Name: single myofiber isolation and culture from a murine model of emery-dreifuss muscular dystrophy in early post-natal development
Uploaded: 2020-07-01T15:00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development at JoVE.com

Мы благодарим Андреа Бьянки, Итальянскую сеть ламинопатий и членов лаборатории за поддержку и все конструктивные комментарии. Мы благодарны Кьяре Кордиглиери за драгоценную помощь в конфокальном микроскопе. Авторы благодарят доктора Беатрис Биферали за помощь в съемке фигур. Работа, представленная здесь, была поддержана My First AIRC Grant n. 18535, AFM-Telethon n. 21030, итальянский министр здравоохранения n. GR-2013-02355413 и Cariplo 2017-0649 к C.L. C.M. поддерживается моим первым грантом AIRC No.18993 и AFM-Telethon n.

<ol>
	<li>Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+stem+cells+at+a+glance.">Muscle stem cells at a glance.</a> Journal of Cell Science. 127 (21), 4543-4548 (2014).</li><li>Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+satellite+cells+and+adult+myogenesis.">Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis.</a> Current Opinion in Cell Biology. 19 (6), 628-633 (2007).</li><li>Zammit, P. S., Partridge, T. A., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Skeletal+Muscle+Satellite+Cell:+The+Stem+Cell+That+Came+in+From+the+Cold.">The Skeletal Muscle Satellite Cell: The Stem Cell That Came in From the Cold.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 54 (11), 1177-1191 (2006).</li><li>Franco, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutagenesis+in+satellite+cells+associates+with+human+skeletal+muscle+aging.">Somatic mutagenesis in satellite cells associates with human skeletal muscle aging.</a> Nature Communications. 9 (1), 800 (2018).</li><li>Cosgrove, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rejuvenation+of+the+muscle+stem+cell+population+restores+strength+to+injured+aged+muscles.">Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles.</a> Nature Medicine. 20 (3), 255-264 (2014).</li><li>Bernet, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p38+MAPK+signaling+underlies+a+cell-autonomous+loss+of+stem+cell+self-renewal+in+aged+skeletal+muscle.">p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in aged skeletal muscle.</a> Nature Medicine. 20 (3), 265-271 (2014).</li><li>Bianchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+polycomb+transcriptional+repression+contributes+to+lamin+A/C-dependent+muscular+dystrophy.">Dysfunctional polycomb transcriptional repression contributes to lamin A/C-dependent muscular dystrophy.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 2408-2421 (2020).</li><li>Blau, H. M., Webster, C., Pavlath, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+myoblasts+identified+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Defective myoblasts identified in Duchenne muscular dystrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 80 (15), 4856-4860 (1983).</li><li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+deficiency+underlies+age-dependent+depletion+of+satellite+cells+in+muscular+dystrophy.">Notch signaling deficiency underlies age-dependent depletion of satellite cells in muscular dystrophy.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7 (8), 997-1004 (2014).</li><li>Vallejo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PITX2+Enhances+the+Regenerative+Potential+of+Dystrophic+Skeletal+Muscle+Stem+Cells.">PITX2 Enhances the Regenerative Potential of Dystrophic Skeletal Muscle Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1398-1411 (2018).</li><li>Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+Muscle+Satellite+Cells:+Background+and+Methods+for+Isolation+and+Analysis+in+a+Primary+Culture+System.">Skeletal Muscle Satellite Cells: Background and Methods for Isolation and Analysis in a Primary Culture System.</a> Methods in Molecular Biology. (798), 21-52 (2012).</li><li>Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+expansion+of+single+transplanted+muscle+stem+cells.">Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells.</a> Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).</li><li>Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+muscle+satellite+cells+on+intact+myofibers+in+culture.">Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture.</a> Developmental Biology. 115 (1), 129-139 (1986).</li><li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants.">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 31 (10), 773-779 (1995).</li><li>Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Skeletal+Muscle+Myofibers+as+a+Means+to+Analyze+Satellite+Cells.">Isolation and Culture of Skeletal Muscle Myofibers as a Means to Analyze Satellite Cells.</a> Methods in Molecular Biology. (290), 281-304 (2005).</li><li>Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Mizunoya, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Muscle-Fiber+Isolation+and+Culture+for+Cellular,+Molecular,+Pharmacological,+and+Evolutionary+Studies.">Single Muscle-Fiber Isolation and Culture for Cellular, Molecular, Pharmacological, and Evolutionary Studies.</a> Methods in Molecular Biology. 798, 85-102 (2012).</li><li>Verma, M., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Single+Muscle+Fiber+Isolation+from+Alcohol-Fixed+Adult+Muscle+following+&#946;-Galactosidase+Staining+for+Satellite+Cell+Detection.">Efficient Single Muscle Fiber Isolation from Alcohol-Fixed Adult Muscle following &#946;-Galactosidase Staining for Satellite Cell Detection.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 59 (1), 60-67 (2011).</li><li>Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Skeletal+Muscle+Myofibers+as+a+Means+to+Analyze+Satellite+Cells.">Isolation and Culture of Skeletal Muscle Myofibers as a Means to Analyze Satellite Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 946 (206), 431-468 (2013).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Individual+Myofibers+and+their+Satellite+Cells+from+Adult+Skeletal+Muscle.">Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).</li><li>Gallot, Y., Hindi, S., Mann, A., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture,+and+Staining+of+Single+Myofibers.">Isolation, Culture, and Staining of Single Myofibers.</a> Bio-Protocol. 6 (19), 1942 (2016).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Fixation+Redefines+Quiescence+and+Early+Activation+of+Skeletal+Muscle+Stem+Cells.">In Situ Fixation Redefines Quiescence and Early Activation of Skeletal Muscle Stem Cells.</a> Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).</li><li>Lucini, F., Bianchi, A., Lanzuolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-mediated+snapshot+of+nuclear+architecture.">Formaldehyde-mediated snapshot of nuclear architecture.</a> Methods in Molecular Biology. , (2020).</li><li>Sullivan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+a-Type+Lamin+Expression+Compromises+Nuclear+Envelope+Integrity+Leading+to+Muscular+Dystrophy.">Loss of a-Type Lamin Expression Compromises Nuclear Envelope Integrity Leading to Muscular Dystrophy.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (5), 913-920 (1999).</li></ol>

Никаких конкурирующих интересов.

Изоляция нетронутых одиночных миофиберов является важным методом в области миогенеза, когда основной целью является характеристика клеточно-автономных регенеративных возможностей мышечных стволовых клеток в их нише, в здоровых и патологических условиях. Однако, когда биохимические или геномные исследования представляют интерес, facS-изолированные спутниковые клетки могут быть лучшим вариантом.
Однократная изоляция миофиберов позволяет следовать за экс-виво, но самым физиологическим образом, динамика всех шагов одиночных спутниковых клеток проходит во время мышечной регенерации, то есть: активация, деление клеток (асимметричное и симметричное), дифференциация и возвращение к тишине путем самообновления. После того, как миофиберы выращиваются в плавучих условиях, одиночные спутниковые клетки активируются и расширяются, образуя скопление клеток, которые выходят из одной и той же спутниковой ячейки. Иммунофлуоресцентный анализ для распространения, дифференциации, активации или маркеров стволовой год является оптимальным для количественной оценки пропорции между клеточными стадиями.
Ключевым шагом в нашем протоколе для получения жизнеспособных и нетронутыми миофиберов можно считать быстрый, но нежный мышечной вскрытия, сухожилия к сухожилию изоляции, чтобы избежать каких-либо повреждений мышц. Наш совет – использовать только острые ножницы и небольшие острые пинцеты и ограничить всю процедуру вскрытия мышц десятью минутами. Когда трудно изолировать очень маленькие мышцы (т.е. EDL и TA), можно сократить их вместе, а затем разделить их с помощью тонких ножниц резки вдоль продольного плана после волокон. Эта стратегия в конечном итоге даст меньше нетронутыми myofibers, но жизнеспособность не будет скомпрометирована. То же самое должно быть выполнено на больших мышцах, как Gastrocnemius для облегчения пищеварения. Оптимизация времени пищеварения, которая должна быть эмпирически проверена, и минимальные манипуляции изолированных волокон также два важнейших аспекта для положительного результата последующего анализа.
Преимущество протокола, о которого сообщается здесь, заключается в том, что он может применяться на очень маленьких мышах (по возрасту и размеру), даже если их мышцы чрезвычайно хрупкие. Даже если не упоминается выше, можно следовать этому протоколу вскрытия, чтобы затем культура жизнеспособной миофиберов в течение более длительного периода использования подвала мембраны покрытием блюда18,19. Важно учитывать, что эта ситуация полностью отличается от плавающего состояния, где отсутствуют стимулы сцепления и стимулы близости.

Скелетная мышца является дифференцированной ткани с одним из наиболее расширенной способности к регенерации после физических упражнений или травмы1. Эта характеристика в основном из-за присутствия стволовых клеток, называемых спутниковых клеток из-за их периферического положения между базальной ламиной и плазмалемоймиофибера 2. Во время послеродового развития спутниковые клетки размножаются и постепенно дифференцируются, способствуя тем самым росту скелетных мышц. После того, как в зрелом возрасте, спутниковые клетки входят в обратимое состояние покоя, и при физиологической или патологической травмы, они активируются, размножаются и дифференцируются для того, чтобы восстановить поврежденные мышцы3. Дефекты в способности спутниковых клеток правильно транзита через эти различные регенеративные фазы и пройти самообновление были прочно связаны с мышечной тратой, либо во время физиологического старения4,,5,6 или в мышечных дегенеративных заболеваний, таких как мышечная дистрофия7,8,9,10.
Существуют два основных подхода к культуре для изучения спутниковых клеток ex-vivo: первичные миогенные культуры из мононуклеированных клеток, механически и химически отмежеваемые от целых мышц11,12; или культура изолированных миофиберов13,14,15,16,,17,18,19,20. В первом случае процесс изоляции спутниковых клеток включает в себя тритурацию целых мышц, извлеченных из мыши, химическое пищеварение, фильтрацию и флуоресцентную активированную сортировку клеток (FACS)21. Эта процедура, хотя и эффективна в изоляции спутниковых клеток от различных моделей, влечет за собой несколько переменных, которые подвергают спутниковые клетки стрессу и нарушает их физиологическую нишу22,23. В отличие от этого, миофибер изоляции включает в себя мягче переваривания мышечной ткани с матрицы деградации ферментов и механического измельчения, что приводит к снижению травмы стволовых клеток20. Этот второй подход позволяет гораздо более эффективное извлечение жизнеспособных спутниковых клеток, которые остаются физически привязаны к их миофибер между базальной ламиной и сарколеммой, тем самым позволяя анализ в их физиологической нише19,20.
Много различных протоколов были предложены в течение последних лет, чтобы правильно и эффективно изолировать один миофиберов от скелетных мышц. Уже в 1986 году Бишофф предложил протокол, чтобы изолировать волокна от Flexorum Brevis13, а затем, в 1995 году, Rosenblatt и др. изменили протокол, чтобы получить более эффективное разделение миофиберов14. С тех пор многие другие авторы предложили скорректированные процедуры на другие мышцы, такие как Extensor Digitorum Longus (EDL) и Tibialis Anterior (TA)15,16,17,18,19,20, которые длиннее, даже если более хрупкими, мышцы14.16 Изолированные миофиберы могут быть культивированы как в спайке, чтобы позволить расширение спутниковых клеток, полученных миобласты, или в плавучих условиях, до 96 часов, чтобы следовать потомству, полученному из одной спутниковой клетки19 (Рисунок 1). Переменные концентрации сыворотки в среде культуры используются для запуска активации, пролиферации и/или дифференциации спутниковых клеток для изучения их способности правильно проходить через эти различные фазы1.
Недавно мы описали эпигенетический механизм за истощение пула стволовых клеток спутника в мышиной модели EDMD, Ламин 8-11 -/- мышь7. Так как эти мыши обычно умирают в возрасте 4-8 недель в возрасте24, из-за тяжелой потери мышечной массы, была предпринята попытка захватить молекулярные дефекты, лежащие в основе раннего начала заболевания, сосредоточив наш анализ на послеродовое развитие мышц. Плавающие одиночные миофиберы были изолированы и культивирулись от дикого типа и Ламина No8-11 -/-мутантов 7 19 дней-старых мышей. На данном этапе, мышечные дефекты уже очевидны, но мыши по-прежнему жизнеспособны. Однако, поскольку все вышеперечисленные протоколы для самостоятельной извлечения миофиберов были оптимизированы для скелетных мышц взрослых мышей, нам нужно было адаптировать их к нашим целям: очень маленьким мышам по возрасту и размеру, и очень хрупким миофиберам. Таким образом, мы описываем здесь нашу переадаптацию протокола, предложенного лабораториейРудницкого 19 для получения значительного количества одинных жизнеспособных миофиберов от мышей во время послеродового развития и от тяжелых дистрофических мышц, таких как те, которые получены из Ламина 8-11 -/- мышей24. Конечная цель этого подхода заключается в предоставлении стандартизированной процедуры для изучения миофиберов связанных мышечных стволовых клеток в любой другой модели мыши, когда ранние стадии послеродового развития представляют интерес, или в случае мышиных моделей проведения каких-либо конкретных заболеваний, что делает миофиберы более восприимчивы к механическому стрессу.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken embryo extract</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>CE650-DL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C0130-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit 488 antibody</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>R37118</td>
			<td>to be used 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoG antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>219998</td>
			<td>to be used 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 antibody</td>
			<td>Developmental studies 
			Hybridoma bank</td>
			<td></td>
			<td>to be used 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate saline buffer</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade mountant</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab equipment</td>
			<td>Manufacturer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond pen</td>
			<td>bio-optica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection pins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes (50 and 15 mL)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes (22cm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (1 mL and 200 &#181;L)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 and 35 mm diameter)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipettes (5 and 10 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber pipette bulbs</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo dissection microscope with transmission illumination</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture hood or lamina flow cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator (humidified, 37&#176;C, 5% CO2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath at 37&#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single myofiber isolation and culture from a murine model of emery-dreifuss muscular dystrophy in early post-natal development

Аутосомно-доминирующая мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса (EDMD) вызвана мутациями в гене LMNA, который кодирует ядерные ламины типа А, промежуточные нити, которые поддерживают ядерную оболочку и компоненты нуклеоплазмы. Недавно мы сообщили, что мышечная трата в EDMD может быть приписана внутренней эпигенетической дисфункции, влияющие на мышцы (спутник) стволовых клеток регенеративной способности. Изоляция и культура одиночных миофиберов является одним из самых физиологических подходов экс-виво для мониторинга поведения спутниковых клеток в своей нише, так как они остаются между базальной ламиной, окружающей волокно, и сарколеммой. Таким образом, он представляет собой бесценную экспериментальную парадигму для изучения спутниковых клеток из различных моделей мурина. Здесь мы описываем повторно адаптированный метод, чтобы изолировать нетронутыми и жизнеспособные одиночные миофиберы из послеродовых мышц заднего мозга(Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius и Soleus). Следуя этому протоколу, мы смогли изучить спутниковые клетки из Ламина No8-11 -/- мышей, тяжелой модели EDMD murine, всего через 19 дней после рождения.
Мы подробно процедуры изоляции, а также культурные условия для получения хорошего количества миофиберов и связанных с ними спутниковых клеток полученных потомства. Когда культивируется в росте-факторов богатых средних, спутниковые клетки, полученные от диких мышей типа активировать, размножаться, и в конечном итоге дифференцировать или пройти самообновление. У гомозиготных ламинов No8-11 -/- мышей-мутантов эти возможности серьезно нарушены.
Этот метод, если строго соблюдаться, позволяет изучать все процессы, связанные с миофибером спутниковой клетки даже на ранних постродовых стадиях развития и в хрупких мышцах.

Мы обычно перевариваем четыре различных мышц (TA, EDL, Soleus и Gastrocnemius), чтобы получить хорошее количество длинных и жизнеспособных волокон, которые могли бы выжить 96 ч в росте факторов богатой средой (Рисунок 4A, B). Только самые нетронутые волокна должны быть переданы в среде культуры, так как они выживут; все остальные, которые легко различать и выбирать, должны быть отброшены.
Когда миофиберы поддерживаются в росте-факторы богатых средних спутниковых клеток, полученных из диких мышей типа начинают активировать и размножаться, см. рисунок 1. На 48 ч культуры, в здоровом состоянии (Ламин No 8-11 й / З), спутниковые клетки upregulate MyoD и пройти их первое деление. Активированные спутниковые клетки Pax7/MyoD затем размножаются и на 72 ч в культуре, они генерируют клеточные агрегаты, привязанные к миофиберу, которые еще более заметны при 96 ч(рисунок 5). Во время этих разделений, некоторые из них могут подавлять выражение MyoD, проходя самообновление, чтобы заселить пул стволовых клеток, в то время как те, которые поддерживают MyoD стать привержены дифференциации путем downregulating Pax7 выражения. После 96 ч, кластеры спутниковых клеток содержат четко видимые клетки MyoG, совершенные, которые могут дифференцироваться в новые миофиберы(рисунок 1 и рисунок 6). Примечательно, что с помощью этого эксперимента мы описали запоздалую динамику дифференциации спутниковых клеток в гомозиготных мутантах Ламина 8-11 мышей (-/-) по сравнению с их дикими аналогами типа (яп.) см. рисунок 6.
Окончательный результат каждого эксперимента позволяет нам думать, что протокол, разработанный для изоляции одного миофиберов и культуры из этой модели тяжелой мышечной дистрофии обеспечивает хорошее качество миофиберов для всех дальнейших применений.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig01.jpg"> Рисунок 1: Графическое представление регенеративных фаз спутниковых клеток, смоделированных в плавающих миофиберах. На 48 ч культуры в росте-факторов богатых средних, Pax7 "клетки активируются и проходят первое деление, что приводит к дублету Pax7"/MyoD" клеток. МиОД положительные клетки затем размножаются и расширяются, что приводит, в 72 ч культуры, к скоплению из нескольких клеток, которые являются потомством одной спутниковой клетки. На 96 ч культуры клетки Pax7/MyoD' становятся дифференцирующими клетками Pax7-/MyoG. Во время фазы расширения подмножество клеток Pax7/MyoD, сводит на нет выражение MyoD, перестраховывая самообновление, в quiescence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig02.jpg"> Рисунок 2: Подготовка родила Пастер пипетки. () Продольноеи фронтальное представление о том, как большая дыра родила пипетки должны появиться. (B) Продольное и фронтальное представление о том, как небольшое отверстие родила пипетки должны, наконец, появиться. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig03.jpg"> Рисунок 3: Представитель фотографии одного мышечного вскрытия. (A) Изоляция мышцы TA. Как избежать удаления тонкого слоя, покрывающего мышцы защищает миофиберов внутри. (B) TA и EDL мышцы изолированы вместе по-прежнему прилагается к их верхней сухожилия на уровне коленной чашечки. (C) Отдел TA и EDL после изоляции путем резки их вдоль продольной оси. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig04.jpg"> Рисунок 4: Примеры здоровых и жизнеспособных миофиберов. Представитель фазы контраст изображения жизнеспособных миофиберов в подвеске. (A) Красная стрелка указывает на миофибер с видимой саркомерной организацией и спутниковой ячейкой на боку; оранжевые стрелки указывают на некоторые кусочки сломанных миофиберов, а некоторые обломки присутствуют в первом блюде перед окончательным отбором для культуры. Масштаб бар 100 мкм . (B) Более полное представление других миофиберов под меньшим увеличением. Масштабная панель 500 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig05.jpg"> Рисунок 5: Разница в измерении кластеров стволовых клеток у wt и мутантных мышей. Иммунофлуоресцентное окрашивание миофиберов, извлеченных из 19 дней Ламина 8-11 мышей (я/з) и -/-) после 96 ч культуры. Показаны спутниковые ячейки Pax7. Размер клеточного кластера в большинстве случаев был значительно больше в Ламине No8-11, чем в Ламине 8-11 -/- с точки зрения количества клеток. Масштабная панель 10 м. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61516/61516fig06.jpg"> Рисунок 6: Представитель иммунофлуоресценции эксперимента. Эксперимент иммунофлуоресценции выполнен, после 96 ч культуры, на миофиберах, извлеченных из 19 дней Ламина 8-11 мышей (я/з) и -/-). Наблюдались клетки Pax7/MyoG- (красный) и Pax7-/MyoG (зеленый) клетки. Изображения, полученные с помощью конфокального микроскопа. Масштаб бар 25 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61516/61516fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Название решения в тексте</td>
			<td>Компонент</td>
			<td>Процент</td>
			<td>предложенный окончательный объем/образец</td>
			<td colspan="2">Заметки</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">стиральное решение</td>
			<td>DMEM с высоким содержанием глюкозы</td>
			<td>90%</td>
			<td rowspan="2">4 мл</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Держите стерильным, держите на уровне 4 градусов до использования</td>
		</tr>
<tr>
<td>Лошадиная сыворотка (HS)</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">решение пищеварения</td>
			<td>DMEM с высоким содержанием глюкозы</td>
			<td>9.80%</td>
			<td rowspan="2">20 мл</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Чрезвычайно вредный порошок. Фильтр решение с 0,22 мкм фильтр, а затем сохранить стерильным. Держите на уровне 4 градусов до использования</td>
		</tr>
<tr>
<td>Коллагеназа I</td>
			<td>0.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">культурная среда</td>
			<td>DMEM с высоким содержанием глюкозы</td>
			<td>78%</td>
			<td rowspan="4">10 мл</td>
			<td colspan="2" rowspan="4">Держите стерильным, держите на уровне 4 градусов до использования</td>
		</tr>
<tr>
<td>Сыворотка плода из крупного рогатого скота (FBS)</td>
			<td>20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Экстракт куриного эмбриона (CEE)</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Пенициллин-стрептомицин (P/S)</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Рецепты решений, используемых в разделе 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Название решения в тексте</td>
			<td>Компонент</td>
			<td>Процент</td>
			<td>предложенный окончательный объем/образец</td>
			<td colspan="2">Заметки</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">4% PFA</td>
			<td>Параформальдегид (PFA)</td>
			<td>4%</td>
			<td rowspan="2">2-3 мл</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Порошок, а затем раствор чрезвычайно вредны</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>96%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">0,5% Тритон X-100</td>
			<td>Тритон X-100</td>
			<td>0.50%</td>
			<td rowspan="2">2-3 мл</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Triton X-100 очень вязкий, преимущественно вырезать кончик пипетки, чтобы aliquot его</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>99.50%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">0,25% Tween-20</td>
			<td>Твин-20</td>
			<td>0.25%</td>
			<td rowspan="2">10 мл</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Tween-20 является чрезвычайно вязким, предпочтительно сократить кончик пипетки, чтобы aliquot его</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>99.75%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">0,1% Tween-20</td>
			<td>Твин-20</td>
			<td>0.10%</td>
			<td rowspan="2">10 мл</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Tween-20 является чрезвычайно вязким, предпочтительно сократить кончик пипетки, чтобы aliquot его</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>99.90%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">блокирующее решение</td>
			<td>Сыворотка плода из крупного рогатого скота (FBS)</td>
			<td>10%</td>
			<td rowspan="2">10 мл</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Подготовка свежего раствора и хранить при 4'C не более 3 недель (всегда проверяйте ясность перед использованием)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>90%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">ДАПИ</td>
			<td>ДАПИ</td>
			<td>0.10%</td>
			<td rowspan="2">2-3 мл</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Держите в темноте</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pbs</td>
			<td>99.90%</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 2: Рецепты решений, используемых в разделе 2.

Watch this Scientific Journal Video about Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development at JoVE.com

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Здесь мы предлагаем метод для эффективного получения одно мышечных волокон на ранних послеродовых стадиях развития от гомозиготной мутант Ламина 8-11 мыши модели, очень тяжелой модели для Эмери-Дрейфусс мышечной дистрофии (EDMD).

Одноместный Myofiber изоляции и культуры от Мюрин Модель Эмери-Дрейфус мышечной дистрофии в начале послеродового развития

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Существует много протоколов для изоляции одиночных миофиберов от скелетных мышц взрослых мышей. Наш протокол разработан для очень молодых мышей и для маленьких мышей с очень хрупкими миофиберами. Эта стандартизированная процедура может быть использована для изучения миофибер-помощь мышечных стволовых клеток во время послеродового развития или в мышиных моделях заболеваний, которые делают миофиберы особенно восприимчивы к механическому стрессу.Процедура будет продемонстрирована Глория Пеголи, аспирант, и Федерика Lucini, после докторской степени, как из лаборатории. Для вскрытия мышц и сбора урожая, используйте булавку, чтобы исправить одну заднюю конечность от усыпленной, очень молодой или очень маленькой мыши на вскрытии борту, и использовать острые пинцеты, чтобы поднять нижнее сухожилие голени передней до высоты лодыжки. Вырезать сухожилие и использовать тонкие ножницы, чтобы сократить все пути вокруг мышцы до сухожилия на уровне коленной чашечки.Поместите мышцу в трубку раствора пищеварения и поднимите нижнее сухожилие дитенсорного дигорума longus, осторожно потянув вверх по сухожилию, чтобы отделить дитенсор digitorum longus от других мышц. Вырезать и урожай мышц. Поверните ногу, чтобы посмотреть мышцы спины и поднимите ахиллово сухожилие.Мышцы гастрокнемиуса автоматически отделяются от других мышц. Вырезать верхнее сухожилие в задней части коленной чашечки и поместить мышцы в раствор пищеварения. Поднимите внешнее сухожилие ноги и сверните пинцет под сухожилие, чтобы аккуратно отделить сухожилие от мышцы.Затем, вырезать для сбора мышц и собирать те же мышцы от другой ноги таким же образом. Когда все мышцы были собраны, поместите трубку сбора в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 45 до 50 минут и энергично инвертировать трубку 10 раз каждые 10 минут. Когда мышцы начинают ослабевать и миофиберы становятся видимыми, встряхните образцы в последний раз, прежде чем тщательно переносить подвеску пищеварения в предварительно разогретую или сыворотку с покрытием 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую 10 миллилитров стирального раствора.Чтобы изолировать одиночные миофиберы, поместите блюдо под рассеченный микроскоп и используйте конную сыворотку, покрытую 200-микролитровым наконечником пипетки, чтобы разобрать отдельные мышечные волокна. Перенесите жизнеспособные миофиберы в конную сыворотку с покрытием 35-миллиметровой чашки Петри, содержащей пять миллилитров предварительно разогретого раствора для мытья. Когда все жизнеспособные миофиберы были собраны, уравночные образцы миофибера в инкубаторе клеточной культуры в течение пяти минут.Если требуется больше миофиберов, используйте большую стеклянную пипетку, чтобы тритурировать оставшийся образец мышечной ткани до тех пор, пока не будут механически выпущены дополнительные волокна. Когда будет собрано достаточно миофиберов, поместите блюдо в инкубатор клеточной культуры на один час в течение дополнительного периода эквилибрации. В конце инкубации перенесите отдельные миофиберы на новое, предварительно подогретое конское блюдо с покрытием, содержащее соответствующую культурную среду, и верните тарелку в инкубатор клеточной культуры.Для иммунофлуоресцентного анализа миофиберов, после перекрестного соединения, удалите все, кроме достаточного супернатанта, чтобы не удалять волокна и добавьте в ту же трубку один миллилитр 0,5%Triton X-100 в PBS для пятиминутной инкубации с нежным возбуждением. В конце инкубации, позвольте волокнам поселиться в течение пяти минут, прежде чем заменить супернатант с 1,5 миллилитров PBS. После пяти минут нежного возбуждения, дайте волокнам осесть еще на пять минут, прежде чем заменить супернатант на один миллилитр блокирующего раствора.После одного часа нежного возбуждения замените блокирующий раствор свежим блокирующим раствором, содержащим первичные антитела, представляющие интерес для ночной инкубации при четырех градусах Цельсия с нежным возбуждением. На следующее утро, мыть волокна с тремя пятиминутные моет в один миллилитр свежих 0,25%Tween 20 в PBS с использованием нежного возбуждения и пять минут осадков при комнатной температуре для мытья. После последней стирки, этикетка волокон с соответствующим флюорохромом конъюгированных вторичных антител, разбавленных в блокирующий раствор в течение одного часа при комнатной температуре с нежным возбуждением, защищены от света, а затем три моет в PBS плюс 0,1%Tween, защищены от света, как попродемонстрировано.После последней стирки замените супернатант одним миллилитром раствора DAPI на пятиминутную инкубацию при комнатной температуре с нежным возбуждением, защищенным от света. В конце инкубации, мыть волокна и использовать блокирующий раствор покрытием пипетки с разрезом наконечником для сбора волокон и тщательно распространять волокна на стеклянной горке. Поместите слайд под рассечение микроскопа, и, используя только естественный свет, отраженный зеркалом, используйте новый 200 микролитровый наконечник пипетки, чтобы аккуратно распределить волокна и удалить избыток раствора.После удаления избыточного раствора, дайте слайду высохнуть в темноте в течение 10-15 минут, пока не останется очень небольшой объем раствора. Затем добавьте соответствующий объем монтажной среды на волокна, прежде чем тщательно разместить крышку скольжения по тканям. Чтобы получить достаточное количество длинных, жизнеспособных волокон, которые могут выжить 96 часов в фактор роста богатой среде, четыре различных мышц, как правило, собирают и переваривают.Только самые нетронутые волокна должны быть переданы в культурную среду. Разбитые волокна и другие обломки должны быть выброшены. После 72 часов культуры активированные спутниковые клетки генерируют агрегаты клеток, связанные с миофибером.Мы наблюдаем, что культура клеток, полученных из дельты Ламин восемь 11 двойных отрицательных мышей образуются меньшим количеством клеток. После 96 часов, спутниковые клетки выражают MyoG, становятся видимыми в клеточном кластере, инициируя дифференциацию к новым миофиберам. Примечательно, что задержка динамики дифференциации спутниковых клеток наблюдается у гомозиготных мышей-мутантов Ламина по сравнению с их коллегами дикого типа.Будьте уверены, чтобы практиковать шаги вскрытия мышц, как быстрый и точный урожай мышц имеет важное значение для успеха эксперимента. Этот метод позволяет отслеживать одиночные спутниковые клетки во время активации и дифференциации, облегчая изучение ключевых процессов, лежащих в основе роста и регенерации мышц в различных физиологических и патологических условиях.

Research

JoVE Journal

Medicine

Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation

Развитию облитерирующего бронхиолит в мышиной модели ортотопической трансплантации легких

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки мышечной дистрофией пациентов: эффективная интеграция без перепрограммирования мочи клеток, полученных

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Выделение и распространение циркулирующих опухолевых клеток из мыши рака Модель

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

Multi-пропуск экзонов Использование Коктейль антисмысловые олигонуклеотиды в собачьих Х-хромосомой мышечной дистрофии

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Выделение и культуры первичных эндотелиальных клеток от клыка артериями и венами

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

Оценка экзона включение индуцированных сращивания переключения антисмысловых олигонуклеотидов в фибробластов SMA пациента

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide ...

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Стволовых клеток кишечника изоляции и культуры в свинину модели сегментарный малого кишечника ишемии

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

Measurements of Motor Function and Other Clinical Outcome Parameters in Ambulant Children with Duchenne Muscular Dystrophy

Измерения в моторной функции и другие параметры клинических исходов в амбулаторная детей с мышечной дистрофии Дюшенна

While the number of new treatment options tested in patients with Duchenne muscular dystrophy (DMD) is increasing, there is still no defining of the most ...

Direct Drug Delivery to Kidney via the Renal Artery

Прямая доставка лекарств в почки через почечную артерию

There is a need for directed injections to enable increased and specific renal exposure for efficient evaluation of drug targets in the renal research ...

A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease.

Провоспалительная, дегенеративная модель культуры органов для моделирования ранней стадии заболевания межпозвоночных дисков.

Symptomatic intervertebral disc (IVD) degeneration (IDD) is a major socioeconomic burden and is characterized by inflammation and tissue degradation. Due ...