Name: obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes
Uploaded: 2020-06-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes at JoVE.com

Diese Arbeit wurde zum Teil durch ein JSPS KAKENHI-Stipendium der Japan Society for the Promotion of Science (Nr. 19K10397 an H.K. und Nr. 18K09862 an I.M.) unterstützt.

Alle Tierbehandlungen und die Tierpflege wurden in Übereinstimmung mit den Regeln und Vorschriften der Tohoku-Universität durchgeführt.
1. Sektion der neugeborenen dmp1-Topas-Maus Calvaria
<ol><li>Verwenden Sie für dieses Protokoll 6 bis 7 Tage alte Welpen von C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J-Mäusen. Euthanasieren Sie Mäuse mit 5% Isofluran-Inhalation und setzen Sie die Welpen dann in 70% Ethanol um.</li>
	<li>Übertragen Sie den eingeschläferten Welpen in eine unbehandelte Kulturschale....

<ol>
	<li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+and+death+of+bone+cells:+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis.">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells.">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li><li>Bonewald, L. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+osteocytes.">Isolation and purification of osteocytes.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).</li><li>Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte-specific+monoclonal+antibody+MAb+OB7.3+is+directed+against+Phex+protein.">Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).</li><li>Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikk&#246;, K., V&#228;&#228;n&#228;nen, H. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo.">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li><li>Spatz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+Inhibitor+Sclerostin+Is+Up-regulated+by+Mechanical+Unloading+in+Osteocytes+in+Vitro.">The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).</li><li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. 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Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes.">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li><li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bone Research Protocols. , 55-66 (2012).</li><li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone.">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li></ol>

Der erste isolierte Osteozyten stammte aus einer Huhn-Calvaria7 , die mit Hilfe von (OB7.3) oder der avianten Variante von PHEX isoliert wurde. Diese Methode ist jedoch durch die Verfügbarkeit von praktikablen Antikörpern begrenzt, da Osteozyten-spezifische Antikörper hergestellt werden müssen, die auch speziesspezifisch sind. Die Forscher verwendeten eine andere Modifikation des sequenziellen enzymatischen Prozesses, um Osteozyten aus langen Knochen von Mäusen und Ratten zu gewinnen. Die ber...

Osteozyten sind terminale differenzierte Zellen aus osteoblastischen Vorläuferzellen, die in ihre sezernierte Matrix eingebettet wurden1. Sie sind die am häufigsten vorkommenden und langlebigsten Zellen unter den Knochenzellpopulationen. Sie befinden sich in Lakunen und haben eine charakteristische Sternmorphologie mit Dendriten, die sich durch Kanäle erstrecken, die als Canaliculi bezeichnet werden und ein ausgedehntes Netzwerk der Kommunikation und des Stoffwechselaustauschs mit ihrer Umgebung und der Knochenoberfläche bilden2. Osteozyten choreografieren sowohl die Rolle von Osteoblasten als auch von Osteoklasten beim Knochenumbau, sie sind die primären mechanosensorischen Zellen, die die Anpassung an mechanische Belastungen gewährleisten3, sind an der Phosphathomöostase4 und der Knochenmatrixmineralisierung5 beteiligt und fungieren zusammen mit dem lakunokanalikulären System als endokrines Organ, das entfernte Gewebe signalisiert6.
Osteozyten befinden sich in einer mineralisierten Matrix, was die Zugänglichkeit einschränkt und ihre Isolierung erschwert, was die In-vitro-Untersuchung erschwert. Eine der ersten Isolierungsmethoden beschrieb isolierte Osteozyten aus Hühnerschädeln unter Verwendung eines osteozytenspezifischen monoklonalen Antikörpers (OB7.3)7 , von dem später bekannt wurde, dass es sich um die aviäre Variante von PHEX (PHosphate-regulierendes Gen mit Homologie zu Endopeptidasen auf dem X-Chromosom) handelte8. Andere Forscher verwendeten die sequentielle Verdauung von langen Knochen von Ratte9 oder Maus 10, um osteozytenreiche Fraktionen zu erhalten, bei denen die Reinheit der Osteozyten bei etwa70 % lag9. Zu den Einschränkungen dieses Verfahrens gehört die suboptimale Reinheit von Kulturen, die neben Osteozyten auch mit anderen Zelltypen kontaminiert sind, und dass Osteozyten möglicherweise von anderen Zellen in Kultur überwachsen werden könnten, da Osteozyten die Fähigkeit zur Teilung verloren haben. Diese Herausforderungen schränken die Nutzbarkeit langfristiger Kulturen ein.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden verschiedene Osteozytenzelllinien entwickelt. Die MLO-Y4-Zelllinie11 und die MLO-A5-Zelllinie12 sind insbesondere die am weitesten untersuchten Zelllinien, die für die Untersuchung der Osteozyten im Frühstadium nützlich sind. Sie sind jedoch weniger nützlich für die Untersuchung der Signalübertragung reifer Osteozyten, da sie geringe Mengen an Sclerostin und FGF2313 exprimieren, die beide reife Osteozytenmarker sind. Andere Zelllinien, darunter IDG-SW3 14 und Ocy45415, exprimieren hohe Konzentrationen von Sclerostin und FGF23 und sind nützlich für die Untersuchung des späten Osteozytenstadiums. Zelllinien erweisen sich als nützliche Forschungswerkzeuge; Dennoch sind sie nicht ohne Einschränkungen, da sie die Biologie der Primärzelle nicht vollständig repräsentieren. Unterschiedliche Zelllinien repräsentieren unterschiedliche Entwicklungsstadien des Osteozytenreifespektrums, und Zelllinien repräsentieren nicht die Heterogenität der primären Osteozyten16,17.
Um Reinkulturen von primären Osteozyten zu erhalten, nutzten die Forscher das cre-Mausmodell, in dem der 8-kb-dmp1-Promotor verwendet wird, um die Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) in Osteozyten zu steuern18,19. Zwei transgene Mäuse (pOB-Col 2.3-GFP-cyan und DMP1-GFP-topaz) von Paic et al.19 und dmp1-topaz-transgene Mäuse von Nakashima et al.20 wurden verwendet, um Osteozytenpopulationen zu erhalten. Dabei nutzten sie die sequentielle Verdauung und das FACS von Osteozyten, die GFP exprimieren, um Kulturen von primären Osteozyten zu erwerben19,20. Es konnte gezeigt werden, dass die Richtung von cre in der 10-kb dmp1-Reportermaus Ai9, die das tdTomato-Protein aktiviert, in Osteozyten, Osteoblasten, Muskeln und Zellen im Knochenmark vorhanden ist. Der 8-kb dmp1-Promotor hatte das gleiche Expressionsmuster, aber nur ein Teil der Osteoblasten und Knochenmarkzellen exprimierte das Protein, was darauf hindeutet, dass der 8-kb dmp1-Promotor spezifischer ist21. Trotzdem sollten Ergebnisse, die mit dem 8-kb-dmp1-Promotor erzielt wurden, mit Vorsicht interpretiert werden, und Genexpressionsprofile sollten routinemäßig unter Verwendung von Osteozyten- vs. Osteoblasten-spezifischen Markern erstellt werden, um sicherzustellen, dass die erhaltene Population von ausreichend hoher Reinheit ist.
Die Osteoklastenmarker OSCAR und Dcstamp wurden in hämatopoetischen nicht depletierten vs. depletierten Osteozytenpopulationen gefunden, was die Autoren zu der Schlussfolgerung führte, dass Verdauen, die durch Fraktionierung von 8-kb dmp1-topas neonatalen Calvaria und GFP-Sortierung erhalten wurden, mit hämatopoetischen Zellen kontaminiert sind. Die Kontamination mit hämatopoetischen Zellen hätte durch eine Straffung des GFP-Sortiertors gemildert werden können, da GFP-positive hämatopoetische Zellen eine relativ geringere GFP-Intensität aufwiesen als GFP-positive mesenchymale Zellen (Osteozyten)22.
Die Methoden zur Untersuchung von Osteozyten in vitro haben zu der jüngsten Fülle an Informationen über die Osteozytenbiologie beigetragen. Die Isolierung von Osteozyten ist jedoch nach wie vor ein arbeitsintensives und langwieriges Verfahren mit geringen Zellausbeuten. Die beschriebene Methode des Knochenaufschlusses unter Verwendung von Kollagenase und EDTA, oft bis zur Fraktion 823, dauert mehrere Stunden, in denen die Lebensfähigkeit der Osteozyten beansprucht wird. Forscher haben berichtet, dass Fraktionen (2\u20125) für die Zellsortierung 20 verwendet wurden, und haben gezeigt, dass das Expressionsprofil von Genen, die mit Osteozyten assoziiert sind, im Vergleich zu denen von Osteoblasten den Erfolg der Isolierung reiner Osteozytenpopulationen bestätigt20. In diesem Artikel beschreiben wir den Prozess der Gewinnung von Fraktionen (2\u20125) und vergleichen die Ausbeute an Osteozyten aus jeder Fraktion, beginnend mit Fraktion 1 bis 8, um die Rückgabe von Osteozyten in jeder Fraktion zu bestimmen. Wir beschreiben auch die Präparation von neugeborenen dmp1-Topas-Mausschädeln und die Schädelstockverdauung mit Kollagenase und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) sowie die Vorbereitung von Zellen für FACS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Data aquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235</td>
			<td>12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 &#956;m nylon mesh.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Wako, Osaka, Japan</td>
			<td>034-22363</td>
			<td>0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td>
			<td></td>
			<td>5mM EDTA prepared with 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAriaTM II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Filter Unit</td>
			<td>Merck Millipore, Ireland</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>0.22&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon cell strainer</td>
			<td>FALCON, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>40&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>0.5% x10. diluted to x1 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Wako, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 &#956;g/ml streptomycin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes

Der Ostezyt, von dem man einst annahm, dass er ein passiver Bewohner des Knochens ist, da er hinter den Kulissen die Funktion hat, mechanische Belastungen zu erfassen, wird nun ins Rampenlicht gerückt und es hat sich gezeigt, dass er mehrere Hauptfunktionen hat, wie z. B. die aktive Modifikation der extrazellulären Matrix und die Bildung eines endokrinen Organs mit dem lakunokanalikulären System, das es umschließt, das Nachrichten an entfernte Orte sendet. Dank der Methoden, die es ermöglichten, den Osteozyten in vitro zu testen, von der Isolierung primärer Osteozyten bis hin zu osteozytenähnlichen Zelllinien, erfahren Osteozyten heute ein durchschlagendes Interesse und einen Wissensschub über Struktur und Funktion. Viele Aspekte der Osteozytenbiologie und der Wechselwirkung mit anderen molekularen Komponenten sind noch nicht entdeckt. In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert die effiziente Isolierung von primären Osteozyten aus dmp1-topas-neonatalen Mausschäumen, die das grün fluoreszierende Protein in Osteozyten exprimieren, durch Zellfraktionierung und anschließenden Erwerb von Kulturen primärer Osteozyten mittels FACS.

Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, den Prozess der Gewinnung von Kulturen primärer Osteozyten aus dmp1-topaz neonatalen Mausschädeln durch einen Fraktionierungsprozess unter Verwendung von Kollagenase zum Abbau der Kollagenmatrix und EDTA für die Calciumchelation zu demonstrieren, wonach die Zellen für FACS vorbereitet werden, um Osteozyten von anderen Zellpopulationen zu trennen.
Methoden zur Gewinnung primärer Osteozyten aus neonatalen Mausschäumen beschreiben häufig die Verwe...

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Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

Dieses Protokoll beschreibt die Präparation von neonatalen dmp1-Topas-Mausschädeln und die Isolierung von Osteozyten, die das grün fluoreszierende Protein exprimieren, durch Zellverdau und Fraktionierung sowie die Osteozytenpräparation für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS).

Gewinnung primärer Osteozyten durch murine Schädelstockfraktionierung von GFP-exprimierenden Osteozyten

The osteocyte, once thought to be a passive resident of the bone given the backstage function of sensing mechanical loading, is now brought to the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Beziehen Eier von Xenopus laevis Weibchen

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Forschung

Biologie

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Vorbereitung und Fraktionierung von Xenopus laevis Egg Auszüge

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

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In situ subzelluläre Fraktionierung von adhärenten und nicht adhärenten Säugetierzellen

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Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

Polysomprofile Fraktionierung und Analyse von Säuger Translatomes auf einer Genom-weite Skala

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Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

Anwendung von Retinsäure zu Osteozyten Kulturen aus primären Maus-Osteoblasten erhalten

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...