Name: obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes
Uploaded: 2020-06-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av ett JSPS KAKENHI-bidrag från Japan Society for the Promotion of Science (nr 19K10397 till H.K. och nr 18K09862 till I.M.).

Alla djurförsök och djurvård utfördes i enlighet med Tohoku University regler och förordningar.
1. Dissektion av nyfödda dmp1-topas muscalvaria
<ol><li>För detta protokoll, använd 6\u20127 dagar gamla ungar av C57BL / 6-Tg (Dmp1-Topaz) 1Ikal / J möss. Avliva möss med 5% isofluran inhalation och överför sedan ungarna till 70% etanol.</li>
	<li>Överför den avlivade valpen till en obehandlad odlingsrätt.</li>
	<li>Använd sax och pincett, ta tag i huden vid basen av skallen och g...

<ol>
	<li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+and+death+of+bone+cells:+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis.">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells.">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+Transduction+in+Osteocytes.">Mechanosensation and Transduction in Osteocytes.</a> BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).</li><li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism.">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li><li>Lane, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid-Treated+Mice+Have+Localized+Changes+in+Trabecular+Bone+Material+Properties+and+Osteocyte+Lacunar+Size+That+Are+Not+Observed+in+Placebo-Treated+or+Estrogen-Deficient+Mice.">Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).</li><li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Osteocyte:+An+Endocrine+Cell+...+and+More.">The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li><li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+osteocytes.">Isolation and purification of osteocytes.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).</li><li>Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte-specific+monoclonal+antibody+MAb+OB7.3+is+directed+against+Phex+protein.">Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).</li><li>Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikk&#246;, K., V&#228;&#228;n&#228;nen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro.">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).</li><li>Kramer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte+Wnt/&#946;-Catenin+Signaling+Is+Required+for+Normal+Bone+Homeostasis.">Osteocyte Wnt/&#946;-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis.</a> Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).</li><li>Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+Osteocyte-like+Cell+Line,+MLO-Y4.">Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).</li><li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+osteoid+preosteocyte-like+cell+MLO-A5+that+spontaneously+mineralizes+in+culture.">Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).</li><li>Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+Osteocytes+in+Their+3D+Native+Matrix+Versus+2D+In+Vitro+Models.">Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).</li><li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo.">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li><li>Spatz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+Inhibitor+Sclerostin+Is+Up-regulated+by+Mechanical+Unloading+in+Osteocytes+in+Vitro.">The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).</li><li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+relevance+of+cancer+cell+lines.">The clinical relevance of cancer cell lines.</a> Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).</li><li>Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+tumor+characteristic+gene+expression+in+cell+lines+using+a+tissue+similarity+index+(TSI).">Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).</li><li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dentin+matrix+protein+1+expression+during+osteoblastic+differentiation,+generation+of+an+osteocyte+GFP-transgene.">Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene.</a> Bone. 35 (1), 74-82 (2004).</li><li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes.">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> Bone. 45 (4), 682-692 (2009).</li><li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+osteocyte+regulation+of+bone+homeostasis+through+RANKL+expression.">Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).</li><li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte+biology.">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology.</a> Bone. 54 (2), 296-306 (2013).</li><li>Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes.">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li><li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bone Research Protocols. , 55-66 (2012).</li><li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone.">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li></ol>

Den första isolerade osteocyten var från en kycklingcalvaria7 isolerad med användning av (OB7.3) eller den avianta varianten av PHEX; Denna metod begränsas dock av tillgången på fungerande antikroppar, eftersom osteocytspecifika antikroppar som också är speciespecifika måste tillverkas. Forskare använde en annan modifiering av den sekventiella enzymatiska processen för att erhålla osteocyter från mus och råtta långa ben; Den rapporterade renheten hos dessa kulturer fastställdes til...

Osteocyter är terminalt differentierade celler från osteoblastiska föregångare som blev inbäddade i deras utsöndrade matris1. De är de vanligaste och längst levande cellerna bland bencellspopulationer. De bor inom lacunae och har en karakteristisk stellatmorfologi med dendriter som sträcker sig genom kanaler som kallas canaliculi och bildar ett omfattande nätverk av kommunikation och metaboliskt utbyte med sin omgivande miljö och benytan2. Osteocyter koreograferar både osteoblaster och osteoklaster roller i benombyggnad, de är de primära mekanosensoriska cellerna som ger anpassning till mekanisk belastning3, är involverade i fosfathomeostas4 och benmatrismineralisering5, och tillsammans med lacunocanalicular systemet fungerar de som ett endokrint organ som signalerar avlägsna vävnader6.
Osteocyter ligger inom en mineraliserad matris, vilket begränsar tillgängligheten och gör deras isolering utmanande, vilket hindrar in vitro-undersökning. En av de första isoleringsmetoderna beskrev isolerade osteocyter från kycklingkalvaria med användning av en osteocytspecifik monoklonal antikropp (OB7.3)7 som senare blev känd för att vara den aviära varianten av PHEX (PHosphate-reglerande gen med homologi till endopeptidaser på X-kromosomen)8. Andra forskare använde sekventiell nedbrytning av råtta 9 eller mus 10 långa ben för att erhålla osteocytrika fraktioner där osteocyterrenhet rapporterades vara cirka70%9. Begränsningar av denna procedur inkluderar den suboptimala renheten hos kulturer som är förorenade med andra celltyper förutom osteocyter och att osteocyter potentiellt kan övervuxna av andra celler i odling eftersom osteocyter har förlorat förmågan att dela sig. Dessa utmaningar begränsar användbarheten av långsiktiga kulturer.
För att övervinna dessa begränsningar utvecklades olika osteocytcellinjer. MLO-Y4-cellinjen11 och MLO-A5-cellinjen12 är särskilt de mest studerade cellinjerna som är användbara för studier av osteocyter i tidigt stadium; De är dock mindre användbara för att studera mogen osteocytsignalering eftersom de uttrycker låga nivåer av sklerostin och FGF2313, som båda är mogna osteocytmarkörer. Andra cellinjer, inklusive IDG-SW3 14 och Ocy45415, uttrycker höga nivåer av sklerostin och FGF23 och är användbara för att studera det sena arostocytstadiet. Cellinjer visar sig vara användbara forskningsverktyg; Ändå kommer de inte utan begränsningar eftersom de inte helt representerar biologin hos den primära cellen. Olika cellinjer representerar olika utvecklingsstadier av osteocytmognadsspektrumet, och cellinjer representerar inte heterogeniteten hos primära osteocyter16,17.
För att erhålla rena kulturer av primära osteocyter utnyttjade forskare cre-musmodellen där 8-kb dmp1-promotorn används för att driva grönt fluorescerande protein (GFP) uttryck i osteocyter18,19. Dubbla transgena möss (pOB-Col 2.3- GFP-cyan och DMP1-GFP-topas) av Paic et al.19 och dmp1-topaz transgena möss av Nakashima et al.20 har använts för att erhålla osteocytpopulationer. I vilken de använde sekventiell matsmältning och FACS av osteocyter som uttrycker GFP för att förvärva kulturer av primära osteocyter19,20. Riktningen för cre i 10-kb dmp1-reportermusen Ai9, som aktiverar tdTomato-proteinet, visade sig vara närvarande i osteocyter, osteoblaster, muskler och celler i benmärgen. 8-kb dmp1-promotorn hade samma uttrycksmönster, men endast en andel osteoblaster och benmärgsceller uttryckte proteinet, vilket indikerar att 8-kb dmp1-promotorn är mer specifik21. Trots detta bör resultat som erhållits med hjälp av 8-kb dmp1-promotorn tolkas med försiktighet, och genuttrycksprofiler bör rutinmässigt utföras med användning av osteocyt kontra osteoblastspecifika markörer för att säkerställa att den erhållna populationen är av tillräckligt hög renhet.
Osteoklastmarkörer OSCAR och Dcstamp hittades i hematopoetiska icke-utarmade kontra utarmade osteocytpopulationer, detta fynd ledde författarna till slutsatsen att smälter erhållna från fraktionering av 8-kb dmp1-topaz neonatal calvaria och GFP-sortering är förorenade med hematopoetiska celler. Kontaminering med hematopoetiska celler kunde ha mildrats genom att dra åt GFP-sorteringsporten eftersom GFP-positiva hematopoetiska celler hade en rimligt lägre GFP-intensitet än GFP-positiva mesenkymala celler (osteocyter)22.
Metoderna för att studera osteocyter in vitro har bidragit till den senaste tidens mängd information om osteocytbiologi. Osteocytisolering är emellertid fortfarande ett arbetsintensivt och långvarigt förfarande med låga cellutbyten. Den beskrivna metoden för benförtunning med användning av kollagenas och EDTA, ofta upp till fraktion 823, tar flera timmar där osteocytlivskraften beskattas. Forskare har rapporterat att man använder fraktioner (2\u20125) för cellsortering 20, och har visat att uttrycksprofilen för gener associerade med osteocyter kontra osteoblaster bekräftar framgången med att isolera rena arostocytpopulationer20. I den här artikeln beskriver vi processen för att erhålla fraktioner (2-125), och vi jämför utbytet av osteocyter från varje fraktion som börjar med fraktion 1 till 8 för att bestämma återkomsten av osteocyter i varje fraktion. Vi beskriver också dissektion av nyfödd dmp1-topas muscalvaria och calvarial digestion med användning av kollagenas och etylendiamintetraättiksyra (EDTA), samt beredning av celler för FACS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Data aquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235</td>
			<td>12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 &#956;m nylon mesh.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Wako, Osaka, Japan</td>
			<td>034-22363</td>
			<td>0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td>
			<td></td>
			<td>5mM EDTA prepared with 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAriaTM II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Filter Unit</td>
			<td>Merck Millipore, Ireland</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>0.22&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon cell strainer</td>
			<td>FALCON, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>40&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>0.5% x10. diluted to x1 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Wako, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 &#956;g/ml streptomycin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes

Osteocyten, som en gång ansågs vara en passiv bosatt i benet med tanke på backstage-funktionen att känna av mekanisk belastning, kommer nu till rampljuset och har visat sig ha flera huvudfunktioner som att aktivt modifiera den extracellulära matrisen och bilda ett endokrint organ med lacunocanalicular systemet som omsluter det och skickar meddelanden till avlägsna platser. Tack vare de metoder som gjorde det möjligt att testa osteocyten in vitro från att isolera primära osteocyter till ostocytliknande cellinjer, upplever osteocyter nu ett rungande intresse och en ökning av kunskap om struktur och funktion. Många aspekter av osteocytbiologin och interaktionen med andra molekylära komponenter är ännu inte upptäckta. I detta protokoll beskriver vi i detalj den effektiva isoleringen av primära osteocyter från dmp1-topas neonatal muscalvaria, som uttrycker det gröna fluorescerande proteinet i osteocyter, genom cellfraktionering och därefter förvärvar kulturer av primära osteocyter genom FACS.

Syftet med detta protokoll är att demonstrera processen för att erhålla kulturer av primära osteocyter från dmp1-topas neonatal muscalvaria genom en fraktioneringsprocess med användning av kollagenas för att bryta ner kollagenmatrisen och EDTA för kalciumkelering, varefter celler förbereds för FACS för att separera osteocyter från andra cellpopulationer.
Metoder för att erhålla primära osteocyter från neonatal muscalvaria beskriver ofta användningen av fraktioner (1\u20128) f?...

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes at JoVE.com

Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

Detta protokoll beskriver dissektion av neonatal dmp1-topaz muscalvaria och isolering av osteocyter som uttrycker det gröna fluorescerande proteinet genom cellsmältning och fraktionering, förutom osteocytberedning för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS).

Erhållande av primära osteocyter genom murin kalvvarial fraktionering av GFP-uttryckande osteocyter

The osteocyte, once thought to be a passive resident of the bone given the backstage function of sensing mechanical loading, is now brought to the ...

Primary osteocyte isolation is a lengthy procedure that often leaves out in low cell areas. This protocol provides efficient methods for isolating high numbers of primary GFP-expressing osteocytes. This protocol reduces the handling time and allows a higher number of osteocytes to be obtained in a single procedure with minimal contamination from hematopoietic or mesenchymal cells.For the isolation of GFP-expressing osteocytes, place euthanized, postnatal day six to seven, transgenic mouse pups into a non-treated culture dish, and use scissors and tweezers to grasp the skin at the base of one's skull. Use the scissors to make an initial incision in the lifted skin, followed by cuts along both sides of the skull in front of the ears. Remove the skin to expose the calvaria and holding the head from the nasal bridge, cut the calvaria along the lamboid suture and along the edges of the parietal bones to the frontal part of the tissue.Separate the calvaria from the underlying brain tissue and place the bones concave side up in PBS. To obtain fraction one, pool up to five calvaria per 50-milliliter tube in five milliliters of freshly prepared two-milligram per milliliter collagenase, and incubate the tissues at 37 degrees Celsius and 300 revolutions per minute for 20 minutes. At the end of the incubation, discard the digest from fraction one and wash the calvaria with five milliliters of PBS.Replace the wash with five milliliters of five-millimolar EDTA supplemented with one milligram per milliliter of bovine serum albumin in PBS for 15 minutes at 37 degrees Celsius with shaking. At the end of the incubation, transfer the digest to a 50-milliliter conical tube and wash the calveria with five milliliters of PBS. Then transfer the wash solution to the digest.To obtain fraction two, place the digest for centrifugation and discard the supernatant. Re-suspend the pellet in eight milliliters of alpha minimum essential medium containing 10%fetal bovine serum, or FBS, and antibiotics, and seed the cells onto a 10-centimeter culture dish. Then place the fraction two cells into the cell culture incubator.After collecting and culturing fractions three and four as just demonstrated. Incubate the calveria in five milliliters of five-millimolar EDTA supplemented with one milligram per milliliter of bovine serum albumin in PBS for 15 minutes at 37 degrees Celsius with shaking. At the end of the incubation, collect and culture fraction five as demonstrated for fractions two, three, and four.Immediately after fractionation, collect the cells for sorting. Alternatively, collect the cells after 24 hours of culture by aspirating the medium and gently wash the cells two times with 10 milliliters of PBS per dish per wash. After the second wash, treat the cells with five milliliters of 0.5%tripsin EDTA in PBS per plate.After five minutes at 37 degrees Celsius, add five milliliters of complete alpha minimum essential medium to each plate and gently detach the cells with pipetting. To combine the cells in each fraction, filter the cell suspensions through a 40-micron cell strainer into a single 50-milliliter conical centrifuge tube. After washing the cells with 10 milliliters of PBS, add them to the tube.Filter the cells through a strainer and collect the cells by centrifugation. Once the cells are pelleted down, re-suspend the pellet in complete minimal essential medium to a one times 10 to the seventh cells per milliliter of medium concentration and filter the cells through a 35-micron nylon mesh capped tube. To test the efficiency of this method, fractions were separately sorted and cultured for 24 hours to determine the percentage and yield of osteocytes from each fraction.The density of the osteocytes in fractions two to five were higher than that observed for fraction one and decreased remarkably in fractions six, seven, and eight. Although the percentage of osteocytes obtained between all of the fractions is not statistically significant, the density of the osteocytes differs dramatically between fractions. Here the gating strategy for isolating GFP-positive osteocytes from their GFP-negative counterparts by fluorescence-activated cell sorting is shown.After sorting, osteocytes can be analyzed for the expression of osteocyte markers of interest. In this analysis, the osteocyte marker genes were expressed at higher levels in the isolated GFP-positive osteocytes compared to presort fraction two, which is known as a high osteoblast fraction. Here the morphology of a GFP-positive osteocyte retaining a stellate shape with dendrites extending from the cell body after 24 hours of culture on a plastic culture dish, post sort, can be observed.Pay attention when aspirating the digests as the calveria will be reduced to minute pellets. Remember to use a small tip aspirator to avoid cell loss. Osteocytes have been enigmatic because they are entombed in bone.This technique has paved the way to studying osteocyte molecular interactions and their control over osteoclasts and osteoblasts.

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Skaffa Ägg från Xenopus laevis Kvinnor

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Upprättande och fraktionering av Xenopus laevis Egg Utdrag

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Primär Kultur och Plasmid elektroporation av Murine organ Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Använda GELFREE 8100 Fraktionering System för Molekylär viktbaserad fraktionering med vätskefasen Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Transplantation av GFP-uttryckande blastomerer för Live avbildning av näthinnan och hjärnans utveckling hos chimära Zebrafish embryon

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

Tillämpning av retinsyra Skaffa osteocyter kulturer från Primary Mus Osteoblaster

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Hela cellen elektrofysiologi primära odlade murina Enterochromaffin celler

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

Generation av Murine Primary Colon Epitelial Monolayers från intestinala krypter

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Avslöja inflammatorisk artrit: Utforska funktioner hos synovialceller

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Författare Spotlight: Isolering och odling av primära synoviala makrofager och fibroblaster från murin artritvävnad  

Isolering och odling av primära synoviala makrofager och fibroblaster från murin artritvävnad

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...