Name: obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes
Uploaded: 2020-06-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av et JSPS KAKENHI-stipend fra Japan Society for the Promotion of Science (nr. 19K10397 til HK og nr. 18K09862 til I.M.).

Alle dyreprosedyrer og dyrepleie ble utført i samsvar med Tohoku University regler og forskrifter.
1. Disseksjon av nyfødt dmp1-topas mus calvaria
<ol><li>For denne protokollen, bruk 6\u20127 dager gamle valper med C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J-mus. Avlive mus med 5% isofluran inhalasjon og overfør deretter valpene til 70% etanol.</li>
	<li>Overfør den avlivede valpen til en ikke-behandlet kulturskål.</li>
	<li>Bruk saks og pinsett, ta tak i huden ved foten av skallen og gjør et snitt....

<ol>
	<li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+and+death+of+bone+cells:+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis.">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells.">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+Transduction+in+Osteocytes.">Mechanosensation and Transduction in Osteocytes.</a> BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).</li><li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism.">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li><li>Lane, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid-Treated+Mice+Have+Localized+Changes+in+Trabecular+Bone+Material+Properties+and+Osteocyte+Lacunar+Size+That+Are+Not+Observed+in+Placebo-Treated+or+Estrogen-Deficient+Mice.">Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).</li><li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Osteocyte:+An+Endocrine+Cell+...+and+More.">The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li><li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+osteocytes.">Isolation and purification of osteocytes.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).</li><li>Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte-specific+monoclonal+antibody+MAb+OB7.3+is+directed+against+Phex+protein.">Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).</li><li>Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikk&#246;, K., V&#228;&#228;n&#228;nen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro.">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).</li><li>Kramer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte+Wnt/&#946;-Catenin+Signaling+Is+Required+for+Normal+Bone+Homeostasis.">Osteocyte Wnt/&#946;-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis.</a> Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).</li><li>Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+Osteocyte-like+Cell+Line,+MLO-Y4.">Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).</li><li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+osteoid+preosteocyte-like+cell+MLO-A5+that+spontaneously+mineralizes+in+culture.">Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).</li><li>Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+Osteocytes+in+Their+3D+Native+Matrix+Versus+2D+In+Vitro+Models.">Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).</li><li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo.">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li><li>Spatz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+Inhibitor+Sclerostin+Is+Up-regulated+by+Mechanical+Unloading+in+Osteocytes+in+Vitro.">The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).</li><li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+relevance+of+cancer+cell+lines.">The clinical relevance of cancer cell lines.</a> Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).</li><li>Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+tumor+characteristic+gene+expression+in+cell+lines+using+a+tissue+similarity+index+(TSI).">Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).</li><li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dentin+matrix+protein+1+expression+during+osteoblastic+differentiation,+generation+of+an+osteocyte+GFP-transgene.">Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene.</a> Bone. 35 (1), 74-82 (2004).</li><li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes.">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> Bone. 45 (4), 682-692 (2009).</li><li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+osteocyte+regulation+of+bone+homeostasis+through+RANKL+expression.">Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).</li><li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte+biology.">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology.</a> Bone. 54 (2), 296-306 (2013).</li><li>Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes.">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li><li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bone Research Protocols. , 55-66 (2012).</li><li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone.">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li></ol>

Den første isolerte osteocytten var fra en kylling calvaria7 isolert ved bruk (OB7.3) eller aviantvarianten av PHEX; Imidlertid er denne metoden begrenset av tilgjengeligheten av brukbare antistoffer, da osteocyttspesifikke antistoffer som også er spesifikke, må fremstilles. Forskere brukte en annen modifikasjon av den sekvensielle enzymatiske prosessen for å oppnå osteocytter fra mus og rotte lange bein; Den rapporterte renheten til disse kulturene ble satt til ca. 70%9</su...

Osteocytter er terminalt differensierte celler fra osteoblastiske progenitorer som ble innebygd i deres utskilles matrise1. De er de mest tallrike og lengstlevende cellene blant beincellepopulasjoner. De bor i lacunae og har en karakteristisk stellatmorfologi med dendritter som strekker seg gjennom kanaler kalt canaliculi som danner et omfattende nettverk av kommunikasjon og metabolsk utveksling med omgivelsene og beinoverflaten2. Osteocytter koreograferer både osteoblaster og osteoklaster roller i beinremodellering, de er de primære mekanosensoriske cellene som gir tilpasning til mekanisk belastning3, er involvert i fosfathomeostase4 og benmatrisemineralisering5, og sammen med lacunocanalicular systemet fungerer de som et endokrine organ som signaliserer fjernt vev6.
Osteocytter ligger i en mineralisert matrise, noe som begrenser tilgjengeligheten og gjør isolasjonen utfordrende, og dermed hindrer in vitro-undersøkelse. En av de første isolasjonsmetodene beskrev isolerte osteocytter fra kylling calvaria ved hjelp av et osteocyttspesifikt monoklonalt antistoff (OB7.3)7 som senere ble kjent å være fuglevarianten av PHEX (PHosfatregulerende gen med homologi til endopeptidaser på X-kromosomet)8. Andre forskere brukte sekvensiell fordøyelse av rotte 9 ellermus 10 lange bein for å oppnå osteocytrike fraksjoner der osteocytrenhet ble rapportert å være rundt 70%9. Begrensninger i denne prosedyren inkluderer den suboptimale renheten av kulturer forurenset med andre celletyper i tillegg til osteocytter, og at osteocytter potensielt kan overgros av andre celler i kultur siden osteocytter har mistet evnen til å dele seg. Disse utfordringene begrenser bruken av langsiktige kulturer.
For å overvinne disse begrensningene ble forskjellige osteocytcellelinjer utviklet. MLO-Y4-cellelinjen11 og MLO-A5-cellelinjen12 er spesielt de mest studerte cellelinjene som er nyttige for studiet av osteocytter i tidlig stadium; Imidlertid er de mindre nyttige for å studere moden osteocyttsignalering, da de uttrykker lave nivåer av sklerostin og FGF2313, som begge er modne osteocytmarkører. Andre cellelinjer, inkludert IDG-SW3 14 og Ocy45415, uttrykker høye nivåer av sklerostin og FGF23 og er nyttige for å studere sent osteocyttstadium. Cellelinjer viser seg å være nyttige forskningsverktøy; Likevel kommer de ikke uten begrensninger, da de ikke fullt ut representerer biologien til primærcellen. Ulike cellelinjer representerer forskjellige utviklingsstadier av osteocyttmodenhetsspekteret, og cellelinjer klarer ikke å representere heterogeniteten til primære osteocytter16,17.
For å oppnå rene kulturer av primære osteocytter, benyttet forskerne seg av cre-musemodellen der 8-kb dmp1-promotoren brukes til å drive grønt fluorescerende protein (GFP) -uttrykk i osteocytter18,19. Dual transgene mus (pOB-Col 2.3- GFP-cyan og DMP1-GFP-topaz) av Paic et al.19 og dmp1-topaz transgene mus av Nakashima et al.20 har blitt brukt til å oppnå osteocytpopulasjoner. Der de benyttet sekvensiell fordøyelse og FACS av osteocytter som uttrykker GFP for å skaffe kulturer av primære osteocytter19,20. Retningen av cre i 10-kb dmp1 reportermus Ai9, som aktiverer tdTomato-proteinet, ble vist å være tilstede i osteocytter, osteoblaster, muskler og celler i beinmargen. 8-kb dmp1-promotoren hadde samme uttrykksmønster, men bare en andel osteoblaster og benmargceller uttrykte proteinet, noe som indikerer at 8-kb dmp1-promotoren er mer spesifikk21. Til tross for dette bør resultater oppnådd ved bruk av 8-kb dmp1-promotoren tolkes med forsiktighet, og genuttrykksprofiler bør rutinemessig utføres ved bruk av osteocyt vs. osteoblastspesifikke markører for å sikre at den oppnådde populasjonen er av høy nok renhet.
Osteoklastmarkører OSCAR og Dcstamp ble funnet i hematopoietiske ikke-utarmede vs. utarmede osteocytpopulasjoner, dette funnet førte forfatterne til å konkludere med at fordøyelser oppnådd ved fraksjonering av 8-kb dmp1-topaz neonatal calvaria og GFP-sortering er forurenset med hematopoietiske celler. Forurensning med hematopoietiske celler kunne ha blitt redusert ved å stramme GFP-sorteringsporten siden GFP-positive hematopoietiske celler hadde en rimelig lavere GFP-intensitet enn GFP-positive mesenkymale celler (osteocytter)22.
Metodene for å studere osteocytter in vitro har bidratt til det nyvell av informasjon om osteocytbiologi. Imidlertid forblir osteocyttisolering en arbeidsintensiv og langvarig prosedyre med lave celleutbytter. Den beskrevne metoden for beinfordøyelse ved bruk av kollagenase og EDTA, ofte opp til fraksjon 823, tar flere timer hvor osteocyt levedyktighet beskattes. Forskere har rapportert å bruke fraksjoner (2 \u20125) for cellesortering 20, og har vist at uttrykksprofilen til gener assosiert med osteocytter versus osteoblaster bekrefter suksessen med å isolere rene osteocytpopulasjoner20. I denne artikkelen beskriver vi prosessen med å oppnå fraksjoner (2\u20125), og vi sammenligner utbyttet av osteocytter fra hver fraksjon som starter med fraksjon 1 til 8 for å bestemme retur av osteocytter i hver fraksjon. Vi beskriver også disseksjon av nyfødt dmp1-topas mus calvaria og calvarial fordøyelse ved hjelp av kollagenase og etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), samt fremstilling av celler for FACS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Data aquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235</td>
			<td>12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 &#956;m nylon mesh.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Wako, Osaka, Japan</td>
			<td>034-22363</td>
			<td>0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td>
			<td></td>
			<td>5mM EDTA prepared with 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAriaTM II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Filter Unit</td>
			<td>Merck Millipore, Ireland</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>0.22&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon cell strainer</td>
			<td>FALCON, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>40&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>0.5% x10. diluted to x1 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Wako, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 &#956;g/ml streptomycin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes

Osteocytten, en gang antatt å være en passiv beboer i beinet gitt backstage-funksjonen til å føle mekanisk belastning, blir nå brakt i søkelyset og har vist seg å ha flere hovedfunksjoner som aktivt å modifisere den ekstracellulære matrisen og danne et endokrint organ med lacunocanalicular systemet som omslutter det å sende meldinger til fjerne steder. På grunn av metodene som gjorde det mulig å teste osteocytten in vitro fra isolering av primære osteocytter til osteocyttlignende cellelinjer, opplever osteocytter nå en rungende interesse og en bølge av kunnskap om struktur og funksjon. Mange aspekter av osteocytbiologi og interaksjon med andre molekylære komponenter er ennå ikke oppdaget. I denne protokollen beskriver vi i detalj effektiv isolering av primære osteocytter fra dmp1-topaz neonatal mus calvaria, som uttrykker det grønne fluorescerende proteinet i osteocytter, gjennom cellefraksjonering og deretter anskaffelse av kulturer av primære osteocytter ved FACS.

Formålet med denne protokollen er å demonstrere prosessen med å skaffe kulturer av primære osteocytter fra dmp1-topaz neonatal mus calvaria gjennom en fraksjoneringsprosess ved bruk av kollagennase for å nedbryte kollagenmatrisen og EDTA for kalsiumkelering, hvoretter celler fremstilles for FACS for å skille osteocytter fra andre cellepopulasjoner.
Metoder for å få tak i primære osteocytter fra neonatal mus calvaria beskriver ofte bruk av fraksjoner (1\u20128) for sortering<sup class=...

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes at JoVE.com

Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

Denne protokollen beskriver disseksjon av neonatal dmp1-topaz mus calvaria og isolering av osteocytter som uttrykker det grønne fluorescerende proteinet gjennom cellefordøyelse og fraksjonering, i tillegg til osteocytpreparasjon for fluorescensaktivert cellesortering (FACS).

Oppnå primære osteocytter gjennom murine calvarial fraksjonering av GFP-uttrykkende osteocytter

The osteocyte, once thought to be a passive resident of the bone given the backstage function of sensing mechanical loading, is now brought to the ...

Primary osteocyte isolation is a lengthy procedure that often leaves out in low cell areas. This protocol provides efficient methods for isolating high numbers of primary GFP-expressing osteocytes. This protocol reduces the handling time and allows a higher number of osteocytes to be obtained in a single procedure with minimal contamination from hematopoietic or mesenchymal cells.For the isolation of GFP-expressing osteocytes, place euthanized, postnatal day six to seven, transgenic mouse pups into a non-treated culture dish, and use scissors and tweezers to grasp the skin at the base of one's skull. Use the scissors to make an initial incision in the lifted skin, followed by cuts along both sides of the skull in front of the ears. Remove the skin to expose the calvaria and holding the head from the nasal bridge, cut the calvaria along the lamboid suture and along the edges of the parietal bones to the frontal part of the tissue.Separate the calvaria from the underlying brain tissue and place the bones concave side up in PBS. To obtain fraction one, pool up to five calvaria per 50-milliliter tube in five milliliters of freshly prepared two-milligram per milliliter collagenase, and incubate the tissues at 37 degrees Celsius and 300 revolutions per minute for 20 minutes. At the end of the incubation, discard the digest from fraction one and wash the calvaria with five milliliters of PBS.Replace the wash with five milliliters of five-millimolar EDTA supplemented with one milligram per milliliter of bovine serum albumin in PBS for 15 minutes at 37 degrees Celsius with shaking. At the end of the incubation, transfer the digest to a 50-milliliter conical tube and wash the calveria with five milliliters of PBS. Then transfer the wash solution to the digest.To obtain fraction two, place the digest for centrifugation and discard the supernatant. Re-suspend the pellet in eight milliliters of alpha minimum essential medium containing 10%fetal bovine serum, or FBS, and antibiotics, and seed the cells onto a 10-centimeter culture dish. Then place the fraction two cells into the cell culture incubator.After collecting and culturing fractions three and four as just demonstrated. Incubate the calveria in five milliliters of five-millimolar EDTA supplemented with one milligram per milliliter of bovine serum albumin in PBS for 15 minutes at 37 degrees Celsius with shaking. At the end of the incubation, collect and culture fraction five as demonstrated for fractions two, three, and four.Immediately after fractionation, collect the cells for sorting. Alternatively, collect the cells after 24 hours of culture by aspirating the medium and gently wash the cells two times with 10 milliliters of PBS per dish per wash. After the second wash, treat the cells with five milliliters of 0.5%tripsin EDTA in PBS per plate.After five minutes at 37 degrees Celsius, add five milliliters of complete alpha minimum essential medium to each plate and gently detach the cells with pipetting. To combine the cells in each fraction, filter the cell suspensions through a 40-micron cell strainer into a single 50-milliliter conical centrifuge tube. After washing the cells with 10 milliliters of PBS, add them to the tube.Filter the cells through a strainer and collect the cells by centrifugation. Once the cells are pelleted down, re-suspend the pellet in complete minimal essential medium to a one times 10 to the seventh cells per milliliter of medium concentration and filter the cells through a 35-micron nylon mesh capped tube. To test the efficiency of this method, fractions were separately sorted and cultured for 24 hours to determine the percentage and yield of osteocytes from each fraction.The density of the osteocytes in fractions two to five were higher than that observed for fraction one and decreased remarkably in fractions six, seven, and eight. Although the percentage of osteocytes obtained between all of the fractions is not statistically significant, the density of the osteocytes differs dramatically between fractions. Here the gating strategy for isolating GFP-positive osteocytes from their GFP-negative counterparts by fluorescence-activated cell sorting is shown.After sorting, osteocytes can be analyzed for the expression of osteocyte markers of interest. In this analysis, the osteocyte marker genes were expressed at higher levels in the isolated GFP-positive osteocytes compared to presort fraction two, which is known as a high osteoblast fraction. Here the morphology of a GFP-positive osteocyte retaining a stellate shape with dendrites extending from the cell body after 24 hours of culture on a plastic culture dish, post sort, can be observed.Pay attention when aspirating the digests as the calveria will be reduced to minute pellets. Remember to use a small tip aspirator to avoid cell loss. Osteocytes have been enigmatic because they are entombed in bone.This technique has paved the way to studying osteocyte molecular interactions and their control over osteoclasts and osteoblasts.

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

Anvendelse av retinsyre skaffer osteocytter kulturer fra hovedmuse Osteoblaster

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Hele cellen elektrofysiologi primære kulturperler Murine Enterochromaffin celler

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

Generasjon murine primær kolon epitelial monolayers fra intestinale krypter

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Avduking av inflammatorisk leddgikt: Utforske funksjoner til synovialceller

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Forfatter Spotlight: Isolering og kultur av primære synoviale makrofager og fibroblaster fra museartrittvev  

Isolering og kultur av primære synoviale makrofager og fibroblaster fra murintartrittvev

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...