Name: single myofiber isolation and culture from a murine model of emery-dreifuss muscular dystrophy in early post-natal development
Uploaded: 2020-07-01T15:00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development at JoVE.com

हम एंड्रिया बियांची, Laminopathies के इतालवी नेटवर्क और समर्थन और सभी रचनात्मक टिप्पणियों के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं । हम कंफोकल माइक्रोस्कोप में बहुमूल्य मदद के लिए चियारा कॉर्डिग्लियरी के आभारी हैं। लेखक आंकड़ों के लिए तस्वीरें लेने में उनकी मदद के लिए डॉ बीट्राइस बिफेराली का शुक्रिया अदा करते हैं । यहां प्रस्तुत काम मेरा पहला AIRC अनुदान एन द्वारा समर्थित था । 18535, एएफएम-टेलीथॉन एन 21030, इटली के स्वास्थ्य मंत्री एन जीआर-2013-02355413 और कैरिप्लो 2017-0649 से सी.एल.सी.एम. को मेरा पहला एआईआरसी अनुदान एन 18993 और एएफएम-टेलीथॉन एन 22489 द्वारा समर्थित है।

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	<li>Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+stem+cells+at+a+glance.">Muscle stem cells at a glance.</a> Journal of Cell Science. 127 (21), 4543-4548 (2014).</li><li>Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+satellite+cells+and+adult+myogenesis.">Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis.</a> Current Opinion in Cell Biology. 19 (6), 628-633 (2007).</li><li>Zammit, P. S., Partridge, T. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p38+MAPK+signaling+underlies+a+cell-autonomous+loss+of+stem+cell+self-renewal+in+aged+skeletal+muscle.">p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in aged skeletal muscle.</a> Nature Medicine. 20 (3), 265-271 (2014).</li><li>Bianchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+polycomb+transcriptional+repression+contributes+to+lamin+A/C-dependent+muscular+dystrophy.">Dysfunctional polycomb transcriptional repression contributes to lamin A/C-dependent muscular dystrophy.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 2408-2421 (2020).</li><li>Blau, H. M., Webster, C., Pavlath, G. 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कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं ।

बरकरार एकल myofibers के अलगाव मायोजेनेसिस के क्षेत्र में एक आवश्यक विधि है जब मुख्य उद्देश्य के लिए अपने आला के भीतर मांसपेशियों स्टेम कोशिकाओं की कोशिका स्वायत्त पुनर्योजी क्षमताओं की विशेषता है, स्वस्थ और रोग की स्थिति में । हालांकि, जब जैव रासायनिक या जीनोमिक अध्ययन रुचि के हैं, FACS-अलग उपग्रह कोशिकाओं सबसे अच्छा विकल्प हो सकता है ।
एकल माइफबर अलगाव पूर्व-वीवो का पालन करने की अनुमति देता है, लेकिन सबसे शारीरिक तरीके से, मांसपेशियों के उत्थान के दौरान सभी चरणों एकल उपग्रह कोशिकाओं की गतिशीलता से गुजरना पड़ता है, जो हैं: सक्रियण, कोशिका विभाजन (असममित और सममित), भेदभाव और आत्म-नवीकरण द्वारा क्विसेंस पर लौटें। एक बार myofibers अस्थाई परिस्थितियों में बड़े हो रहे हैं, एकल उपग्रह कोशिकाओं को सक्रिय और कोशिकाओं के एक समूह के गठन का विस्तार, सभी एक ही उपग्रह सेल से प्राप्त । प्रसार, भेदभाव, सक्रियण या स्टेमनेस मार्कर के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण तब कोशिका चरणों के बीच अनुपात को निर्धारित करने के लिए इष्टतम है।
हमारे प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम व्यवहार्य और बरकरार myofibers प्राप्त करने के लिए तेजी से लेकिन कोमल मांसपेशी विच्छेदन माना जा सकता है, कण्डरा से कण्डरा अलगाव द्वारा, किसी भी मांसपेशियों की क्षति से बचने के लिए । हमारी सलाह केवल तेज कैंची और छोटे तेज चिमटी का उपयोग करने के लिए और दस मिनट के लिए पूरी मांसपेशी विच्छेदन प्रक्रिया को सीमित करने के लिए है । जब बहुत छोटी मांसपेशियों (यानी, ईडीएल और टीए) को अलग करना मुश्किल होता है, तो उन्हें एक साथ काटना और बाद में फाइबर के बाद देशांतर योजना के साथ काटने वाली ठीक कैंची का उपयोग करके उन्हें विभाजित करना संभव है। यह रणनीति अंततः कम बरकरार myofibers दे देंगे, लेकिन व्यवहार्यता समझौता नहीं किया जाएगा । पाचन को सुविधाजनक बनाने के लिए गैस्ट्रोस्नेमियस जैसी बड़ी मांसपेशियों पर भी ऐसा ही किया जाना चाहिए। पाचन समय का अनुकूलन, जिसे अनुभवजन्य रूप से मान्य करने की आवश्यकता है, और अलग-अलग फाइबर का न्यूनतम हेरफेर भी बाद के विश्लेषण के सकारात्मक परिणाम के लिए दो महत्वपूर्ण पहलू हैं।
यहां रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल का लाभ यह है कि इसे बहुत छोटे चूहों (उम्र और आयाम में) पर लागू किया जा सकता है, भले ही उनकी मांसपेशियां बेहद नाजुक हों। यहां तक कि यदि ऊपर उल्लेख नहीं किया गया है, तो तहखाने झिल्ली-लेपित व्यंजन18,,19का उपयोग करके लंबी अवधि के लिए संस्कृति व्यवहार्य मायोफिबर के लिए विच्छेदन के इस प्रोटोकॉल का पालन करना संभव है। यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि यह स्थिति फ्लोटिंग स्थिति से पूरी तरह से अलग है, जहां आसंजन उत्तेजनाएं और निकटता उत्तेजनाएं अनुपस्थित हैं।

कंकाल की मांसपेशी एक विभेदित ऊतक है जिसमें व्यायाम या आघात के बाद पुनर्जीवित करने की सबसे विस्तारित क्षमता में से एकहै 1। यह विशेषता मुख्य रूप से स्टेम कोशिकाओं की उपस्थिति के कारण होती है, जिसे बेसल लैमिना और मायोफिबर 2 के प्लाज्मलेम्मा के बीच उनकी परिधीय स्थिति के कारण उपग्रह कोशिकाएं कहाजाताहै। प्रसव के बाद के विकास के दौरान, उपग्रह कोशिकाएं पैदा होती हैं और उत्तरोत्तर अंतर करती हैं, इस प्रकार कंकाल मांसपेशियों के विकास में योगदान देती हैं। एक बार वयस्कता में, उपग्रह कोशिकाएं एक प्रतिवर्ती शांत अवस्था में प्रवेश करती हैं, और शारीरिक या रोग आघात पर, वे क्षतिग्रस्त मांसपेशियों की मरम्मत के लिए सक्रिय, प्रसार और अंतर करते हैं3। इन विभिन्न पुनर्योजी चरणों के माध्यम से ठीक से पारगमन करने और आत्म-नवीकरण से गुजरने के लिए उपग्रह कोशिकाओं की क्षमता में दोषों को मांसपेशियों को बर्बाद करने से दृढ़ता से जोड़ा गया है, या तो शारीरिक उम्र4,,5, 6,6 या मांसपेशियों में अपक्षयी रोगों, जैसे मस्कुलर डिस्ट्रोप7,,8,,9,,10।
उपग्रह कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए दो मुख्य संस्कृति दृष्टिकोण मौजूद हैं पूर्व वीवो: मोनोन्यूक्लिटेड कोशिकाओं से प्राथमिक मायोजेनिक संस्कृतियां, यांत्रिक रूप से और रासायनिक रूप से पूरी मांसपेशी11,,12से अलग होती हैं; या अलग - थलग पड़े मायोफबर की संस्कृति13,14,15, 16,17,17,18,19,,20. पहले मामले में, उपग्रह कोशिकाओं के अलगाव की प्रक्रिया में माउस से निकाली गई पूरी मांसपेशियों का ट्रिट्यूशन, एक रासायनिक पाचन, निस्पंदन और फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छंटाई (FACS)21शामिल है। यह प्रक्रिया, हालांकि विभिन्न प्रकार के मॉडलों से उपग्रह कोशिकाओं को अलग-थलग करने में प्रभावी है, कई चरों पर जोर देती है जो उपग्रह कोशिकाओं को तनाव में बेनकाब करती हैं और उनके शारीरिक आला22,,23को बाधित करती हैं। इसके विपरीत, माइओफाइबर अलगाव में मैट्रिक्स अपमानजनक एंजाइमों के साथ मांसपेशियों के ऊतकों का एक जेंटलर पाचन और एक यांत्रिक श्रेडिंग शामिल है जो स्टेम सेल20के लिए कम आघात का कारण बनता है। यह दूसरा दृष्टिकोण व्यवहार्य उपग्रह कोशिकाओं की अधिक कुशल पुनर्प्राप्ति की अनुमति देता है, जो बेसल लैमिना और सारकोलेम्मा के बीच अपने माइफइबर से शारीरिक रूप से जुड़ा रहता है, इस प्रकार उनके शारीरिक आला19,,20के भीतर विश्लेषण की अनुमति देता है।
पिछले वर्षों के दौरान कंकाल की मांसपेशियों से एकल माइफबर को ठीक से और कुशलतापूर्वक अलग करने के लिए कई अलग-अलग प्रोटोकॉल प्रस्तावित किए गए हैं। पहले से ही 1 9 86 में बिस्चोफ ने फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस13 से फाइबर को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रस्ताव किया और बाद में, 1 99 5 में, रोसेनब्लैट एट अल ने मायोफबर14का अधिक कुशल अलगाव प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल को संशोधित किया। तब से, कई अन्य लेखकों ने अन्य मांसपेशियों पर समायोजित प्रक्रियाओं का प्रस्ताव किया, जैसे कि एक्सटेंसर डिजकोरम लोंगस (ईडीएल) और टिबिलिस पूर्वकाल (टीए) 15,,16,,17,,18,,19,,20,जो लंबे समय तक होते हैं, भले ही अधिक नाजुक, मांसपेशियां14। अलग myofibers तो आसंजन में दोनों की खेती की जा सकती है, उपग्रह कोशिकाओं के विस्तार के लिए अनुमति देने के लिए-व्युत्पन्न myoblasts, या अस्थाई परिस्थितियों में, ९६ घंटे तक, एकल उपग्रह कोशिकाओं से प्राप्त संतान का पालन करने के लिए19 (चित्रा 1)। संस्कृति माध्यम के भीतर सीरम की परिवर्तनीय सांद्रता का उपयोग उपग्रह कोशिकाओं के सक्रियण, प्रसार और/या भेदभाव को ट्रिगर करने के लिए किया जाता है, ताकि इन विभिन्न चरणों के माध्यम से ठीक से पारगमन करने की उनकी क्षमता का अध्ययन किया जा सके1।
हमने हाल ही में ईडीएमडी के माउस मॉडल में उपग्रह स्टेम सेल पूल की थकावट के पीछे एपिजेनेटिक तंत्र का वर्णन किया है, लैमिन 8-11-/-माउस7। चूंकि ये चूहे आमतौर पर24वर्ष की आयु के 4-8 सप्ताह के बीच मर जाते हैं, गंभीर मांसपेशियों की हानि के कारण, प्रसव के बाद की मांसपेशियों के विकास पर हमारे विश्लेषण को ध्यान केंद्रित करके रोग की शुरुआत में अंतर्निहित आणविक दोषों को पकड़ने का प्रयास किया गया था। फ्लोटिंग सिंगल माइफबर्स को जंगली प्रकार और लैमिन 8-11-/-उत्परिवर्ती 7 19 दिन पुराने चूहों से अलग और सुसंस्कृत किया गया था।7 इस स्तर पर, मांसपेशियों के दोष पहले से ही स्पष्ट हैं, लेकिन चूहे अभी भी व्यवहार्य हैं। हालांकि, चूंकि वयस्क चूहों की कंकाल मांसपेशियों के लिए एकल माइफबर्स निष्कर्षण के लिए उपरोक्त सभी उपर्युक्त प्रोटोकॉल अनुकूलित किए गए थे, इसलिए हमें उन्हें अपने उद्देश्यों के अनुकूल बनाने की आवश्यकता थी: उम्र और आकार की अवधि में बहुत छोटे चूहे, और बहुत नाजुक माइफबर। इस प्रकार, हम यहां रुडनिकी प्रयोगशाला19 द्वारा प्रस्तावित प्रोटोकॉल के हमारे पुनः अनुकूलन का वर्णन करते हैं ताकि प्रसव के बाद के विकास के दौरान चूहों से और गंभीर डिस्ट्रोफिक मांसपेशियों से एक महत्वपूर्ण संख्या प्राप्त की जा सके, जैसे कि लैमिन 8-11-/-चूहों 24से प्राप्त हुए । इस दृष्टिकोण का अंतिम लक्ष्य किसी भी अन्य माउस मॉडल में मायोफिबर से जुड़े मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं के अध्ययन के लिए एक मानकीकृत प्रक्रिया प्रदान करना है जब प्रसव के बाद के विकास के शुरुआती चरण रुचि के होते हैं, या माउस मॉडल के मामले में किसी विशिष्ट बीमारी को ले जाते हैं जो माइोफिबर्स को यांत्रिक तनाव के लिए अधिक संवेदनशील बनाता है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken embryo extract</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>CE650-DL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C0130-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit 488 antibody</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>R37118</td>
			<td>to be used 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoG antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>219998</td>
			<td>to be used 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 antibody</td>
			<td>Developmental studies 
			Hybridoma bank</td>
			<td></td>
			<td>to be used 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate saline buffer</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade mountant</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab equipment</td>
			<td>Manufacturer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond pen</td>
			<td>bio-optica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection pins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes (50 and 15 mL)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes (22cm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (1 mL and 200 &#181;L)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 and 35 mm diameter)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipettes (5 and 10 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber pipette bulbs</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo dissection microscope with transmission illumination</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture hood or lamina flow cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator (humidified, 37&#176;C, 5% CO2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath at 37&#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single myofiber isolation and culture from a murine model of emery-dreifuss muscular dystrophy in early post-natal development

ऑटोसोमल प्रमुख एमरी-ड्रेफस मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (ईडीएमडी) एलएमएनए जीन में म्यूटेशन के कारण होता है, जो परमाणु लिफाफे और न्यूक्लियोप्लैम के घटकों को बनाए रखने वाले ए-टाइप न्यूक्लियर लैमिन्स, इंटरमीडिएट फिलामेंट प्रोटीन को एन्कोड करता है । हमने हाल ही में बताया है कि ईडीएमडी में मांसपेशियों को बर्बाद करने के लिए आंतरिक एपीजेनेटिक डिस्फंक्शन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है जो मांसपेशियों (उपग्रह) स्टेम कोशिकाओं को पुनर्योजी क्षमता को प्रभावित करते हैं। अलगाव और एकल myofibers की संस्कृति सबसे शारीरिक पूर्व वीवो दृष्टिकोण में से एक है अपने आला के भीतर उपग्रह कोशिकाओं के व्यवहार की निगरानी के लिए, के रूप में वे फाइबर और sarcolemma आसपास बेसल लैमिना के बीच रहते हैं । इसलिए, यह विभिन्न प्रकार के मुरीन मॉडलों से उपग्रह कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य प्रयोगात्मक प्रतिमान का प्रतिनिधित्व करता है। यहां, हम प्रसव के बाद की हिंडलिब मांसपेशियों(टिबिलिस एंटेर, एक्सटेंसर डिजोरम लंगस, गैस्ट्रोस्नेमियस और सोलियस)से अक्षुण्ण और व्यवहार्य एकल माइफबरर्स को अलग करने के लिए एक पुनः अनुकूलित विधि का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल के बाद, हम जन्म के केवल 19 दिनों में Lamin 18-11-/-चूहों, एक गंभीर EDMD murine मॉडल से उपग्रह कोशिकाओं का अध्ययन करने में सक्षम थे ।
हम अलगाव प्रक्रिया का विस्तार करते हैं, साथ ही माइफिबर और उनके संबद्ध उपग्रह-कोशिकाओं-व्युत्पन्न संतान की एक अच्छी राशि प्राप्त करने के लिए संस्कृति की स्थिति का विस्तार करते हैं। जब विकास कारकों समृद्ध माध्यम में सुसंस्कृत, जंगली प्रकार चूहों से प्राप्त उपग्रह कोशिकाओं को सक्रिय, पैदा करना, और अंततः अंतर या आत्म नवीकरण से गुजरना । homozygous Lamin 18-11 में-/-उत्परिवर्ती चूहों इन क्षमताओं को गंभीर रूप से बिगड़ा हुआ है ।
यह तकनीक, यदि कड़ाई से पालन की जाती है, तो माइोफिबर से जुड़े उपग्रह कोशिका से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं का अध्ययन करने की अनुमति देती है, यहां तक कि प्रसव के बाद के विकास के चरणों में और नाजुक मांसपेशियों में भी।

हम आम तौर पर चार अलग-अलग मांसपेशियों (टीए, ईडीएल, सोलियस और गैस्ट्रोस्नेमियस)को पचाते हैं ताकि अच्छी मात्रा में लंबे और व्यवहार्य फाइबर प्राप्त किए जा सकें जो विकास-कारकों समृद्ध माध्यम(चित्रा 4ए, बी)में 96 घंटे जीवित रह सकते हैं। केवल सबसे बरकरार फाइबर संस्कृति माध्यम में स्थानांतरित किया जाना चाहिए, क्योंकि वे जीवित रहेंगे; अन्य सभी, जो भेदभाव और चयन करने में आसान हैं, उन्हें त्यागने की आवश्यकता है।
जब माइोफबर को विकास-कारकों में बनाए रखा जाता है, तो जंगली प्रकार के चूहों से प्राप्त समृद्ध मध्यम उपग्रह कोशिकाएं सक्रिय और पैदा होने लगती हैं, चित्र 1देखें। संस्कृति के ४८ एच पर, स्वस्थ हालत में(Lamin Τ8-11 +/+), उपग्रह कोशिकाओं MyoD upregulate और उनके पहले डिवीजन से गुजरना । सक्रिय Pax7 +/MyoD + उपग्रह कोशिकाओं तो पैदा होता है और संस्कृति में ७२ घंटे से, वे कोशिका myofiber से बंधे समुच्चय उत्पन्न, कि ९६ एच(चित्रा 5)पर और भी अधिक दिखाई दे रहे हैं । इन डिवीजनों के दौरान, उनमें से कुछ MyoD अभिव्यक्ति का दमन कर सकते हैं, स्टेम सेल पूल को फिर से आबाद करने के लिए आत्म नवीकरण के दौर से गुजर रहे हैं, जबकि जो MyoD को बनाए रखते हैं, वे पैक्स7 अभिव्यक्ति को कम करके भेदभाव के लिए प्रतिबद्ध हो जाते हैं। 96 घंटे के बाद, उपग्रह कोशिकाओं के समूहों में स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाली MyoG + प्रतिबद्ध कोशिकाएं होती हैं, जो नए मायोफिबर(चित्र 1 और चित्रा 6)में अंतर कर सकती हैं। विशेष रूप से, इस प्रयोग के साथ, हम अपने जंगली प्रकार के समकक्षों (+/+), चित्रा 6देखें की तुलना में होमोज़िगस उत्परिवर्ती Lamin 18-11 चूहों (-/-) में उपग्रह सेल भेदभाव की एक देरी गतिशीलता वर्णित है ।
प्रत्येक एक प्रयोग के अंतिम परिणाम हमें लगता है कि गंभीर मांसपेशी डिस्ट्रॉफी के इस मॉडल से एकल myofibers अलगाव और संस्कृति के लिए विकसित प्रोटोकॉल सभी आगे अनुप्रयोगों के लिए अच्छी गुणवत्ता myofibers सुनिश्चित करता है ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig01.jpg"> चित्रा 1: उपग्रह कोशिकाओं के पुनर्योजी चरणों का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व फ्लोटिंग मायोफिबर में मॉडलिंग करता है। विकास कारकों अमीर माध्यम में संस्कृति के ४८ एच पर, Pax7 + कोशिकाओं को सक्रिय हो और पहले डिवीजन से गुजरना, Pax7 + /MyoD + कोशिकाओं के एक डबल को जंम दे रही है । MyoD सकारात्मक कोशिकाओं तो पैदा करना और विस्तार, वृद्धि दे रही है, संस्कृति के ७२ घंटे में, कई कोशिकाओं के एक समूह है जो एक ही उपग्रह सेल की संतान हैं । संस्कृति Pax7+/MyoD + कोशिकाओं के ९६ एच पर Pax7-/MyoG + कोशिकाओं में अंतर हो जाते हैं । विस्तार चरण के दौरान, Pax7 +/MyoD + कोशिकाओं का एक सबसेट मायोड अभिव्यक्ति को आत्म-नवीकरण के दौर से गुजरते हुए क्विसेंस में डाउनरेगेट करता है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig02.jpg"> चित्रा 2: बोर पाश्चर पिपेट की तैयारी। (A)देशांतर और ललाट दृश्य कैसे बड़ा छेद बोर पिपेट दिखाई देना चाहिए । (ख)देशांतर और ललाट दृश्य कैसे छोटे छेद बोर पिपेट अंत में दिखाई देना चाहिए । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig03.jpg"> चित्र 3: एकल मांसपेशी विच्छेदन के प्रतिनिधि चित्र। (A)टीए मांसपेशी का अलगाव । मांसपेशियों को कवर करने वाली पतली परत को हटाने से बचना मायोफिबर्स को अंदर की रक्षा करता है। (ख)टीए और ईडीएल मांसपेशियों को एक साथ अलग अभी भी पटेला के स्तर पर उनके ऊपरी कण्डरा से जुड़ी हुई है । (ग)देशांतर धुरी के साथ उन्हें काटकर अलगाव के बाद टीए और ईडीएल का विभाजन । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig04.jpg"> चित्रा 4: स्वस्थ और व्यवहार्य myofibers के उदाहरण। निलंबन में व्यवहार्य myofibers के प्रतिनिधि चरण विपरीत छवियों। (क)लाल तीर दृश्यमान सारकोमेरे संगठन और उसके पक्ष में एक उपग्रह कोशिका के साथ एक मायोफाइबर इंगित करता है; नारंगी तीर टूटे हुए मायोफिबरर्स के कुछ टुकड़ों और संस्कृति के लिए अंतिम चयन से पहले पहली डिश में मौजूद कुछ मलबे का संकेत देते हैं। स्केल बार 100 माइक्रोन (ख)एक छोटे आवर्धन के तहत अन्य मायोफिबर का अधिक पूर्ण दृश्य। स्केल बार 500 माइक्रोन. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig04large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig05.jpg"> चित्रा 5: wt और उत्परिवर्ती चूहों में स्टेम सेल समूहों के आयाम में अंतर। संस्कृति के ९६ एच के बाद 19 दिनों से निकाले गए मायोफीबरर्स के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला 8-11 चूहों (+/+ और-/-) । Pax7+ उपग्रह कोशिकाओं को दिखाया गया है। अधिकांश मामलों में सेल क्लस्टर का आयाम कोशिकाओं की संख्या के मामले में लैमिन 8-11 +/+ की तुलना में लामिन 8-11 +/+ में काफी बड़ा था । स्केल बार 10 माइक्रोन करें इस <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig05large.jpg" target="_blank">आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig06.jpg"> चित्रा 6: प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोग। इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोग, संस्कृति के 96 एच के बाद, 19 दिनों से निकाले गए मायोफर्स पर, लैमिन 8-11 चूहों (+/+ और -/-) का प्रदर्शन किया गया। Pax7+/MyoG-(लाल) और Pax7-/MyoG + (ग्रीन) कोशिकाओं को देखा गया । कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त छवियां। स्केल बार 25 माइक्रोन करें इस <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig06large.jpg" target="_blank">आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>पाठ में समाधान का नाम</td>
			<td>घटक</td>
			<td>प्रतिशत</td>
			<td>अंतिम मात्रा/नमूना का सुझाव दिया</td>
			<td colspan="2">नोट्स</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">धुलाई का समाधान</td>
			<td>डीएमईएम उच्च ग्लूकोज</td>
			<td>90%</td>
			<td rowspan="2">4 एमएल</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">बाँझ रखें, उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें</td>
		</tr>
<tr>
<td>घोड़ा सीरम (एचएस)</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">पाचन समाधान</td>
			<td>डीएमईएम उच्च ग्लूकोज</td>
			<td>9.80%</td>
			<td rowspan="2">20 एमएल</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">बेहद हानिकारक पाउडर। 0.22μm फिल्टर के साथ समाधान फ़िल्टर करें और फिर बाँझ रखें। उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें</td>
		</tr>
<tr>
<td>कोलेजनस I</td>
			<td>0.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">संस्कृति माध्यम</td>
			<td>डीएमईएम उच्च ग्लूकोज</td>
			<td>78%</td>
			<td rowspan="4">10 एमएल</td>
			<td colspan="2" rowspan="4">बाँझ रखें, उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें</td>
		</tr>
<tr>
<td>भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)</td>
			<td>20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>चिकन भ्रूण निकालने (सीईई)</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी/एस)</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: धारा 1 में उपयोग किए जाने वाले समाधानों के लिए व्यंजनों।
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>पाठ में समाधान का नाम</td>
			<td>घटक</td>
			<td>प्रतिशत</td>
			<td>अंतिम मात्रा/नमूना का सुझाव दिया</td>
			<td colspan="2">नोट्स</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">4% पीएफए</td>
			<td>पैराफॉर्मल्डिहाइड (पीएफए)</td>
			<td>4%</td>
			<td rowspan="2">2-3 एमएल</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">पाउडर और फिर समाधान बेहद हानिकारक हैं</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>96%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">0.5% ट्राइटन एक्स-100</td>
			<td>ट्राइटन एक्स-100</td>
			<td>0.50%</td>
			<td rowspan="2">2-3 एमएल</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">ट्राइटन एक्स-100 बेहद चिपचिपा है, अधिमानतः इसे अलीकोट करने के लिए पिपेट की नोक को काटता है</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>99.50%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">0.25% ट्वीन-20</td>
			<td>ट्वीन-20</td>
			<td>0.25%</td>
			<td rowspan="2">10 एमएल</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">ट्वीन-20 बेहद चिपचिपा है, अधिमानतः इसे अलीकोट करने के लिए पिपेट की नोक को काटता है</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>99.75%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">0.1% ट्वीन-20</td>
			<td>ट्वीन-20</td>
			<td>0.10%</td>
			<td rowspan="2">10 एमएल</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">ट्वीन-20 बेहद चिपचिपा है, अधिमानतः इसे अलीकोट करने के लिए पिपेट की नोक को काटता है</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>99.90%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">समाधान अवरुद्ध करना</td>
			<td>भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)</td>
			<td>10%</td>
			<td rowspan="2">10 एमएल</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">ताजा समाधान तैयार करें और 3 सप्ताह से अधिक समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (हमेशा उपयोग से पहले स्पष्टता की जांच करें)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>90%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">दापी</td>
			<td>दापी</td>
			<td>0.10%</td>
			<td rowspan="2">2-3 एमएल</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">अंधेरे में रखें</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>99.90%</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 2: धारा 2 में उपयोग किए जाने वाले समाधानों के लिए व्यंजनों।

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Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

यहां, हम होमोज़िगस उत्परिवर्ती लेमिन ए8-11 माउस मॉडल से प्रसव के बाद के शुरुआती विकासात्मक चरणों में एकल मांसपेशियों के तंतुओं को कुशलतापूर्वक प्राप्त करने के लिए एक विधि का प्रस्ताव करते हैं, जो एमरी-ड्रेफस मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (ईडीएमडी) के लिए एक बहुत ही गंभीर मॉडल है।

एकल Myofiber अलगाव और संस्कृति एमरी के एक Murine मॉडल से-Dreifuss मस्कुलर डिस्ट्रॉफी जल्दी प्रसव के बाद विकास में

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

वयस्क चूहों की कंकाल मांसपेशियों से एकल माइोफिबर को अलग करने के लिए कई प्रोटोकॉल मौजूद हैं। हमारा प्रोटोकॉल बहुत युवा चूहों के लिए और छोटे चूहों के लिए एक बहुत ही नाजुक मायोफिबर के साथ तैयार किया गया है। इस मानकीकृत प्रक्रिया का उपयोग प्रसवोत्तर विकास के दौरान या रोगों के माउस मॉडल में माइोफिबर-असिस्टेड मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जो विशेष रूप से यांत्रिक तनाव के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं।इस प्रक्रिया का प्रदर्शन एक पीएचडी छात्र ग्लोरिया पेपोली और एक प्रयोगशाला से डॉक्टरेट के बाद फेडरिका लुसिनी द्वारा किया जाएगा । मांसपेशियों के विच्छेदन और फसल के लिए, एक पिन का उपयोग एक इच्छामृत्यु से एक हिंद अंग को ठीक करने के लिए, बहुत युवा या बहुत छोटे माउस से विच्छेदन बोर्ड पर, और टखने की ऊंचाई के लिए टिबिलिस पूर्ववर्ती के निचले कण्डरा को उठाने के लिए तेज चिमटी का उपयोग करें। टेंडन को काटें और मांसपेशियों के चारों ओर सभी तरह से पेटेला के स्तर पर टेंडन को काटने के लिए ठीक कैंची का उपयोग करें।मांसपेशियों को पाचन समाधान की एक ट्यूब में रखें और एक्सटेंसर डिजोरम लॉन्गस के निचले टेंडन को उठाएं, अन्य मांसपेशियों से एक्सटेंसर डिजोरम लॉन्गस को अलग करने के लिए टेंडन पर धीरे-धीरे ऊपर की ओर खींचें। मांसपेशियों को काटकर फसल करें। पीठ की मांसपेशियों को देखने के लिए पैर घुमाएं और दुखती कण्डरा उठाएं।एक गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी स्वचालित रूप से अन्य मांसपेशियों से अलग हो जाएगी। ऊपरी कण्डरा को पेटला के पीछे काट लें और मांसपेशियों को पाचन समाधान में रखें। पैर के बाहरी टेंडन को उठाएं और टेंडन के नीचे चिमटी को रोल करें ताकि कण्डरा को धीरे-धीरे मांसपेशियों से अलग किया जा सके।फिर, मांसपेशियों की कटाई के लिए काटें और उसी तरीके से दूसरे पैर से एक ही मांसपेशियों को इकट्ठा करें। जब सभी मांसपेशियों को एकत्र किया गया है, तो संग्रह ट्यूब को 45 से 50 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में रखें और हर 10 मिनट में 10 बार ट्यूब को सख्ती से उलट दें। जब मांसपेशियां ढीली होने लगती हैं और माइोफिबर दिखाई देने लगते हैं, तो पाचन निलंबन को ध्यान से पूर्व-गर्म या सीरम में स्थानांतरित करने से पहले नमूनों को हिलाएं 100 मिलीमीटर पेट्री डिश जिसमें 10 मिलीलीटर धोने का समाधान होता है।एकल माइफिबर को अलग करने के लिए, डिश को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और व्यक्तिगत मांसपेशियों के तंतुओं को अलग करने के लिए 200-माइक्रोलीटर पिपेट टिप को लेपित घोड़े सीरम का उपयोग करें। व्यवहार्य मायोफिबर को घोड़े सीरम में स्थानांतरित करें 35 मिलीमीटर पेट्री डिश जिसमें पूर्व-गर्म धोने के समाधान के पांच मिलीलीटर होते हैं। जब सभी व्यवहार्य मायोफिबर एकत्र किए गए हैं, तो सेल कल्चर इनक्यूबेटर में माइफइबर नमूनों को पांच मिनट तक बराबर कर दें ।यदि अधिक माइफबर की आवश्यकता है, तो शेष मांसपेशियों के ऊतकों के नमूने को त्रिकोणीय बनाने के लिए एक बड़े बोर ग्लास पिपेट का उपयोग करें जब तक कि अतिरिक्त फाइबर यांत्रिक रूप से जारी न हो जाएं। जब पर्याप्त myofibers एकत्र किया गया है, एक अतिरिक्त संतुलन अवधि के लिए एक घंटे के लिए सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में पकवान जगह है । इनक्यूबेशन के अंत में, उपयुक्त संस्कृति माध्यम युक्त एक नए, पूर्व गर्म घोड़े सीरम लेपित पकवान के लिए व्यक्तिगत myofibers हस्तांतरण और सेल संस्कृति इनक्यूबेटर के लिए थाली वापस ।मायोफिबर्स के इम्यूनोफ्लोर्सेंट विश्लेषण के लिए, क्रॉस लिंकिंग के बाद, किसी भी फाइबर को हटाने और कोमल आंदोलन के साथ पांच मिनट की इनक्यूबेशन के लिए पीबीएस में 0.5% ट्राइटन एक्स-100 के एक ही ट्यूब एक मिलीलीटर को जोड़ने के लिए नहीं, सभी लेकिन पर्याप्त सुपरनेट को हटा दें। इनक्यूबेशन के अंत में, फाइबर को पीबीएस के १.५ मिलीलीटर के साथ सुपरनैट की जगह लेने से पहले पांच मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें । कोमल आंदोलन के पांच मिनट के बाद, फाइबर को अवरुद्ध समाधान के एक मिलीलीटर के साथ सुपरनैटर की जगह लेने से पहले एक और पांच मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें।एक घंटे के कोमल आंदोलन के बाद, अवरुद्ध समाधान को ताजा अवरुद्ध समाधान के साथ प्रतिस्थापित करें जिसमें रात भर के लिए ब्याज की प्राथमिक एंटीबॉडी शामिल है, जो कोमल आंदोलन के साथ चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन है। अगली सुबह, पीबीएस में ताजा ०.२५% ट्वीन 20 के एक मिलीलीटर में तीन पांच मिनट की धोता के साथ फाइबर धोएं कोमल आंदोलन का उपयोग करके और धोने के लिए कमरे के तापमान पर तलछट के पांच मिनट । अंतिम धोने के बाद, उपयुक्त फ्लोरोक्रोम के साथ फाइबर लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए समाधान अवरुद्ध करने में पतला, प्रकाश से संरक्षित, PBS प्लस ०.१% Tween में तीन वॉश के बाद, प्रकाश से संरक्षित, के रूप में प्रदर्शन किया ।अंतिम धोने के बाद, कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर पांच मिनट के इनक्यूबेशन के लिए DAPI समाधान के एक मिलीलीटर के साथ सुपरनैटर को बदलें, प्रकाश से संरक्षित। इनक्यूबेशन के अंत में, फाइबर को धोएं और फाइबर इकट्ठा करने के लिए एक कट टिप के साथ एक अवरुद्ध समाधान लेपित पिपेट का उपयोग करें और ध्यान से एक ग्लास स्लाइड पर फाइबर फैलाएं। स्लाइड को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें, और दर्पण द्वारा परिलक्षित केवल प्राकृतिक प्रकाश का उपयोग करके, फाइबर को धीरे से फैलाने और अतिरिक्त समाधान को हटाने के लिए एक नए 200 माइक्रोलीटर पिपेट टिप का उपयोग करें।अतिरिक्त समाधान को हटाने के बाद, स्लाइड को 10 से 15 मिनट तक अंधेरे में सूखने दें जब तक कि समाधान की केवल एक बहुत छोटी मात्रा बनी न रह जाए। फिर, ऊतकों पर ध्यान से कवर स्लिप रखने से पहले फाइबर पर बढ़ते माध्यम की एक उपयुक्त मात्रा जोड़ें। विकास कारक समृद्ध माध्यम में 96 घंटे जीवित रह सकने वाले लंबे, व्यवहार्य फाइबर की पर्याप्त संख्या को पुनः प्राप्त करने के लिए, चार अलग-अलग मांसपेशियों को आम तौर पर काटा और पचाया जाता है।केवल सबसे अक्षुण्ण फाइबर संस्कृति माध्यम में स्थानांतरित किया जाना चाहिए। टूटे हुए फाइबर और अन्य मलबे को छोड़ दिया जाना चाहिए। संस्कृति के 72 घंटे के बाद, सक्रिय उपग्रह कोशिकाएं कोशिका को माइफाइबर से बाध्य करती हैं।हम देखते हैं कि सेल संस्कृति लामिन डेल्टा से प्राप्त आठ 11 डबल नकारात्मक चूहों कोशिकाओं की एक छोटी संख्या द्वारा बनाई जाती हैं। 96 घंटों के बाद, उपग्रह कोशिकाएं मायओजी को व्यक्त कर रही हैं, सेल क्लस्टर के भीतर दिखाई दे रही हैं, नए मायोफिबर की ओर भेदभाव शुरू कर रही हैं। विशेष रूप से, उपग्रह कोशिका भेदभाव की देरी गतिशीलता उनके जंगली प्रकार के समकक्षों की तुलना में होमोज़िगस उत्परिवर्ती लेमिन नॉकआउट चूहों में देखी जाती है।प्रयोग की सफलता के लिए एक त्वरित और सटीक मांसपेशियों की फसल के रूप में मांसपेशियों के विच्छेदन चरणों का अभ्यास करना सुनिश्चित करें। यह तकनीक सक्रियण और भेदभाव के दौरान एकल उपग्रह कोशिकाओं की ट्रैकिंग की अनुमति देती है, जिससे विभिन्न शारीरिक और रोग स्थितियों के तहत मांसपेशियों की वृद्धि और पुनर्जनन में अंतर्निहित प्रमुख प्रक्रियाओं के अध्ययन को सुविधाजनक बनाया जा सके।

Research

JoVE Journal

Medicine

Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation

Obliterative bronchiolitis के विकास Orthotopic फेफड़े प्रत्यारोपण के एक murine मॉडल में

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

पेशी Dystrophy रोगियों से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल की पीढ़ी: मूत्र ली गई कोशिकाओं के कुशल एकीकरण मुक्त Reprogramming

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

एक माउस कर्क मॉडल से परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं के अलगाव और प्रचार

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

मल्टी एक्सॉन कुत्ते एक्स से जुड़े पेशी Dystrophy में कॉकटेल antisense oligonucleotides का प्रयोग लंघन

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

अलगाव और कुत्ते धमनियों और नसों से प्राथमिक endothelial कोशिकाओं की संस्कृति

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

ब्याह द्वारा प्रेरित एक्सॉन शामिल करने का मूल्यांकन स्विचिंग Antisense Oligonucleotides में SMA रोगी Fibroblasts

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide ...

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

आंत्र स्टेम सेल अलगाव और संस्कृति के एक सुअर का मॉडल में फॉल्ट छोटे आंत्र Ischemia

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

Measurements of Motor Function and Other Clinical Outcome Parameters in Ambulant Children with Duchenne Muscular Dystrophy

Duchenne पेशी Dystrophy के साथ Ambulant बच्चों में मोटर समारोह और अन्य नैदानिक परिणाम मापदंडों की माप

While the number of new treatment options tested in patients with Duchenne muscular dystrophy (DMD) is increasing, there is still no defining of the most ...

Direct Drug Delivery to Kidney via the Renal Artery

गुर्दे की धमनी के माध्यम से गुर्दे के लिए सीधी दवा वितरण

There is a need for directed injections to enable increased and specific renal exposure for efficient evaluation of drug targets in the renal research ...

A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease.

प्रारंभिक चरण के इंटरवर्टेब्रल डिस्क रोग का अनुकरण करने के लिए एक प्रोइनफ्लेमेटरी, अपक्षयी अंग संस्कृति मॉडल।

Symptomatic intervertebral disc (IVD) degeneration (IDD) is a major socioeconomic burden and is characterized by inflammation and tissue degradation. Due ...