Name: obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes
Uploaded: 2020-06-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes at JoVE.com

Ce travail a été soutenu en partie par une subvention JSPS KAKENHI de la Société japonaise pour la promotion de la science (n ° 19K10397 à H.K. et n ° 18K09862 à I.M.).

Toutes les procédures et tous les soins aux animaux ont été effectués conformément aux règles et règlements de l’Université de Tohoku.
1. Dissection du calvaire de souris dmp1-topaze nouveau-né
<ol><li>Pour ce protocole, utilisez des petits de 6 à jours de souris C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J. Euthanasier les souris avec une inhalation d’isoflurane à 5%, puis transférer les petits dans de l’éthanol à 70%.</li>
	<li>Transférer le chiot euthanasié dans un plat de culture ...

<ol>
	<li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+and+death+of+bone+cells:+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis.">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells.">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+Transduction+in+Osteocytes.">Mechanosensation and Transduction in Osteocytes.</a> BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).</li><li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism.">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li><li>Lane, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid-Treated+Mice+Have+Localized+Changes+in+Trabecular+Bone+Material+Properties+and+Osteocyte+Lacunar+Size+That+Are+Not+Observed+in+Placebo-Treated+or+Estrogen-Deficient+Mice.">Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).</li><li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Osteocyte:+An+Endocrine+Cell+...+and+More.">The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li><li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+osteocytes.">Isolation and purification of osteocytes.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).</li><li>Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte-specific+monoclonal+antibody+MAb+OB7.3+is+directed+against+Phex+protein.">Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).</li><li>Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikk&#246;, K., V&#228;&#228;n&#228;nen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro.">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).</li><li>Kramer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte+Wnt/&#946;-Catenin+Signaling+Is+Required+for+Normal+Bone+Homeostasis.">Osteocyte Wnt/&#946;-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis.</a> Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).</li><li>Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. 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D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+Osteocytes+in+Their+3D+Native+Matrix+Versus+2D+In+Vitro+Models.">Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).</li><li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo.">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li><li>Spatz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+Inhibitor+Sclerostin+Is+Up-regulated+by+Mechanical+Unloading+in+Osteocytes+in+Vitro.">The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).</li><li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+relevance+of+cancer+cell+lines.">The clinical relevance of cancer cell lines.</a> Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).</li><li>Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+tumor+characteristic+gene+expression+in+cell+lines+using+a+tissue+similarity+index+(TSI).">Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).</li><li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dentin+matrix+protein+1+expression+during+osteoblastic+differentiation,+generation+of+an+osteocyte+GFP-transgene.">Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene.</a> Bone. 35 (1), 74-82 (2004).</li><li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes.">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> Bone. 45 (4), 682-692 (2009).</li><li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+osteocyte+regulation+of+bone+homeostasis+through+RANKL+expression.">Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).</li><li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte+biology.">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology.</a> Bone. 54 (2), 296-306 (2013).</li><li>Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes.">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li><li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bone Research Protocols. , 55-66 (2012).</li><li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone.">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li></ol>

Le premier ostéocyte isolé provenait d’un poulet calvaria7 isolé à l’aide de (OB7.3) ou de la variante aviaire de PHEX; Cependant, cette méthode est limitée par la disponibilité d’anticorps exploitables, car des anticorps spécifiques aux ostéocytes qui sont également spécifiques à l’espèce doivent être fabriqués. Les chercheurs ont utilisé une modification différente du processus enzymatique séquentiel pour obtenir des ostéocytes à partir d’os longs de souris et de ra...

Les ostéocytes sont des cellules terminales différenciées des progéniteurs ostéoblastiques qui se sont intégrés dans leur matrice sécrétée1. Ce sont les cellules les plus abondantes et les plus anciennes parmi les populations de cellules osseuses. Ils résident dans des lacunes et ont une morphologie stellaire caractéristique avec des dendrites qui s’étendent à travers des canaux appelés canalicules formant un vaste réseau de communication et d’échange métabolique avec leur environnement et la surface osseuse2. Les ostéocytes chorégraphient à la fois les rôles des ostéoblastes et des ostéoclastes dans le remodelage osseux, ils sont les cellules mécanosensorielles primaires conférant une adaptation à la charge mécanique3, sont impliqués dans l’homéostasie phosphate4 et la minéralisation de la matrice osseuse5, et avec le système lacunocanaliculaire, ils agissent comme un organe endocrinien signalant des tissus distants6.
Les ostéocytes sont situés dans une matrice minéralisée, ce qui limite l’accessibilité et rend leur isolement difficile, entravant ainsi l’investigation in vitro. L’une des premières méthodes d’isolement a décrit des ostéocytes isolés du calvaire de poulet à l’aide d’un anticorps monoclonal spécifique aux ostéocytes (OB7.3)7 qui a été connu plus tard pour être la variante aviaire de PHEX (gène régulateur de PHosphate avec homologie aux endopeptidases sur le chromosome X)8. D’autres chercheurs ont utilisé la digestion séquentielle d’os longs de rat 9 ou de souris 10 pour obtenir des fractions riches en ostéocytes dans lesquelles la pureté des ostéocytes était d’environ70%9. Les limites de cette procédure comprennent la pureté sous-optimale des cultures contaminées par d’autres types de cellules que les ostéocytes et le fait que les ostéocytes pourraient être potentiellement envahis par d’autres cellules en culture puisque les ostéocytes ont perdu la capacité de se diviser. Ces défis limitent la facilité d’utilisation des cultures à long terme.
Pour surmonter ces limitations, différentes lignées cellulaires ostéopacytaires ont été développées. La lignée cellulaire MLO-Y411 et la lignée cellulaire MLO-A512 sont notamment les lignées cellulaires les plus étudiées qui sont utiles pour l’étude des ostéocytes à un stade précoce; cependant, ils sont moins utiles pour étudier la signalisation des ostéocytes matures car ils expriment de faibles niveaux de sclérostine et de FGF2313, qui sont tous deux des marqueurs ostéocytes matures. D’autres lignées cellulaires, y compris IDG-SW3 14 et Ocy45415, expriment des niveaux élevés de sclérostine et de FGF23 et sont utiles pour étudier le stade ostéocytaire tardif. Les lignées cellulaires s’avèrent être des outils de recherche utiles; Néanmoins, ils ne viennent pas sans limites car ils ne représentent pas pleinement la biologie de la cellule primaire. Différentes lignées cellulaires représentent différents stades de développement du spectre de maturité des ostéocytes, et les lignées cellulaires ne parviennent pas à représenter l’hétérogénéité des ostéocytes primaires16,17.
Pour obtenir des cultures pures d’ostéocytes primaires, les chercheurs ont tiré parti du modèle murin cre dans lequel le promoteur dmp1 de 8 kb est utilisé pour stimuler l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) dans les ostéocytes18,19. Des souris transgéniques doubles (pOB-Col 2.3- GFP-cyan et DMP1-GFP-topaz) de Paic et al.19 et des souris transgéniques dmp1-topaze de Nakashima et al.20 ont été utilisées pour obtenir des populations d’ostéocytes. Dans lequel ils ont utilisé la digestion séquentielle et le FACS des ostéocytes exprimant la GFP pour acquérir des cultures d’ostéocytes primaires19,20. La direction de cre chez la souris rapporteure dmp1 de 10 kb Ai9, qui active la protéine tdTomato, s’est avérée présente dans les ostéocytes, les ostéoblastes, les muscles et les cellules de la moelle osseuse. Le promoteur dmp1 de 8 kb avait le même schéma d’expression, mais seule une proportion d’ostéoblastes et de cellules de moelle osseuse exprimait la protéine, ce qui indique que le promoteur dmp1 de 8 kb est plus spécifique21. Malgré cela, les résultats obtenus à l’aide du promoteur dmp1 de 8 kb doivent être interprétés avec prudence, et les profils d’expression génique doivent être systématiquement réalisés à l’aide de marqueurs spécifiques aux ostéocytes par rapport aux ostéoblastes pour s’assurer que la population obtenue est d’une pureté suffisamment élevée.
Les marqueurs ostéoclastes OSCAR et Dcstamp ont été trouvés dans des populations d’ostéocytes hématopoïétiques non appauvris vs appauvris, cette découverte a conduit les auteurs à conclure que les digestions obtenues par fractionnement de calvaire néonatal dmp1-topaze de 8 kb et le tri GFP sont contaminés par des cellules hématopoïétiques. La contamination par les cellules hématopoïétiques aurait pu être atténuée en resserrant la porte de tri de la GFP puisque les cellules hématopoïétiques GFP positives avaient une intensité de GFP raisonnablement inférieure à celle des cellules mésenchymateuses (ostéocytes) GFP-positives22.
Les méthodes d’étude des ostéocytes in vitro ont contribué à la richesse récente des informations sur la biologie des ostéocytes. Cependant, l’isolement des ostéocytes reste une procédure longue et laborieuse avec de faibles rendements cellulaires. La méthode décrite de digestion osseuse utilisant la collagénase et l’EDTA souvent jusqu’à la fraction 823, prend plusieurs heures au cours desquelles la viabilité des ostéocytes est taxée. Des chercheurs ont rapporté utiliser des fractions (2\u20125) pour le tri cellulaire 20, et ont montré que le profil d’expression des gènes associés aux ostéocytes par rapport à ceux des ostéoblastes confirme le succès de l’isolement des populations d’ostéocytes purs20. Dans cet article, nous décrivons le processus d’obtention des fractions (2\u20125), et nous comparons le rendement des ostéocytes de chaque fraction en commençant par la fraction 1 à 8 pour déterminer le retour des ostéocytes dans chaque fraction. Nous décrivons également la dissection du calvaria de souris dmp1-topaze nouveau-née et la digestion calvariaire à l’aide de collagénase et d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), ainsi que la préparation de cellules pour FACS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Data aquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235</td>
			<td>12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 &#956;m nylon mesh.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Wako, Osaka, Japan</td>
			<td>034-22363</td>
			<td>0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td>
			<td></td>
			<td>5mM EDTA prepared with 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAriaTM II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Filter Unit</td>
			<td>Merck Millipore, Ireland</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>0.22&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon cell strainer</td>
			<td>FALCON, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>40&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>0.5% x10. diluted to x1 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Wako, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 &#956;g/ml streptomycin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes

L’ostéocytes, autrefois considéré comme un résident passif de l’os étant donné la fonction de détection de la charge mécanique en coulisses, est maintenant mis en lumière et a été montré pour avoir de multiples fonctions majeures comme la modification active de la matrice extracellulaire et la formation d’un organe endocrinien avec le système lacunocanaliculaire qui l’entoure envoyant des messages à des sites distants. Grâce aux méthodes qui ont permis de tester l’ostéocyte in vitro à partir d’ostéocytes primaires isolés en lignées cellulaires de type ostéocytes, les ostéocytes connaissent aujourd’hui un intérêt retentissant et une vague de connaissances sur la structure et la fonction. De nombreux aspects de la biologie des ostéocytes et de l’interaction avec d’autres composants moléculaires restent à découvrir. Dans ce protocole, nous décrivons en détail l’isolement efficace des ostéocytes primaires à partir du calvaire néonatal de souris dmp1-topaze, qui expriment la protéine fluorescente verte dans les ostéocytes, par fractionnement cellulaire et acquisition ultérieure de cultures d’ostéocytes primaires par FACS.

Le but de ce protocole est de démontrer le processus d’obtention de cultures d’ostéocytes primaires à partir de calvaire de souris néonatale dmp1-topaze par un processus de fractionnement utilisant la collagénase pour dégrader la matrice de collagène et l’EDTA pour la chélation du calcium, après quoi les cellules sont préparées pour FACS afin de séparer les ostéocytes des autres populations cellulaires.
Les méthodes d’obtention des ostéocytes primaires du calvaire de sou...

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Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

Ce protocole décrit la dissection du calvaire néonatal de souris dmp1-topaze et l’isolement des ostéocytes exprimant la protéine fluorescente verte par digestion et fractionnement cellulaire, en plus de la préparation des ostéocytes pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).

Obtention d’ostéocytes primaires par fractionnement calvariaire murin d’ostéocytes exprimant la GFP

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