Name: obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes
Uploaded: 2020-06-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes at JoVE.com

Bu çalışma kısmen, Japonya Bilimi Geliştirme Derneği'nden bir JSPS KAKENHI hibesi ile desteklenmiştir (No. 19K10397'den H.K.'ye ve No. 18K09862'den I.M.'ye).

Tüm hayvan prosedürleri ve hayvan bakımı, Tohoku Üniversitesi kural ve yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Yenidoğan dmp1-topaz fare calvaria'nın diseksiyonu
<ol><li>Bu protokol için, C57BL / 6-Tg (Dmp1-Topaz) 1Ikal / J farelerinin 6\u20127 günlük yavrularını kullanın. Fareleri% 5 izofluran inhalasyonu ile ötenazi yapın ve daha sonra yavruları% 70 etanol'e aktarın.</li>
	<li>Ötanazi yapılan yavruyu tedavi edilmemiş bir kültür kabına aktarın.</li...

<ol>
	<li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+and+death+of+bone+cells:+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis.">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells.">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+Transduction+in+Osteocytes.">Mechanosensation and Transduction in Osteocytes.</a> BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).</li><li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism.">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li><li>Lane, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid-Treated+Mice+Have+Localized+Changes+in+Trabecular+Bone+Material+Properties+and+Osteocyte+Lacunar+Size+That+Are+Not+Observed+in+Placebo-Treated+or+Estrogen-Deficient+Mice.">Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).</li><li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Osteocyte:+An+Endocrine+Cell+...+and+More.">The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li><li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+osteocytes.">Isolation and purification of osteocytes.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).</li><li>Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte-specific+monoclonal+antibody+MAb+OB7.3+is+directed+against+Phex+protein.">Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).</li><li>Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikk&#246;, K., V&#228;&#228;n&#228;nen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro.">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).</li><li>Kramer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte+Wnt/&#946;-Catenin+Signaling+Is+Required+for+Normal+Bone+Homeostasis.">Osteocyte Wnt/&#946;-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis.</a> Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).</li><li>Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+Osteocyte-like+Cell+Line,+MLO-Y4.">Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).</li><li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+osteoid+preosteocyte-like+cell+MLO-A5+that+spontaneously+mineralizes+in+culture.">Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).</li><li>Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+Osteocytes+in+Their+3D+Native+Matrix+Versus+2D+In+Vitro+Models.">Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).</li><li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo.">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li><li>Spatz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+Inhibitor+Sclerostin+Is+Up-regulated+by+Mechanical+Unloading+in+Osteocytes+in+Vitro.">The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).</li><li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+relevance+of+cancer+cell+lines.">The clinical relevance of cancer cell lines.</a> Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).</li><li>Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+tumor+characteristic+gene+expression+in+cell+lines+using+a+tissue+similarity+index+(TSI).">Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).</li><li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dentin+matrix+protein+1+expression+during+osteoblastic+differentiation,+generation+of+an+osteocyte+GFP-transgene.">Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene.</a> Bone. 35 (1), 74-82 (2004).</li><li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes.">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> Bone. 45 (4), 682-692 (2009).</li><li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+osteocyte+regulation+of+bone+homeostasis+through+RANKL+expression.">Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).</li><li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte+biology.">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology.</a> Bone. 54 (2), 296-306 (2013).</li><li>Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes.">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li><li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bone Research Protocols. , 55-66 (2012).</li><li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone.">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li></ol>

İlk izole osteosit, (OB7.3) veya PHEX'in kuş düşmanı varyantı kullanılarak izole edilen bir tavuk calvaria 7'dendi; Bununla birlikte, bu yöntem, uygulanabilir antikorların mevcudiyeti ile sınırlıdır, çünkü aynı zamanda türe özgü olan osteosit spesifik antikorların üretilmesi gerekir. Araştırmacılar, fare ve sıçan uzun kemiklerinden osteositler elde etmek için sıralı enzimatik işlemin farklı bir modifikasyonunu kullandılar; Bu kültürlerin bildirilen saflığı yak...

Osteositler, salgılanan matriks1'e gömülmüş osteoblastik progenitörlerden terminal olarak farklılaşmış hücrelerdir. Kemik hücresi popülasyonları arasında en bol ve en uzun yaşayan hücrelerdir. Lakunalar içinde bulunurlar ve kanalikül adı verilen kanallar boyunca uzanan dendritlerle karakteristik bir yıldız morfolojisine sahiptirler ve çevrelerindeki çevre ve kemik yüzeyi2 ile geniş bir iletişim ve metabolik değişim ağı oluştururlar. Osteositler hem osteoblastların hem de osteoklastların kemik yeniden şekillenmesindeki rollerini koreografi yaparlar, mekanik yükleme3'e adaptasyon sağlayan birincil mekanosensoriyel hücrelerdir, fosfat homeostazı4 ve kemik matriks mineralizasyonundarol alırlar 5 ve lakunokanaliküler sistemle birlikte uzak dokuları işaret eden endokrin bir organ görevi görürler6.
Osteositler, erişilebilirliği sınırlayan ve izolasyonlarını zorlaştıran, böylece in vitro araştırmayı engelleyen mineralize bir matris içinde yer almaktadır. İlk izolasyon yöntemlerinden biri, daha sonra PHEX'in kuş varyantı olarak bilinen osteosit spesifik bir monoklonal antikor (OB7.3)7 kullanarak tavuk kalvarisinden izole osteositleri tanımlamıştır (X kromozomundaki Endopeptidazlara homoloji ile PHosfat düzenleyici gen)8. Diğer araştırmacılar, osteosit saflığının yaklaşık% 70 olduğu bildirilen osteosit bakımından zengin fraksiyonlar elde etmek için sıçan9 veya fare10 uzun kemiklerinin sıralı sindirimini kullandılar9. Bu prosedürün sınırlamaları, osteositlerin yanı sıra diğer hücre tipleriyle kontamine olmuş kültürlerin optimal olmayan saflığını ve osteositlerin bölünme yeteneğini kaybettiği için osteositlerin kültürdeki diğer hücreler tarafından potansiyel olarak büyüyebileceğini içerir. Bu zorluklar uzun vadeli kültürlerin kullanılabilirliğini kısıtlamaktadır.
Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için farklı osteosit hücre hatları geliştirilmiştir. MLO-Y4 hücre hattı11 ve MLO-A5 hücre hattı12, özellikle erken evre osteositlerin incelenmesi için yararlı olan en yaygın olarak çalışılan hücre hatlarıdır; Bununla birlikte, her ikisi de olgun osteosit belirteçleri olan düşük sklerostin ve FGF2313 seviyelerini ifade ettikleri için olgun osteosit sinyallemesini incelemek için daha az faydalıdırlar. IDG-SW314 ve Ocy45415 dahil olmak üzere diğer hücre hatları, yüksek seviyelerde sklerostin ve FGF23 eksprese eder ve geç osteosit evresinin incelenmesinde yararlıdır. Hücre hatlarının yararlı araştırma araçları olduğu kanıtlanmıştır; Bununla birlikte, birincil hücrenin biyolojisini tam olarak temsil etmedikleri için sınırlama olmaksızın gelmezler. Farklı hücre hatları, osteosit olgunluk spektrumunun farklı gelişim aşamalarını temsil eder ve hücre hatları, primer osteositlerin heterojenliğini temsil edemez16,17.
Primer osteositlerin saf kültürlerini elde etmek için araştırmacılar, osteositlerde yeşil floresan protein (GFP) ekspresyonunu yönlendirmek için 8-kb dmp1 promotörünün kullanıldığı cre fare modelinden yararlandılar18,19. Paic ve ark.19 tarafından çift transgenik fareler (pOB-Col 2.3- GFP-camgöbeği ve DMP1-GFP-topaz) ve Nakashima ve ark.20 tarafından dmp1-topaz transgenik fareler osteosit popülasyonları elde etmek için kullanılmıştır. Primer osteositlerin kültürlerini elde etmek için GFP'yi ifade eden osteositlerin sıralı sindirim ve FACS'sini kullandılar19,20. TdDomates proteinini aktive eden 10 kb dmp1 muhabir fare Ai9'daki cre yönünün, osteositlerde, osteoblastlarda, kaslarda ve kemik iliğindeki hücrelerde mevcut olduğu gösterilmiştir. 8-kb dmp1 promotörü aynı ekspresyon modeline sahipti, ancak osteoblastların ve kemik iliği hücrelerinin sadece bir kısmı proteini ifade etti, bu da 8-kb dmp1 promotörünün daha spesifik21 olduğunu gösteriyor. Buna rağmen, 8-kb dmp1 promotörü kullanılarak elde edilen sonuçlar dikkatle yorumlanmalı ve elde edilen popülasyonun yeterince yüksek saflıkta olmasını sağlamak için osteosit ve osteoblasta özgü belirteçler kullanılarak gen ekspresyon profilleri rutin olarak gerçekleştirilmelidir.
Osteoklast belirteçleri OSCAR ve Dcstamp, hematopoetik tükenmemiş ve tükenmiş osteosit popülasyonlarında bulundu, bu bulgu yazarları 8-kb dmp1-topaz yenidoğan kalvarisinin fraksiyonasyonundan ve GFP ayıklamasından elde edilen sindirimlerin hematopoetik hücrelerle kontamine olduğu sonucuna götürdü. GFP-pozitif hematopoetik hücreler GFP-pozitif mezenkimal hücrelerden (osteositler)22 oldukça düşük GFP yoğunluğuna sahip olduklarından, GFP sıralama kapısının sıkılaştırılmasıyla hematopoetik hücrelerle kontaminasyon azaltılabilirdi.
Osteositleri in vitro olarak incelemek için kullanılan yöntemler, osteosit biyolojisi hakkındaki son zamanlardaki bilgi zenginliğine katkıda bulunmuştur. Bununla birlikte, osteosit izolasyonu, düşük hücre verimi ile emek yoğun ve uzun süren bir prosedür olmaya devam etmektedir. Kollajenaz ve EDTA kullanılarak sıklıkla fraksiyon 823'e kadar tarif edilen kemik sindirim yöntemi, osteosit canlılığının vergilendirildiği birkaç saat sürer. Araştırmacılar, hücre sıralaması 20 için fraksiyonlar (2\u20125) kullandıklarını bildirmişlerdir ve osteositlerle ilişkili genlerin osteoblastlarınkilere karşı ekspresyon profilinin, saf osteosit popülasyonlarının izole edilmesinin başarısını doğruladığını göstermiştir20. Bu makalede, fraksiyon elde etme sürecini (2\u20125) açıklayacağız ve her fraksiyondaki osteositlerin geri dönüşünü belirlemek için fraksiyon 1 ila 8 ile başlayan her fraksiyondan osteositlerin verimini karşılaştırıyoruz. Ayrıca, yenidoğan dmp1-topaz fare kalvarisinin diseksiyonunu ve kollajenaz ve etilendiamintetraasetik asit (EDTA) kullanılarak kalvaryal sindirimin yanı sıra FACS için hücrelerin hazırlanmasını da tanımladık.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Data aquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235</td>
			<td>12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 &#956;m nylon mesh.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Wako, Osaka, Japan</td>
			<td>034-22363</td>
			<td>0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td>
			<td></td>
			<td>5mM EDTA prepared with 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAriaTM II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Filter Unit</td>
			<td>Merck Millipore, Ireland</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>0.22&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon cell strainer</td>
			<td>FALCON, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>40&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>0.5% x10. diluted to x1 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Wako, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 &#956;g/ml streptomycin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes

Bir zamanlar mekanik yüklemeyi algılamanın sahne arkası işlevi göz önüne alındığında kemiğin pasif bir sakini olduğu düşünülen osteosit, şimdi spot ışığına çıkarılmıştır ve hücre dışı matrisi aktif olarak modifiye etmek ve uzak bölgelere mesaj gönderen lakunokanaliküler sistemle endokrin bir organ oluşturmak gibi birçok önemli fonksiyona sahip olduğu gösterilmiştir. Osteositi in vitro olarak primer osteositlerin izole edilmesinden osteosit benzeri hücre hatlarına kadar test etmeyi mümkün kılan yöntemler sayesinde, osteositler şimdi yankılanan bir ilgi ve yapı ve işlev hakkında bilgi artışı yaşamaktadır. Osteosit biyolojisinin birçok yönü ve diğer moleküler bileşenlerle etkileşimi henüz keşfedilmemiştir. Bu protokolde, osteositlerdeki yeşil floresan proteinini eksprese eden dmp1-topaz yenidoğan fare kalvarisinden primer osteositlerin hücre fraksiyonasyonu yoluyla ve daha sonra FACS ile primer osteosit kültürlerinin elde edilmesi yoluyla etkili izolasyonunu ayrıntılı olarak açıklayacağız.

Bu protokolün amacı, kalsiyum şelasyonu için kollajen matriksini ve EDTA'yı parçalamak için kollajenaz kullanan bir fraksiyonasyon işlemi yoluyla dmp1-topaz yenidoğan fare kalvarisinden primer osteosit kültürlerinin elde edilmesi sürecini göstermektir, bundan sonra hücreler FACS'ın osteositleri diğer hücre popülasyonlarından ayırması için hazırlanır.
Yenidoğan fare kalvarisinden primer osteositler elde etme yöntemleri genellikle23'ü sıralamak...

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes at JoVE.com

Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

Bu protokol, floresan aktive hücre sıralama (FACS) için osteosit hazırlığına ek olarak, yenidoğan dmp1-topaz fare kalvarisinin diseksiyonunu ve yeşil floresan proteinini hücre sindirimi ve fraksiyonasyonu yoluyla eksprese eden osteositlerin izolasyonunu açıklar.

GFP eksprese eden osteositlerin murin kalvarial fraksiyonasyonu yoluyla primer osteositlerin elde edilmesi

The osteocyte, once thought to be a passive resident of the bone given the backstage function of sensing mechanical loading, is now brought to the ...

Primary osteocyte isolation is a lengthy procedure that often leaves out in low cell areas. This protocol provides efficient methods for isolating high numbers of primary GFP-expressing osteocytes. This protocol reduces the handling time and allows a higher number of osteocytes to be obtained in a single procedure with minimal contamination from hematopoietic or mesenchymal cells.For the isolation of GFP-expressing osteocytes, place euthanized, postnatal day six to seven, transgenic mouse pups into a non-treated culture dish, and use scissors and tweezers to grasp the skin at the base of one's skull. Use the scissors to make an initial incision in the lifted skin, followed by cuts along both sides of the skull in front of the ears. Remove the skin to expose the calvaria and holding the head from the nasal bridge, cut the calvaria along the lamboid suture and along the edges of the parietal bones to the frontal part of the tissue.Separate the calvaria from the underlying brain tissue and place the bones concave side up in PBS. To obtain fraction one, pool up to five calvaria per 50-milliliter tube in five milliliters of freshly prepared two-milligram per milliliter collagenase, and incubate the tissues at 37 degrees Celsius and 300 revolutions per minute for 20 minutes. At the end of the incubation, discard the digest from fraction one and wash the calvaria with five milliliters of PBS.Replace the wash with five milliliters of five-millimolar EDTA supplemented with one milligram per milliliter of bovine serum albumin in PBS for 15 minutes at 37 degrees Celsius with shaking. At the end of the incubation, transfer the digest to a 50-milliliter conical tube and wash the calveria with five milliliters of PBS. Then transfer the wash solution to the digest.To obtain fraction two, place the digest for centrifugation and discard the supernatant. Re-suspend the pellet in eight milliliters of alpha minimum essential medium containing 10%fetal bovine serum, or FBS, and antibiotics, and seed the cells onto a 10-centimeter culture dish. Then place the fraction two cells into the cell culture incubator.After collecting and culturing fractions three and four as just demonstrated. Incubate the calveria in five milliliters of five-millimolar EDTA supplemented with one milligram per milliliter of bovine serum albumin in PBS for 15 minutes at 37 degrees Celsius with shaking. At the end of the incubation, collect and culture fraction five as demonstrated for fractions two, three, and four.Immediately after fractionation, collect the cells for sorting. Alternatively, collect the cells after 24 hours of culture by aspirating the medium and gently wash the cells two times with 10 milliliters of PBS per dish per wash. After the second wash, treat the cells with five milliliters of 0.5%tripsin EDTA in PBS per plate.After five minutes at 37 degrees Celsius, add five milliliters of complete alpha minimum essential medium to each plate and gently detach the cells with pipetting. To combine the cells in each fraction, filter the cell suspensions through a 40-micron cell strainer into a single 50-milliliter conical centrifuge tube. After washing the cells with 10 milliliters of PBS, add them to the tube.Filter the cells through a strainer and collect the cells by centrifugation. Once the cells are pelleted down, re-suspend the pellet in complete minimal essential medium to a one times 10 to the seventh cells per milliliter of medium concentration and filter the cells through a 35-micron nylon mesh capped tube. To test the efficiency of this method, fractions were separately sorted and cultured for 24 hours to determine the percentage and yield of osteocytes from each fraction.The density of the osteocytes in fractions two to five were higher than that observed for fraction one and decreased remarkably in fractions six, seven, and eight. Although the percentage of osteocytes obtained between all of the fractions is not statistically significant, the density of the osteocytes differs dramatically between fractions. Here the gating strategy for isolating GFP-positive osteocytes from their GFP-negative counterparts by fluorescence-activated cell sorting is shown.After sorting, osteocytes can be analyzed for the expression of osteocyte markers of interest. In this analysis, the osteocyte marker genes were expressed at higher levels in the isolated GFP-positive osteocytes compared to presort fraction two, which is known as a high osteoblast fraction. Here the morphology of a GFP-positive osteocyte retaining a stellate shape with dendrites extending from the cell body after 24 hours of culture on a plastic culture dish, post sort, can be observed.Pay attention when aspirating the digests as the calveria will be reduced to minute pellets. Remember to use a small tip aspirator to avoid cell loss. Osteocytes have been enigmatic because they are entombed in bone.This technique has paved the way to studying osteocyte molecular interactions and their control over osteoclasts and osteoblasts.

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Xenopus laevis Dişiler Yumurta Alınması

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Biyoloji

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Xenopus laevis Yumurta hazırlanması ve Fraksiyonu ayıklar.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Transplantasyon GFP of-Kimerik Zebra balığı Embriyolar Retina ve Beyin Gelişimi Canlı Görüntüleme blastomer ifade

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

İlköğretim Fare Osteoblastlar gelen osteositlere Kültürler Edinme Retinoik Asit Uygulama

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Tüm cep telefonu Elektrofizyoloji birincil kültürlü fare Enterochromaffin hücre

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

Bağırsak Mezarlarından Murine Primer Kolon Epitel Monolayerlerinin Üretimi

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

İnflamatuar Artritin Ortaya Çıkarılması: Sinovyal Hücrelerin İşlevlerini Keşfetmek

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Yazar Spotlight: Murin Artrit Dokusundan Primer Sinovyal Makrofajların ve Fibroblastların İzolasyonu ve Kültürü  

Murin Artrit Dokusundan Primer Sinovyal Makrofaj ve Fibroblastların İzolasyonu ve Kültürü

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...