Name: obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes
Uploaded: 2020-06-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes at JoVE.com

इस काम को जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (नंबर 19K10397 से H.K. और नंबर 18K09862 से Im.M.) से JSPS KAKENHI अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

सभी पशु प्रक्रियाओं और पशु देखभाल तोहोकू विश्वविद्यालय के नियमों और विनियमों के अनुसार किए गए थे।
1. नवजात डीएमपी 1-पुखराज माउस कैल्वरिया का विच्छेदन
<ol><li>इस प्रोटोकॉल के लिए, C57BL/6-Tg (Dmp1-Topaz)1Ikal/J चूहो...

<ol>
	<li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+and+death+of+bone+cells:+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis.">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells.">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li><li>Bonewald, L. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+Osteocyte-like+Cell+Line,+MLO-Y4.">Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).</li><li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+osteoid+preosteocyte-like+cell+MLO-A5+that+spontaneously+mineralizes+in+culture.">Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).</li><li>Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+Osteocytes+in+Their+3D+Native+Matrix+Versus+2D+In+Vitro+Models.">Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).</li><li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo.">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li><li>Spatz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+Inhibitor+Sclerostin+Is+Up-regulated+by+Mechanical+Unloading+in+Osteocytes+in+Vitro.">The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).</li><li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. 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Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes.">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li><li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bone Research Protocols. , 55-66 (2012).</li><li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone.">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li></ol>

पहला पृथक ओस्टियोसाइट एक चिकन कैल्वेरिया 7 से था जिसे (ओबी7.3 ) या पीएचईएक्स के एविएंट संस्करण का उपयोग करके अलग किया गया था; हालांकि, यह विधि व्यावहारिक एंटीबॉडी की उपलब्धता से सीमित है, क्योंकि ?...

ओस्टियोसाइट्स ओस्टियोब्लास्टिक पूर्वजों से टर्मिनल रूप से विभेदित कोशिकाएं हैं जो उनके स्रावित मैट्रिक्स1 में एम्बेडेड हो गईं। वे हड्डी कोशिका आबादी के बीच सबसे प्रचुर मात्रा में और सबसे लंबे समय तक रहने वाली कोशिकाएं हैं। वे लैकुने के भीतर रहते हैं और डेंड्राइट के साथ एक विशिष्ट स्टेलेट आकृति विज्ञान होता है जो कैनालिकली नामक चैनलों के माध्यम से फैलता है जो उनके आसपास के वातावरण और हड्डी की सतहके साथ संचार और चयापचय विनिमय का एक व्यापक नेटवर्क बनाता है। ओस्टियोसाइट्स अस्थि रीमॉडेलिंग में ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट दोनों भूमिकाओं को कोरियोग्राफ करते हैं, वे यांत्रिक लोडिंग3 के अनुकूलन प्रदान करने वाली प्राथमिक मेकेनोसेंसरी कोशिकाएं हैं, फॉस्फेट होमियोस्टैसिस4 और हड्डी मैट्रिक्स खनिजकरण5 में शामिल हैं, और लैकुनोकैनालिकुलर सिस्टम के साथ मिलकर, वे दूर के ऊतकों को संकेत देने वाले अंतःस्रावी अंग के रूप में कार्य करतेहैं।
ओस्टियोसाइट्स एक खनिज मैट्रिक्स के भीतर स्थित होते हैं, जो पहुंच को सीमित करता है और उनके अलगाव को चुनौतीपूर्ण बनाता है, इस प्रकार इन विट्रो जांच में बाधा डालता है। पहले अलगाव विधियों में से एक ने ओस्टियोसाइट-विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (ओबी 7.3)7 का उपयोग करके चिकन कैल्वेरिया से अलग ओस्टियोसाइट्स का वर्णन किया, जिसे बाद में पीएचईएक्स के एवियन संस्करण के रूप में जाना जाता था (एक्स क्रोमोसोम पर एंडोपेप्टिडेस के होमोलॉजी के साथ फॉस्फेट-विनियमन जीन)8। अन्य शोधकर्ताओं ने ओस्टियोसाइट युक्त अंशों को प्राप्त करने के लिए चूहे 9 या माउस 10 लंबी हड्डियों के अनुक्रमिक पाचन का उपयोग किया, जिसमें ओस्टियोसाइट शुद्धता लगभग70% 9 बताई गई थी। इस प्रक्रिया की सीमाओं में ओस्टियोसाइट्स के अलावा अन्य सेल प्रकारों से दूषित संस्कृतियों की उप-इष्टतम शुद्धता शामिल है और यह कि ओस्टियोसाइट्स को संस्कृति में अन्य कोशिकाओं द्वारा संभावित रूप से अतिरंजित किया जा सकता है क्योंकि ओस्टियोसाइट्स ने विभाजित करने की क्षमता खो दी है। ये चुनौतियां दीर्घकालिक संस्कृतियों की प्रयोज्यता को प्रतिबंधित करती हैं।
इन सीमाओं को दूर करने के लिए, विभिन्न ऑस्टियोसाइट सेल लाइनों को विकसित किया गया था। एमएलओ-वाई 4 सेल लाइन11 और एमएलओ-ए 5 सेल लाइन12 विशेष रूप से सबसे व्यापक रूप से अध्ययन की जाने वाली सेल लाइनें हैं जो प्रारंभिक चरण ओस्टियोसाइट्स के अध्ययन के लिए उपयोगी हैं; हालांकि, वे परिपक्व ओस्टियोसाइट सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए कम उपयोगी हैं क्योंकि वे स्क्लेरोस्टिन और एफजीएफ 2313 के निम्न स्तर को व्यक्त करते हैं, जिनमें से दोनों परिपक्व ओस्टियोसाइट मार्कर हैं। आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 14 और ओसी454 15 सहित अन्य सेल लाइनें, स्क्लेरोस्टिन और एफजीएफ 23 के उच्च स्तर को व्यक्त करती हैं और देर से ओस्टियोसाइट चरण का अध्ययन करने में उपयोगी होती हैं। सेल लाइनें उपयोगी अनुसंधान उपकरण साबित होती हैं; फिर भी, वे सीमाओं के बिना नहीं आते हैं क्योंकि वे प्राथमिक कोशिका के जीव विज्ञान का पूरी तरह से प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं। विभिन्न सेल लाइनें ओस्टियोसाइट परिपक्वता स्पेक्ट्रम के विभिन्न विकास चरणों का प्रतिनिधित्व करती हैं, और सेल लाइनें प्राथमिक ओस्टियोसाइट्स16,17 की विषमता का प्रतिनिधित्व करने में विफल रहती हैं।
प्राथमिक ओस्टियोसाइट्स की शुद्ध संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए, शोधकर्ताओं ने क्रे माउस मॉडल का लाभ उठाया जिसमें ओस्टियोसाइट्स18,19 में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) अभिव्यक्ति को चलाने के लिए 8-केबी डीएमपी 1 प्रमोटर का उपयोग किया जाता है। पाइक एट अल.19 द्वारा दोहरे ट्रांसजेनिक चूहों (पीओबी-कोल 2.3- जीएफपी-सियान और डीएमपी1-जीएफपी-टोपाज) और नाकाशिमा एट अल.20 द्वारा डीएमपी 1-टोपाज ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग ओस्टियोसाइट आबादी प्राप्त करने के लिए किया गया है। जिसमें उन्होंने प्राथमिक ओस्टियोसाइट्स19,20 की संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए जीएफपी को व्यक्त करने वाले ओस्टियोसाइट्स के अनुक्रमिक पाचन और एफएसीएस को नियोजित किया। 10-केबी डीएमपी 1 रिपोर्टर माउस एआई 9 में सीआरई की दिशा, जो टीडीटोमेटो प्रोटीन को सक्रिय करती है, अस्थि मज्जा के भीतर ओस्टियोसाइट्स, ओस्टियोब्लास्ट, मांसपेशियों और कोशिकाओं में मौजूद थी। 8-केबी डीएमपी 1 प्रमोटर में एक ही अभिव्यक्ति पैटर्न था, लेकिन ओस्टियोब्लास्ट और अस्थि मज्जा कोशिकाओं के केवल एक अनुपात ने प्रोटीन व्यक्त किया, जो इंगित करता है कि 8-केबी डीएमपी 1 प्रमोटर अधिक विशिष्ट21 है। इसके बावजूद, 8-केबी डीएमपी 1 प्रमोटर का उपयोग करके प्राप्त परिणामों को सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए, और जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल को ओस्टियोसाइट बनाम ओस्टियोब्लास्ट-विशिष्ट मार्करों का उपयोग करके नियमित रूप से किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि प्राप्त आबादी उच्च पर्याप्त शुद्धता की है।
ओस्टियोक्लास्ट मार्कर ऑस्कर और डीसीस्टैम्प हेमटोपोइएटिक गैर-क्षीण बनाम क्षीण ओस्टियोसाइट आबादी में पाए गए थे, इस खोज ने लेखकों को यह निष्कर्ष निकालने के लिए प्रेरित किया कि 8-केबी डीएमपी 1-टोपाज नवजात कलवरिया और जीएफपी सॉर्टिंग के विभाजन से प्राप्त पाचन हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं से दूषित हैं। हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के साथ संदूषण को जीएफपी सॉर्ट गेट को कसकर कम किया जा सकता था क्योंकि जीएफपी-पॉजिटिव हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं में जीएफपी-पॉजिटिव मेसेनकाइमल कोशिकाओं (ओस्टियोसाइट्स) की तुलना में काफी कम जीएफपी तीव्रता थी।
विट्रो में ओस्टियोसाइट्स का अध्ययन करने के तरीकों ने ओस्टियोसाइट जीव विज्ञान पर जानकारी के हालिया धन में योगदान दिया है। हालांकि, ओस्टियोसाइट अलगाव कम सेल पैदावार के साथ एक श्रम-गहन और लंबी प्रक्रिया बनी हुई है। कोलेजनेस और ईडीटीए का उपयोग करके हड्डी के पाचन की वर्णित विधि अक्सर अंश 823 तक, कई घंटे लगते हैं जिसमें ओस्टियोसाइट व्यवहार्यता पर कर लगाया जाता है। शोधकर्ताओं ने सेल सॉर्टिंग20 के लिए अंशों (2-5) का उपयोग करने की सूचना दी है, और दिखाया है कि ओस्टियोसाइट्स बनाम ओस्टियोब्लास्ट से जुड़े जीन की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल शुद्ध ओस्टियोसाइट आबादी20 को अलग करने की सफलता की पुष्टि करती है। इस लेख में, हम अंश (2-5) प्राप्त करने की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, और हम प्रत्येक अंश में ओस्टियोसाइट्स की वापसी निर्धारित करने के लिए अंश 1 से 8 से शुरू होने वाले प्रत्येक अंश से ओस्टियोसाइट्स की उपज की तुलना करते हैं। हम कोलेजनेस और एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) का उपयोग करके नवजात डीएमपी 1-टोपाज़ माउस कैल्वेरिया और कैल्वरियल पाचन के विच्छेदन के साथ-साथ एफएसीएस के लिए कोशिकाओं की तैयारी का भी वर्णन करते हैं।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Data aquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235</td>
			<td>12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 &#956;m nylon mesh.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Wako, Osaka, Japan</td>
			<td>034-22363</td>
			<td>0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td>
			<td></td>
			<td>5mM EDTA prepared with 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAriaTM II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Filter Unit</td>
			<td>Merck Millipore, Ireland</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>0.22&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon cell strainer</td>
			<td>FALCON, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>40&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>0.5% x10. diluted to x1 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Wako, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 &#956;g/ml streptomycin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes

ओस्टियोसाइट, जिसे एक बार यांत्रिक लोडिंग को महसूस करने के बैकस्टेज फ़ंक्शन को देखते हुए हड्डी का निष्क्रिय निवासी माना जाता था, अब सुर्खियों में लाया गया है और इसमें कई प्रमुख कार्य दिखाए गए हैं जैसे कि बाह्य मैट्रिक्स को सक्रिय रूप से संशोधित करना और लैकुनोकैनालिकुलर सिस्टम के साथ एक अंतःस्रावी अंग बनाना जो इसे दूर की साइटों पर संदेश भेजता है। उन तरीकों के कारण जो प्राथमिक ओस्टियोसाइट्स को अलग करने से ओस्टियोसाइट जैसी सेल लाइनों तक विट्रो में ओस्टियोसाइट का परीक्षण करना संभव बनाते हैं, ओस्टियोसाइट्स अब संरचना और कार्य पर एक शानदार रुचि और ज्ञान की वृद्धि का अनुभव कर रहे हैं। ओस्टियोसाइट जीव विज्ञान और अन्य आणविक घटकों के साथ बातचीत के कई पहलुओं की खोज की जानी बाकी है। इस प्रोटोकॉल में, हम डीएमपी 1-टोपाज़ नवजात माउस कैल्वेरिया से प्राथमिक ओस्टियोसाइट्स के कुशल अलगाव का विस्तार से वर्णन करते हैं, जो सेल फ्रैक्शनेशन के माध्यम से ओस्टियोसाइट्स में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करते हैं और बाद में एफएसीएस द्वारा प्राथमिक ओस्टियोसाइट्स की संस्कृतियों को प्राप्त करते हैं।

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य कोलेजन मैट्रिक्स को नीचा दिखाने के लिए कोलेजनेज का उपयोग करके एक फ्रैक्शनेशन प्रक्रिया के माध्यम से डीएमपी 1-टोपाज़ नवजात माउस कलवारिया से प्राथमिक ओस्टियोसाइट्स की संस्कृ?...

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Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

यह प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) के लिए ओस्टियोसाइट तैयारी के अलावा, सेल पाचन और फ्रैक्शनेशन के माध्यम से हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करने वाले नवजात डीएमपी 1-टोपाज़ माउस कैल्वेरिया के विच्छेदन और ओस्टियोसाइट्स के अलगाव का वर्णन करता है।

जीएफपी-व्यक्त ओस्टियोसाइट्स के मुराइन कैल्वरियल फ्रैक्शनेशन के माध्यम से प्राथमिक ओस्टियोसाइट्स प्राप्त करना

The osteocyte, once thought to be a passive resident of the bone given the backstage function of sensing mechanical loading, is now brought to the ...

Primary osteocyte isolation is a lengthy procedure that often leaves out in low cell areas. This protocol provides efficient methods for isolating high numbers of primary GFP-expressing osteocytes. This protocol reduces the handling time and allows a higher number of osteocytes to be obtained in a single procedure with minimal contamination from hematopoietic or mesenchymal cells.For the isolation of GFP-expressing osteocytes, place euthanized, postnatal day six to seven, transgenic mouse pups into a non-treated culture dish, and use scissors and tweezers to grasp the skin at the base of one's skull. Use the scissors to make an initial incision in the lifted skin, followed by cuts along both sides of the skull in front of the ears. Remove the skin to expose the calvaria and holding the head from the nasal bridge, cut the calvaria along the lamboid suture and along the edges of the parietal bones to the frontal part of the tissue.Separate the calvaria from the underlying brain tissue and place the bones concave side up in PBS. To obtain fraction one, pool up to five calvaria per 50-milliliter tube in five milliliters of freshly prepared two-milligram per milliliter collagenase, and incubate the tissues at 37 degrees Celsius and 300 revolutions per minute for 20 minutes. At the end of the incubation, discard the digest from fraction one and wash the calvaria with five milliliters of PBS.Replace the wash with five milliliters of five-millimolar EDTA supplemented with one milligram per milliliter of bovine serum albumin in PBS for 15 minutes at 37 degrees Celsius with shaking. At the end of the incubation, transfer the digest to a 50-milliliter conical tube and wash the calveria with five milliliters of PBS. Then transfer the wash solution to the digest.To obtain fraction two, place the digest for centrifugation and discard the supernatant. Re-suspend the pellet in eight milliliters of alpha minimum essential medium containing 10%fetal bovine serum, or FBS, and antibiotics, and seed the cells onto a 10-centimeter culture dish. Then place the fraction two cells into the cell culture incubator.After collecting and culturing fractions three and four as just demonstrated. Incubate the calveria in five milliliters of five-millimolar EDTA supplemented with one milligram per milliliter of bovine serum albumin in PBS for 15 minutes at 37 degrees Celsius with shaking. At the end of the incubation, collect and culture fraction five as demonstrated for fractions two, three, and four.Immediately after fractionation, collect the cells for sorting. Alternatively, collect the cells after 24 hours of culture by aspirating the medium and gently wash the cells two times with 10 milliliters of PBS per dish per wash. After the second wash, treat the cells with five milliliters of 0.5%tripsin EDTA in PBS per plate.After five minutes at 37 degrees Celsius, add five milliliters of complete alpha minimum essential medium to each plate and gently detach the cells with pipetting. To combine the cells in each fraction, filter the cell suspensions through a 40-micron cell strainer into a single 50-milliliter conical centrifuge tube. After washing the cells with 10 milliliters of PBS, add them to the tube.Filter the cells through a strainer and collect the cells by centrifugation. Once the cells are pelleted down, re-suspend the pellet in complete minimal essential medium to a one times 10 to the seventh cells per milliliter of medium concentration and filter the cells through a 35-micron nylon mesh capped tube. To test the efficiency of this method, fractions were separately sorted and cultured for 24 hours to determine the percentage and yield of osteocytes from each fraction.The density of the osteocytes in fractions two to five were higher than that observed for fraction one and decreased remarkably in fractions six, seven, and eight. Although the percentage of osteocytes obtained between all of the fractions is not statistically significant, the density of the osteocytes differs dramatically between fractions. Here the gating strategy for isolating GFP-positive osteocytes from their GFP-negative counterparts by fluorescence-activated cell sorting is shown.After sorting, osteocytes can be analyzed for the expression of osteocyte markers of interest. In this analysis, the osteocyte marker genes were expressed at higher levels in the isolated GFP-positive osteocytes compared to presort fraction two, which is known as a high osteoblast fraction. Here the morphology of a GFP-positive osteocyte retaining a stellate shape with dendrites extending from the cell body after 24 hours of culture on a plastic culture dish, post sort, can be observed.Pay attention when aspirating the digests as the calveria will be reduced to minute pellets. Remember to use a small tip aspirator to avoid cell loss. Osteocytes have been enigmatic because they are entombed in bone.This technique has paved the way to studying osteocyte molecular interactions and their control over osteoclasts and osteoblasts.

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Xenopus laevis महिलाओं से अंडे प्राप्त करना

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

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Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

प्राथमिक electroporation के लिए murine अस्थि मज्जा से hematopoietic सेल संस्कृतियों की तैयारी

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

प्राथमिक संस्कृति और Corti के murine अंग के प्लाज्मिड electroporation.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

आण्विक Fractionation वजन के आधार के लिए तरल चरण रिकवरी के साथ GELFREE 8100 Fractionation प्रणाली का उपयोग

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

के ट्रांसप्लांटेशन GFP chimeric Zebrafish भ्रूण में रेटिना और मस्तिष्क के विकास के लाइव इमेजिंग के लिए Blastomeres व्यक्त

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

प्राथमिक माउस अस्थिकोरक से osteocytes संस्कृतियों प्राप्त करने के लिए retinoic एसिड का अनुप्रयोग

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

प्राथमिक संस् Murine Enterochromaffin कक्षों की संपूर्ण कक्ष इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

आंतों के क्रिप्ट्स से मुरीन प्राइमरी कोलन एपिथेलियल मोनोलेयर्स की पीढ़ी

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भड़काऊ गठिया का अनावरण: श्लेष कोशिकाओं के कार्यों की खोज

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

लेखक स्पॉटलाइट: म्यूरिन गठिया ऊतक से प्राथमिक श्लेष मैक्रोफेज और फाइब्रोब्लास्ट का अलगाव और संस्कृति  

"मुराइन गठिया ऊतक से प्राथमिक श्लेष मैक्रोफेज और फाइब्रोब्लास्ट का अलगाव और संस्कृति"।

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...