van PHEX; Deze methode wordt echter beperkt door de beschikbaarheid van werkbare antilichamen, omdat osteocytspecifieke antilichamen die ook soortspecifiek zijn, moeten worden vervaardigd. Onderzoekers gebruikten een andere modificatie van het sequentiële enzymatische proces om osteocyten te verkrijgen uit lange botten van muizen en ratten; De gerapporteerde zuiverheid van deze cultu...

Osteocyten zijn terminaal gedifferentieerde cellen van osteoblastische voorlopers die ingebed raakten in hun uitgescheiden matrix1. Ze zijn de meest voorkomende en langstlevende cellen onder botcelpopulaties. Ze bevinden zich in lacunes en hebben een karakteristieke stellaatmorfologie met dendrieten die zich uitstrekken door kanalen die canaliculi worden genoemd en een uitgebreid netwerk van communicatie en metabole uitwisseling vormen met hun omgeving en het botoppervlak2. Osteocyten choreograferen zowel osteoblasten als osteoclasten rollen in botremodellering, ze zijn de primaire mechanosensorische cellen die aanpassing verlenen aan mechanische belasting3, zijn betrokken bij fosfaathomeostase4 en botmatrixmineralisatie5, en samen met het lacunocanaliculaire systeem fungeren ze als een endocriene orgaan dat verre weefselssignaleert 6.
Osteocyten bevinden zich in een gemineraliseerde matrix, wat de toegankelijkheid beperkt en hun isolatie uitdagend maakt, waardoor in vitro onderzoek wordt belemmerd. Een van de eerste isolatiemethoden beschreef geïsoleerde osteocyten uit kippen calvaria met behulp van een osteocytspecifiek monoklonaal antilichaam (OB7.3)7 waarvan later bekend werd dat het de aviaire variant van PHEX (PHosfaatregulerend gen met homologie aan Endopeptidases op het X-chromosoom)8 was. Andere onderzoekers gebruikten sequentiële vertering van rat 9 of muis 10 lange botten om osteocytrijke fracties te verkrijgen waarin de zuiverheid van osteocyten ongeveer70% 9 was. Beperkingen van deze procedure zijn onder meer de suboptimale zuiverheid van culturen die besmet zijn met andere celtypen dan osteocyten en dat osteocyten mogelijk kunnen worden overwoekerd door andere cellen in cultuur, omdat osteocyten het vermogen om te delen hebben verloren. Deze uitdagingen beperken de bruikbaarheid van langetermijnculturen.
Om deze beperkingen te overwinnen, werden verschillende osteocytencellijnen ontwikkeld. De MLO-Y4-cellijn11 en de MLO-A5-cellijn12 zijn met name de meest bestudeerde cellijnen die nuttig zijn voor de studie van de osteocyten in een vroeg stadium; ze zijn echter minder nuttig voor het bestuderen van volwassen osteocytensignalering omdat ze lage niveaus van sclerostine en FGF2313 uitdrukken, die beide volwassen osteocytenmarkers zijn. Andere cellijnen, waaronder IDG-SW3 14 en Ocy45415, drukken hoge niveaus van sclerostine en FGF23 uit en zijn nuttig bij het bestuderen van het late osteocytenstadium. Cellijnen blijken nuttige onderzoeksinstrumenten te zijn; Niettemin komen ze niet zonder beperkingen omdat ze de biologie van de primaire cel niet volledig vertegenwoordigen. Verschillende cellijnen vertegenwoordigen verschillende ontwikkelingsstadia van het rijpheidsspectrum van osteocyten en cellijnen vertegenwoordigen niet de heterogeniteit van primaire osteocyten16,17.
Om zuivere culturen van primaire osteocyten te verkrijgen, maakten onderzoekers gebruik van het cre-muismodel waarin de 8-kb dmp1-promotor wordt gebruikt om groene fluorescerende eiwit (GFP) expressie in osteocyten18,19 aan te sturen. Dubbele transgene muizen (pOB-Col 2.3- GFP-cyaan en DMP1-GFP-topaas) van Paic et al.19 en dmp1-topaas transgene muizen van Nakashima et al.20 zijn gebruikt om osteocytenpopulaties te verkrijgen. Waarin ze sequentiële vertering en FACS van osteocyten gebruikten die GFP tot expressie brachten om culturen van primaire osteocyten te verkrijgen19,20. De richting van cre in de 10-kb dmp1 reportermuis Ai9, die het tdTomato-eiwit activeert, bleek aanwezig te zijn in osteocyten, osteoblasten, spieren en cellen in het beenmerg. De 8-kb dmp1-promotor had hetzelfde expressiepatroon, maar slechts een deel van de osteoblasten en beenmergcellen drukte het eiwit uit, wat aangeeft dat de 8-kb dmp1-promotor specifieker is21. Desondanks moeten resultaten verkregen met behulp van de 8-kb dmp1-promotor met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd en moeten genexpressieprofielen routinematig worden uitgevoerd met behulp van osteocyten versus osteoblastspecifieke markers om ervoor te zorgen dat de verkregen populatie van voldoende zuiverheid is.
Osteoclastmarkers OSCAR en Dcstamp werden gevonden in hematopoëtische niet-uitgeputte versus uitgeputte osteocytenpopulaties, deze bevinding leidde de auteurs tot de conclusie dat digesten verkregen uit fractionering van 8-kb dmp1-topaas neonatale calvaria en GFP-sortering besmet zijn met hematopoëtische cellen. Besmetting met hematopoëtische cellen had kunnen worden verzacht door de GFP-sorteerpoort aan te scherpen, aangezien GFP-positieve hematopoëtische cellen een redelijk lagere GFP-intensiteit hadden dan GFP-positieve mesenchymale cellen (osteocyten)22.
De methoden voor het bestuderen van osteocyten in vitro hebben bijgedragen aan de recente schat aan informatie over osteocytenbiologie. Osteocytenisolatie blijft echter een arbeidsintensieve en langdurige procedure met lage celopbrengsten. De beschreven methode van botvertering met behulp van collagenase en EDTA, vaak tot fractie 823, duurt enkele uren waarin de levensvatbaarheid van osteocyten wordt belast. Onderzoekers hebben gerapporteerd dat ze fracties (2-0125) hebben gebruikt voor celsortering 20, en hebben aangetoond dat het expressieprofiel van genen geassocieerd met osteocyten versus die van osteoblasten het succes van het isoleren van pure osteocytenpopulatiesbevestigt 20. In dit artikel beschrijven we het proces van het verkrijgen van breuken (2-0125) en vergelijken we de opbrengst van osteocyten van elke fractie beginnend met fractie 1 tot en met 8 om de terugkeer van osteocyten in elke fractie te bepalen. We beschrijven ook de dissectie van pasgeboren dmp1-topaas muis calvaria en calvariale spijsvertering met behulp van collagenase en ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), evenals de bereiding van cellen voor FACS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Data aquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235</td>
			<td>12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 &#956;m nylon mesh.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Wako, Osaka, Japan</td>
			<td>034-22363</td>
			<td>0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td>
			<td></td>
			<td>5mM EDTA prepared with 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAriaTM II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Filter Unit</td>
			<td>Merck Millipore, Ireland</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>0.22&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon cell strainer</td>
			<td>FALCON, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>40&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>0.5% x10. diluted to x1 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Wako, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 &#956;g/ml streptomycin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes

De osteocyt, waarvan ooit werd gedacht dat hij een passieve bewoner van het bot was gezien de backstage-functie van het detecteren van mechanische belasting, wordt nu onder de aandacht gebracht en er is aangetoond dat hij meerdere belangrijke functies heeft, zoals het actief wijzigen van de extracellulaire matrix en het vormen van een endocriene orgaan met het lacunocanaliculaire systeem dat het omsluit en berichten naar verre locaties verzendt. Dankzij de methoden die het mogelijk maakten om de osteocyt in vitro te testen van het isoleren van primaire osteocyten tot osteocytachtige cellijnen, ervaren osteocyten nu een klinkende interesse en een golf van kennis over structuur en functie. Veel aspecten van de osteocytenbiologie en de interactie met andere moleculaire componenten moeten nog worden ontdekt. In dit protocol beschrijven we in detail de efficiënte isolatie van primaire osteocyten uit dmp1-topaas neonatale muis calvaria, die het groene fluorescerende eiwit in osteocyten tot expressie brengen, door celfractionering en vervolgens het verwerven van culturen van primaire osteocyten door FACS.

Het doel van dit protocol is om het proces aan te tonen van het verkrijgen van culturen van primaire osteocyten uit dmp1-topaas neonatale muis calvaria door middel van een fractioneringsproces met behulp van collagenase om de collageenmatrix en EDTA voor calciumchelatie af te breken, waarna cellen worden voorbereid op FACS om osteocyten van andere celpopulaties te scheiden.
Methoden voor het verkrijgen van primaire osteocyten uit neonatale muis calvaria beschrijven vaak het gebruik van fractie...

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes at JoVE.com

Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

Dit protocol beschrijft de dissectie van neonatale dmp1-topaas muizen calvaria en isolatie van osteocyten die het groene fluorescerende eiwit tot expressie brengen door celvertering en fractionering, naast osteocytenpreparaat voor fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS).

Het verkrijgen van primaire osteocyten door murine calvariale fractionering van GFP-tot expressie brengende osteocyten

The osteocyte, once thought to be a passive resident of the bone given the backstage function of sensing mechanical loading, is now brought to the ...

Primary osteocyte isolation is a lengthy procedure that often leaves out in low cell areas. This protocol provides efficient methods for isolating high numbers of primary GFP-expressing osteocytes. This protocol reduces the handling time and allows a higher number of osteocytes to be obtained in a single procedure with minimal contamination from hematopoietic or mesenchymal cells.For the isolation of GFP-expressing osteocytes, place euthanized, postnatal day six to seven, transgenic mouse pups into a non-treated culture dish, and use scissors and tweezers to grasp the skin at the base of one's skull. Use the scissors to make an initial incision in the lifted skin, followed by cuts along both sides of the skull in front of the ears. Remove the skin to expose the calvaria and holding the head from the nasal bridge, cut the calvaria along the lamboid suture and along the edges of the parietal bones to the frontal part of the tissue.Separate the calvaria from the underlying brain tissue and place the bones concave side up in PBS. To obtain fraction one, pool up to five calvaria per 50-milliliter tube in five milliliters of freshly prepared two-milligram per milliliter collagenase, and incubate the tissues at 37 degrees Celsius and 300 revolutions per minute for 20 minutes. At the end of the incubation, discard the digest from fraction one and wash the calvaria with five milliliters of PBS.Replace the wash with five milliliters of five-millimolar EDTA supplemented with one milligram per milliliter of bovine serum albumin in PBS for 15 minutes at 37 degrees Celsius with shaking. At the end of the incubation, transfer the digest to a 50-milliliter conical tube and wash the calveria with five milliliters of PBS. Then transfer the wash solution to the digest.To obtain fraction two, place the digest for centrifugation and discard the supernatant. Re-suspend the pellet in eight milliliters of alpha minimum essential medium containing 10%fetal bovine serum, or FBS, and antibiotics, and seed the cells onto a 10-centimeter culture dish. Then place the fraction two cells into the cell culture incubator.After collecting and culturing fractions three and four as just demonstrated. Incubate the calveria in five milliliters of five-millimolar EDTA supplemented with one milligram per milliliter of bovine serum albumin in PBS for 15 minutes at 37 degrees Celsius with shaking. At the end of the incubation, collect and culture fraction five as demonstrated for fractions two, three, and four.Immediately after fractionation, collect the cells for sorting. Alternatively, collect the cells after 24 hours of culture by aspirating the medium and gently wash the cells two times with 10 milliliters of PBS per dish per wash. After the second wash, treat the cells with five milliliters of 0.5%tripsin EDTA in PBS per plate.After five minutes at 37 degrees Celsius, add five milliliters of complete alpha minimum essential medium to each plate and gently detach the cells with pipetting. To combine the cells in each fraction, filter the cell suspensions through a 40-micron cell strainer into a single 50-milliliter conical centrifuge tube. After washing the cells with 10 milliliters of PBS, add them to the tube.Filter the cells through a strainer and collect the cells by centrifugation. Once the cells are pelleted down, re-suspend the pellet in complete minimal essential medium to a one times 10 to the seventh cells per milliliter of medium concentration and filter the cells through a 35-micron nylon mesh capped tube. To test the efficiency of this method, fractions were separately sorted and cultured for 24 hours to determine the percentage and yield of osteocytes from each fraction.The density of the osteocytes in fractions two to five were higher than that observed for fraction one and decreased remarkably in fractions six, seven, and eight. Although the percentage of osteocytes obtained between all of the fractions is not statistically significant, the density of the osteocytes differs dramatically between fractions. Here the gating strategy for isolating GFP-positive osteocytes from their GFP-negative counterparts by fluorescence-activated cell sorting is shown.After sorting, osteocytes can be analyzed for the expression of osteocyte markers of interest. In this analysis, the osteocyte marker genes were expressed at higher levels in the isolated GFP-positive osteocytes compared to presort fraction two, which is known as a high osteoblast fraction. Here the morphology of a GFP-positive osteocyte retaining a stellate shape with dendrites extending from the cell body after 24 hours of culture on a plastic culture dish, post sort, can be observed.Pay attention when aspirating the digests as the calveria will be reduced to minute pellets. Remember to use a small tip aspirator to avoid cell loss. Osteocytes have been enigmatic because they are entombed in bone.This technique has paved the way to studying osteocyte molecular interactions and their control over osteoclasts and osteoblasts.

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Het verkrijgen van Eieren van Xenopus laevis Teven

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Voorbereiding en Fractionering van Xenopus laevis Egg Extracten

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Primaire Cultuur en Plasmide Elektroporatie van de muizen orgaan van Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Met behulp van de GELFREE 8100 Fractionering System for Molecular Weight-Based Fractionering met Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Transplantatie van GFP-expressie blastomeren voor Live Beeldvorming van het netvlies en de ontwikkeling van de hersenen in chimère zebravis embryo&#39;s

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

Toepassing van retinoinezuur aan Osteocyten Culturen van primaire muizen osteoblasten verkrijgen

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Hele cel electrofysiologie van primaire gekweekte lymfkliertest Enterochromaffin cellen

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

Generatie van Murine Primaire Colon Epitheliale Monolayers uit Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Onthulling van inflammatoire artritis: onderzoek naar functies van synoviale cellen

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Auteur in de schijnwerpers: isolatie en cultuur van primaire synoviale macrofagen en fibroblasten uit muizenartritisweefsel  

Isolatie en kweek van primaire synoviale macrofagen en fibroblasten uit muizenartritisweefsel

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...