Name: laser-capture microdissection rna-sequencing for spatial and temporal tissue-specific gene expression analysis in plants
Uploaded: 2020-08-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل من قبل مجلس البحوث الأسترالية من التميز في بيولوجيا الطاقة النباتية (CE140100008) إلى JW. تم دعم M.G.L من قبل جامعة لا تروب منحة بدء. نشكر منصة لا تروب جينوميكس على دعمها في تسلسل عالي الإنتاجية وتحليل البيانات. نشكر البروفيسور المشارك ماثيو تاكر على مشورة الخبراء حول إنشاء LCM في مختبرنا.

كما المنتج النهائي هو RNA، والحرص على تجنب تلويث العمل مع RNases. ارتداء القفازات أمر لا بد منه. استخدام ديثيل بيروكاربونات (DEPC) - المياه المعالجة، والمخازن، الخ. مخازن الأوتوكلاف وخبز الأواني الزجاجية قبل الاستخدام.
1. تثبيت الأنسجة
<ol><li>إعداد المثبت من اختيار اعتمادا على الأنو?...

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Alevizos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+cancer+in+vivo+gene+expression+profiling+assisted+by+laser+capture+microdissection+and+microarray+analysis.">Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis.</a> Oncogene. 20 (43), 6196-6204 (2001).</li><li>Cong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+follicular+lymphoma:+description+and+analysis+by+laser+capture+microdissection.">In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection.</a> Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 99 (9), 3376-3382 (2002).</li><li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+protocol+for+xylem+tissues+of+woody+plants.">Laser capture microdissection protocol for xylem tissues of woody plants.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 1965 (2017).</li><li>Casson, S., Spencer, M., Walker, K., Lindsey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+for+the+analysis+of+gene+expression+during+embryogenesis+of+Arabidopsis.">Laser capture microdissection for the analysis of gene expression during embryogenesis of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 42 (1), 111-123 (2005).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LCM-seq+reveals+the+crucial+role+of+LsSOC1+in+heat-promoted+bolting+of+lettuce+(Lactuca+sativa+L.).">LCM-seq reveals the crucial role of LsSOC1 in heat-promoted bolting of lettuce (Lactuca sativa L.).</a> The Plant Journal. 95 (3), 516-528 (2018).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+atlas+of+rice+cell+types+uncovers+cellular,+functional+and+developmental+hierarchies.">A transcriptome atlas of rice cell types uncovers cellular, functional and developmental hierarchies.</a> Nature Genetics. 41 (2), 258-263 (2009).</li><li>Kivivirta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+laser+microdissection+(LMD)+followed+by+transcriptome+analysis+of+plant+reproductive+tissue+in+phylogenetically+distant+angiosperms.">A protocol for laser microdissection (LMD) followed by transcriptome analysis of plant reproductive tissue in phylogenetically distant angiosperms.</a> Plant Methods. 15 (1), 1-11 (2019).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+dynamics+of+the+maize+leaf+transcriptome.">The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome.</a> Nature Genetics. 42 (12), 1060-1067 (2010).</li><li>Liew, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+tissue-specific+regulation+of+transcriptomes+during+barley+(Hordeum+vulgare)+seed+germination.">Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination.</a> The Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).</li><li>Matas, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-and+cell-type+specific+transcriptome+profiling+of+expanding+tomato+fruit+provides+insights+into+metabolic+and+regulatory+specialization+and+cuticle+formation.">Tissue-and cell-type specific transcriptome profiling of expanding tomato fruit provides insights into metabolic and regulatory specialization and cuticle formation.</a> The Plant Cell. 23 (11), 3893-3910 (2011).</li><li>Sakai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser-assisted+microdissection+(LAM)+and+RNA-seq+allows+to+perform+a+comprehensive+transcriptomic+analysis+of+epidermal+cells+of+Arabidopsis+embryo.">Combining laser-assisted microdissection (LAM) and RNA-seq allows to perform a comprehensive transcriptomic analysis of epidermal cells of Arabidopsis embryo.</a> Plant Methods. 14 (1), 10 (2018).</li><li>Zhan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Sequencing+of+Laser-Capture+Microdissected+compartments+of+the+maize+kernel+identifies+regulatory+modules+associated+with+endosperm+cell+differentiation.">RNA Sequencing of Laser-Capture Microdissected compartments of the maize kernel identifies regulatory modules associated with endosperm cell differentiation.</a> The Plant Cell. 27 (3), 513-531 (2015).</li><li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines.">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).</li><li>Zeb, Q., Wang, C., Shafiq, S., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Cell Omics. , 101-135 (2019).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana.">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Protocols. 6 (1), 56 (2011).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Ducos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection:+A+powerful+tool+for+genomics+at+cell+level.">Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 5-27 (2018).</li><li>Nelson, T., Tausta, S. L., Gandotra, N., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+plant+tissue:+what+you+see+is+what+you+get.">Laser microdissection of plant tissue: what you see is what you get.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 57, 181-201 (2006).</li><li>Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Be+more+specific!+Laser-assisted+microdissection+of+plant+cells.">Be more specific! Laser-assisted microdissection of plant cells.</a> Trends in Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+obtaining+high+quality+RNA+from+paraffin+sections+of+plant+tissues+by+laser+microdissection.">A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection.</a> Journal of Plant Research. 123 (6), 807-813 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7 (1), 3 (2006).</li><li>Ferreira, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+mRNA+amplification+approach+for+RNAseq+from+limited+amount+of+RNA.">Linear mRNA amplification approach for RNAseq from limited amount of RNA.</a> Gene. 564 (2), 220-227 (2015).</li><li>Schneider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+T7+RNA+polymerase+based+in+vitro+linear+RNA+amplification+for+use+in+microarray+experiments.">Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments.</a> BMC Genomics. 5 (1), 29 (2004).</li><li>Shanker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+RNA+amplification+kits+for+RNA+sequencing+using+very+low+input+amounts+of+total+RNA.">Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), 4 (2015).</li><li>Bhattacherjee, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+fluorescently+labeled+embryonic+cranial+neural+crest+cells.">Laser capture microdissection of fluorescently labeled embryonic cranial neural crest cells.</a> Genesis. 39 (1), 58-64 (2004).</li><li>Cl&#233;ment-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenchymal+Cells+Contribute+to+Lignification+of+Tracheids+in+Developing+Xylem+of+Norway+Spruce.">Parenchymal Cells Contribute to Lignification of Tracheids in Developing Xylem of Norway Spruce.</a> Plant Physiology. 181 (4), 1552-1572 (2019).</li><li>Schad, M., Lipton, M. S., Giavalisco, P., Smith, R. D., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two-dimensional+electrophoresis+and+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+tissue-specific+protein+profiling+of+laser-microdissected+plant+samples.">Evaluation of two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for tissue-specific protein profiling of laser-microdissected plant samples.</a> Electrophoresis. 26 (14), 2729-2738 (2005).</li><li>Schad, M., Mungur, R., Fiehn, O., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+laser+microdissected+vascular+bundles+of+Arabidopsis+thaliana.">Metabolic profiling of laser microdissected vascular bundles of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 1 (1), 2 (2005).</li><li>Latrasse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+epigenetic+regulation+underlying+unisexual+flower+development+in+Cucumis+melo.">The quest for epigenetic regulation underlying unisexual flower development in Cucumis melo.</a> Epigenetics &amp; Chromatin. 10 (1), 22 (2017).</li><li>Turco, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+gene+expression+regulation+associated+with+vascularization+in+Sorghum+bicolor.">DNA methylation and gene expression regulation associated with vascularization in Sorghum bicolor.</a> The New Phytologist. 214 (3), 1213-1229 (2017).</li><li>Gomez, S. K., Harrison, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+and+its+application+to+analyze+gene+expression+in+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">Laser microdissection and its application to analyze gene expression in arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Pest Management Science: Formerly Pesticide Science. 65 (5), 504-511 (2009).</li><li>Roux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+analysis+of+plant+and+bacterial+gene+expression+in+symbiotic+root+nodules+using+laser-capture+microdissection+coupled+to+RNA+sequencing.">An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing.</a> The Plant Journal. 77 (6), 817-837 (2014).</li><li>Tang, W., Coughlan, S., Crane, E., Beatty, M., Duvick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+laser+microdissection+to+in+planta+gene+expression+profiling+of+the+maize+anthracnose+stalk+rot+fungus+Colletotrichum+graminicola.">The application of laser microdissection to in planta gene expression profiling of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (11), 1240-1250 (2006).</li></ol>

وقد تم الحد من العديد من دراسات التعبير الجيني الخاصة بالأنسجة عن طريق تشريح اليد للعينات ، والتي تستغرق وقتا طويلا ، والعمالة المكثفة ، لديها خطر كبير من التلوث ويمكن أن تستخدم فقط العينات التي تعمل الإنسان هو بارعة بما فيه الكفاية لحصاد. LCM هو تقنية دقيقة وخالية من الاتصال لجمع الخلايا م?...

يشمل تطوير النبات ونموه العمل المنسق للشبكات التنظيمية النسخية داخل خلايا مختلفة موجودة في بيئة خلوية معقدة. لفهم نشاط هذه الشبكات التنظيمية، نحن بحاجة إلى معرفة التعبير الجيني المكاني والزماني داخل أنواع الخلايا المختلفة عبر مراحل النمو. ومع ذلك، فإن تحليلات التعبير الجيني تجري بشكل أكثر شيوعا في أعضاء كاملة أو عينات الأنسجة السائبة بسبب التحدي التقني المتمثل في عزل وتحليل أعداد صغيرة من الخلايا. وقد سمحت الطريقة التي نصفها هنا الحصول على تحليل نسخي مكاني وزمني من خلال اقتران LCM مع RNA-seq.
وقد وضعت LCM قبل عقدين من قبل Emmert باك وزملاؤه1. وقد مكنت هذه التقنية الباحثين من عزل الخلايا المفردة أو مجموعات الخلايا بدقة عن بيئتهم باستخدام التصور المجهري المباشر والتلاعب بأشعة الليزر الضيقة1. ومنذ ذلك الحين تم استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع في علم الأحياء السرطان وعلم الأمراض2,3. كما قامت العديد من مجموعات البحوث النباتية بتكييف LCM للاستخدام مع أنواع النباتات المختلفة وأنواع الأنسجة المختلفة4،5،66،7،8،9،10،11. في الآونة الأخيرة، استخدمت العديد من الأوراق أيضا LCM على بذور eudicot و monocot لدراسة الجنين، endosperms وغيرها من هياكل البذور أثناء تطوير البذور والإنبات10،12،13. معظم غيرها من أساليب العزل خلية واحدة شائعة الاستخدام مثل الأنابيب الدقيقة، وفرز الخلايا، وفصل المغناطيسي ومنصات microfluidic تعتمد على الهضم الأنزيمي أو التجانس الميكانيكية لفصل الخلايا. هذا قد يربك تعبير الجينات، وإدخال التحف الفنية التي تربك تفسير البيانات14،15. وتتطلب هذه الطرق أيضا المعرفة السابقة للجينات علامة لكل نوع الخلية لربط الخلايا المنفصلة إلى موقعها المكاني ونوع الخلية الحقيقية. وهناك مجموعة أخرى من التقنيات يعتمد على العزلة على أساس تقارب من الهياكل دون الخلوية بدلا من الخلايا الكاملة، على سبيل المثال سليمة (عزل نوكلي الموسومة في أنواع الخلايا) و TRAP (ترجمة تنقية تقارب الريبوسوم)16،17. ومع ذلك، فإن وضع العلامات على القرابة وتنقية النوى أو الريبوسومات أمر صعب تقنياً في الأنواع النباتية التي ليس لديها بروتوكولات تحويل راسخة. LCM يستفيد من تثبيت الأنسجة السريعة للحفاظ على مستويات النص وتحديد الأنسجة التقليدية عن طريق التصور المباشر للخلايا داخل سياقها الأنسجة / الجهاز الطبيعي، والذي يسمح للخلايا منفصلة لتكون معزولة في فترة قصيرة من الوقت18،19.
البروتوكول المقدم هنا هو طريقة محسنة لعزل خلايا محددة أو أنواع الخلايا من أقسام الأنسجة من بذور الحبوب، والتي يمكن تطبيقها على معظم الخلايا التي يمكن تحديدها من الناحية النسيجية. يوفر LCM طريقة خالية من الاتصال لعزل الخلايا ، مما يقلل إلى حد كبير من التلوث وزيادة سلامة الحمض النووي الريبي المستعاد. وعلاوة على ذلك، توضح هذه الطريقة قوة LCM على الدراسات واسعة النطاق الجينوم بدءا من كميات صغيرة من المواد البيولوجية. كما أننا نُصف التضخيم الخطي للرنا لتوليد مواد إدخال كافية لتحليلات النسخ/النسخ.
هناك عشر خطوات رئيسية في هذا البروتوكول LCM RNA-seq لـ transcriptomes المكانية والزمانية الخاصة بالأنسجة، بما في ذلك تثبيت عينات الأنسجة، والجفاف، وتسرب البارافين، والتضمين، والقطع، واللمس، واستخراج الحمض النووي الريبي، والتضخيم RNA، والكمية RNA وqRT-PCR و /أو RNA-seq(الشكل 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61517/61517fig01.jpg"> الشكل 1: مخطط انسيابي من LCM متبوعاً بـ RNA-seq أو qRT-PCR. LCM هو تقنية دقيقة مكانيا وخالية من الاتصال لجمع الخلايا من أقسام الأنسجة الثابتة باستخدام شعاع الليزر تحت التصور المجهري. تبدأ العملية مع تثبيت عينات الأنسجة ، تليها الجفاف باستخدام سلسلة متدرجة من الإيثانول والزيلين ، وانتهت مع تسلل البارافين. يمكن أن تكون العملية مؤتمتة بالكامل باستخدام معالج الأنسجة. مرة واحدة يتم اختراق الأنسجة مع البارافين، يتم تضمينه في قالب مع البارافين المنصهر باستخدام محطة تضمين. يتم إجراء اقطع باستخدام microtome تعيين إلى سمك المطلوب. يتم إعداد الشرائح وLCM التي أجريت مباشرة قبل RNA هو أن تستخرج من الخلايا التي تم التقاطها. ويتبع استخراج الحمض النووي الريبي مباشرة من قبل جولتين من تضخيم الحمض النووي الريبي قبل qRT-PCR و / أو RNA-seq. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61517/61517fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid 100 % ACS/R.</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td>
			<td>VWRC20104.323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdhesiveCap 200 opaque</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415190-9181-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear base moulds 8 X 10</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3803015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40718-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity RNA ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low&#173;profile disp.blades DB80LS</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14035843489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PEN</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415190-9041-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td>Ambion (ThermoFisher)</td>
			<td>AMB17515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>On-Column DNase I Digestion Set</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNASE70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation RNA-Seq System V2</td>
			<td>NuGen (Integrated Science)</td>
			<td>7102-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin (Surgipath Paraplast)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>ABI (ThermoFisher)</td>
			<td>KIT0214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Ambion (ThermoFisher)</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td>
			<td>VWRC28975.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Benchtop Tissue Processor</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Heated Paraffin Embedding Module</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>EG1150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Cold Plate</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets</td>
			<td>LAF Technologies Pty Ltd</td>
			<td>Safemate 1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fully Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>RM2265</td>
			<td>with PALMRobo v 4.6 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss PALM MicroBeam LCM system</td>
			<td>Zeiss miscroscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-capture microdissection rna-sequencing for spatial and temporal tissue-specific gene expression analysis in plants

ويخضع تطوير كائن معقد متعدد الخلايا لأنواع خلايا مختلفة لها ملامح مختلفة. لتحديد الشبكات التنظيمية النسخية التي تحكم العمليات التنموية من الضروري قياس ملامح التعبير الجيني المكاني والزماني لهذه الأنواع من الخلايا الفردية. ولذلك، فإن التبصر في الرقابة الوُقتائية على التعبير الجيني أمر ضروري لفهم كيفية تنظيم العمليات البيولوجية والإنمائية. هنا، نحن وصف طريقة التقاط الليزر microdissection (LCM) لعزل عدد صغير من الخلايا من ثلاثة أعضاء جنين الشعير على مدى فترة زمنية خلال عملية الإنبات تليها التنميط النص. وتتألف هذه الطريقة من تثبيت الأنسجة، وتجهيز الأنسجة، والبارافين تضمين، والقسم، LCM و RNA استخراج تليها في الوقت الحقيقي PCR أو RNA-seq. وقد مكنتنا هذه الطريقة من الحصول على ملامح مكانية والزمنية من نسخ أعضاء البذور من أعداد مختلفة من الخلايا (من عشرات إلى مئات)، مما يوفر خصوصية الأنسجة أكبر بكثير من التحليلات النموذجية لالأنسجة السائبة. من هذه البيانات كنا قادرين على تحديد ومقارنة الشبكات التنظيمية النسخية وكذلك التنبؤ بعوامل النسخ التنظيمية المرشحة للأنسجة الفردية. وينبغي أن تكون الطريقة قابلة للتطبيق على الأنسجة النباتية الأخرى مع الحد الأدنى الأمثل.

نحن ولدت المكانية والزمانية الأنسجة المحددة transcriptomes من بذور الشعير أثناء الإنبات باستخدام لدينا LCM RNA-seq بروتوكول10. وقد أجريت الدراسة من خلال تطبيق LCM RNA-seq على عدد قليل من الخلايا من ثلاثة أعضاء الجنين (بلوم، تلميح شعاعي، scutellum) كل 8 ح على مدى 48 ساعة دورة زمنية أثناء الإنبات (0-48 سا...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants at JoVE.com

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

هنا هو بروتوكول لالتقاط الليزر microdissection (LCM) من الأنسجة النباتية. LCM هي تقنية مجهرية لعزل مناطق الأنسجة بطريقة خالية من التلوث. ويشمل الإجراء تثبيت الأنسجة، التضمين البارافين، والتجزئة، LCM واستخراج الحمض النووي الريبي. يتم استخدام الحمض النووي الريبي في تحليل الأنسجة المصب محددة، حل مؤقتا من transcriptomes.

الليزر التقاط Microdissection RNA تسلسل لتحليل التعبير الجيني المكاني والزماني محددة في النباتات

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

يستخدم هذا البروتوكول الالتقاط الدقيق بالليزر إلى جانب تسلسل الحمض النووي الريبي للحصول على نسخ مكانية وزمنية من خلايا محددة في نباتات المصالح، وذلك باستخدام كميات صغيرة من المواد البيولوجية. الميزة الرئيسية لتقنية الليزر هي أنه يسهل التصور المباشر للخلايا داخل سياق الأنسجة الطبيعية ، مما يسمح للخلايا المنفصلة أن تكون معزولة بدقة بطريقة خالية من الاتصال. على الرغم من أن هذا البروتوكول هو الأمثل لعزل الخلايا النباتية، يمكن تطبيقه على معظم الخلايا التي يمكن التعرف عليها من الناحية البكانية.إعداد عينة جيدة أمر بالغ الأهمية. لذلك، واحدة تنفيذ هذه التقنية للمرة الأولى، دعم التحسين من تثبيت الأنسجة وتضمين مهم قبل التقاط الليزر Microdissection. قبل جمع عينة الأنسجة، وإعداد تثبيت مناسبة للأنواع ونوع الأنسجة التي سيتم حصادها.بالنسبة لبذورة الشعير، قم بقطع عينات البذور إلى النصف قبل غمر العينات في ما لا يقل عن 10 × حجم تثبيت الجليد البارد. استخدام فراغ التسلل لتسريع اختراق المثبت. الأنسجة يجب أن تغرق في نهاية التسلل، ثم تحديث التثبيت لاحتضان ليلة وضحاها ونقل العينات إلى أشرطة لمعالجة الأنسجة.ضع الكاسيتات المحملة بالأنسجة في السلة المعدنية لمعالج أوتوماتيكي واربط السلة المعدنية بصاحبها فوق الغرفة الواحدة. تعيين البرنامج على لوحات التحكم في المعالج الأنسجة والصحافة بدء لبدء برنامج المعالجة التلقائي. وسوف يجفف النظام العينات عن طريق غمس الكاسيتات في سلسلة متدرجة من الإيثانول لمدة 90 دقيقة لكل تركيز كما هو مبين.وبعد الغمر الأخير بالإيثانول، سيقوم النظام بغمر العينات في تدرجات من الزيلين لمدة 90 دقيقة لكل حل كما هو مبين. تليها 290 دقيقة الغمر في البارافين المنصهر في 55 إلى 60 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي، وإزالة البارافين تسللت أشرطة من معالج الأنسجة والمضي قدما في تضمين البارافين.في صباح اليوم التالي، استخدم ملقط غرامة لنقل عينات العملية إلى قوالب الحجم المناسب وإضافة البارافين المنصهر على كل عينة. بالنسبة لبذور الشعير، قم بتوجيه العينات في البارافين طولياً إلى اتجاه القطع لتسهيل الحصول على المقاطع الطولية. ضع كاسيتًا نظيفًا على القالب وتأكد من أن الكاسيت بأكمله مغطى بالكامل بحجم كافٍ من البارافين لتأمين العينة إلى الكاسيت.ثم ضع القالب على طبق بارد لمدة 10 إلى 20 دقيقة حتى يتم تعيين البارافين قبل تحرير الكتلة من القالب. لإعداد شرائح غشاء القلم، غمر الشرائح في محلول تعطيل RNS لمدة ثلاث ثوانٍ متبوعة بغسلات قصيرة والمياه المعالجة DEPC. ثم محرك الشرائح في حاضنة 370 درجة مئوية لإزالة أي حل بقايا والأشعة فوق البنفسجية علاج الشرائح في مجلس الوزراء تدفق لارينار لمدة 30 دقيقة لتعزيز البارافين لا البندق.لعينة من الأنسجة اقسام مكان كتل البارافين على لوحة باردة وملء حمام الماء مع المياه المعالجة DEPC، ثم الحارة إلى 42 درجة مئوية. كتل تقليم إلى عمق المنطقة من الفائدة وقسم كتل البارافين إلى سمك ستة إلى 10 ميكرون. كتلة مقطعة جيدا سوف تشكل شريط على حافة النصل.استخدم ملاقطة دقيقة لنقل شرائط من الدقيقة إلى حمام الماء بلطف، مع الحرص على أن يضع الشريط مسطحة على سطح الماء. لجمع المقاطع، مع عقد شريحة في زاوية 45 درجة، واستخدام حركة التصاعدي لرفع الشريط من الماء على الشريحة واستخدام نسيج خال من الوبر لإزالة بعناية المياه الزائدة. عندما تم جمع جميع الأقسام، وغسل الشرائح مع غسل 320 ثانية في إكسيلين تليها 230 ثانية يغسل في 100٪ الإيثانول و 230 يغسل ثانية في 70٪ الإيثانول.لmicrodissect الخلايا ذات الأهمية من أقسام الأنسجة deparraffinized والجافة ، تحميل الشرائح على فتحات المجهر LCM الثلاث وتحميل أنبوب جمع في الفتحات المتاحة. نقل المرحلة لتحديد موقع المنطقة من العينة التي تحتاج إلى قطع وقطع قطعة فارغة خالية من الأنسجة على الشريحة الغشاء. لتحسين سرعة القطع والقطع في ضغط الليزر الطاقة والتركيز.استخدام أدوات الرسم لتحديد المنطقة ذات الاهتمام في الأنسجة واستخدام المعلمات الأمثل ووظيفة LPC روبو إلى الخلايا المنجنيق في قبعات لاصقة. حدد علامة من قائمة العناصر لاستخدام أداة العلامة لوضع علامة على المناطق التي تهمك. تحقق من زر فحص الغطاء لفحص الغطاء اللاصق ، للتأكد من أنه تم التقاط العينات.وعادة ما تكون هناك حاجة إلى 10 إلى 15 قسما لكل غطاء لاستخراج الحمض النووي الريبي. مباشرة بعد الحصول على جميع العينات، انتقل فورا لاستخراج الحمض النووي الريبي لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي. بعد استخراج الحمض النووي الريبي والتضخيم RNA استخدام نظام كهربائي الآلي، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لتحديد كمي وتأهيل الحمض النووي الريبي.في هذه الدراسة، LCM، تم تطبيق تسلسل الحمض النووي الريبي على عدد قليل من الخلايا من ثلاثة أعضاء الجنين، كل ثماني ساعات على مدى 48 ساعة دورة زمنية أثناء الإنبات. من المهم ضبط معلمات القطع بشكل صحيح للسماح بقطع الأنسجة ذات الاهتمام بدقة وخلعها من الأنسجة المحيطة دون حرق حافة المنطقة المختارة. تفرع من مجموع الجيش الملكي النيبالي قبل تضخيم RNA يسمح الكشف عن عصابات كهربية متميزة وقمم الفلورسنت من 18 و 28S وحدات فرعية الريبوزومية في عينات الحمض النووي الريبي ذات نوعية جيدة.سوف توليفها بنجاح المضادة للنادس RNA يحمل توزيع حجم متماثل الأحادي الواسطة من 100 إلى 1000 نوكليوتيدات مع ذروة حول 300 النيوكليوتيدات بعد جولتين من التضخيم. متعدد الأبعاد رسم مقياس الجينات التي أعرب عنها في الأنسجة المختلفة على مدى 48 ساعة من الإنبات، ويوضح وجود تشابه أكبر بين عينات من نسيج واحد مما بين العينات من نفس النقطة الزمنية، ولكن الأنسجة المختلفة. عدد الجينات التي يعبر عنها بشكل تفاضلي يزداد تدريجيا على مدى الإنبات في كل نسيج نسبة إلى نقطة ساعة الصفر من الوقت من الأنسجة.في هذا التحليل التمثيلي، تم العثور على 25٪ من البلوم، 34٪ من الشعاع و 41٪ من الجينات التي تم التعبير عنها بشكل تفاضلي أن تكون عبرت حصرا داخل كل نسيج. من المهم ضبط المعلمات القطع بشكل صحيح لختان دقيق وخلع منطقة المحدد من الأنسجة المحيطة دون حرق حافة المنطقة المختارة. مع تحسين كروماتين وأساليب تنقية البروتين، وتعزيز أداة قياس الطيف الشامل، LCM يمكن استخدامها لنوع الخلية زراعة دراسات الجينومية والبروتيومومية محددة.

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

الليزر Microdissection القبض على أنسجة الثدييات

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 3

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

تحليل الحمض النووي الريبي العالمي التجميعي على مستوى خلية واحدة نقص الأكسجة التالي

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...