Name: laser-capture microdissection rna-sequencing for spatial and temporal tissue-specific gene expression analysis in plants
Uploaded: 2020-08-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Australian Research Council Centre of Excellence in Plant Energy Biology (CE140100008) til JW. M.G.L blev støttet af en La Trobe University start tilskud. Vi takker La Trobe Genomics Platform for deres støtte i høj-throughput sekventering og dataanalyse. Vi takker lektor Matthew Tucker for ekspertrådgivning om oprettelse af LCM i vores laboratorium.

Da det endelige produkt er RNA, skal du passe på at undgå at forurene arbejdet med RNases. Iført handsker er et must. Brug diethylpyocarbonat (DEPC) -behandlet vand, buffere osv. Autoklave buffere og bage glasvarer før brug.
1. Vævsfiksering
<ol><li>Forbered fiksering af valg afhængigt af art og væv typer; for bygfrø anvendes Landmandens fiksativ (75 % ethanol, 25 % iseddike (v/v)).</li>
	<li>Chill fiksativ på is før høst væv.</li>
	<li>Saml plantemateriale af interesse og om nø...

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Alevizos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+cancer+in+vivo+gene+expression+profiling+assisted+by+laser+capture+microdissection+and+microarray+analysis.">Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis.</a> Oncogene. 20 (43), 6196-6204 (2001).</li><li>Cong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+follicular+lymphoma:+description+and+analysis+by+laser+capture+microdissection.">In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection.</a> Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 99 (9), 3376-3382 (2002).</li><li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+protocol+for+xylem+tissues+of+woody+plants.">Laser capture microdissection protocol for xylem tissues of woody plants.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 1965 (2017).</li><li>Casson, S., Spencer, M., Walker, K., Lindsey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+for+the+analysis+of+gene+expression+during+embryogenesis+of+Arabidopsis.">Laser capture microdissection for the analysis of gene expression during embryogenesis of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 42 (1), 111-123 (2005).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LCM-seq+reveals+the+crucial+role+of+LsSOC1+in+heat-promoted+bolting+of+lettuce+(Lactuca+sativa+L.).">LCM-seq reveals the crucial role of LsSOC1 in heat-promoted bolting of lettuce (Lactuca sativa L.).</a> The Plant Journal. 95 (3), 516-528 (2018).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+atlas+of+rice+cell+types+uncovers+cellular,+functional+and+developmental+hierarchies.">A transcriptome atlas of rice cell types uncovers cellular, functional and developmental hierarchies.</a> Nature Genetics. 41 (2), 258-263 (2009).</li><li>Kivivirta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+laser+microdissection+(LMD)+followed+by+transcriptome+analysis+of+plant+reproductive+tissue+in+phylogenetically+distant+angiosperms.">A protocol for laser microdissection (LMD) followed by transcriptome analysis of plant reproductive tissue in phylogenetically distant angiosperms.</a> Plant Methods. 15 (1), 1-11 (2019).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+dynamics+of+the+maize+leaf+transcriptome.">The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome.</a> Nature Genetics. 42 (12), 1060-1067 (2010).</li><li>Liew, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+tissue-specific+regulation+of+transcriptomes+during+barley+(Hordeum+vulgare)+seed+germination.">Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination.</a> The Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).</li><li>Matas, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-and+cell-type+specific+transcriptome+profiling+of+expanding+tomato+fruit+provides+insights+into+metabolic+and+regulatory+specialization+and+cuticle+formation.">Tissue-and cell-type specific transcriptome profiling of expanding tomato fruit provides insights into metabolic and regulatory specialization and cuticle formation.</a> The Plant Cell. 23 (11), 3893-3910 (2011).</li><li>Sakai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser-assisted+microdissection+(LAM)+and+RNA-seq+allows+to+perform+a+comprehensive+transcriptomic+analysis+of+epidermal+cells+of+Arabidopsis+embryo.">Combining laser-assisted microdissection (LAM) and RNA-seq allows to perform a comprehensive transcriptomic analysis of epidermal cells of Arabidopsis embryo.</a> Plant Methods. 14 (1), 10 (2018).</li><li>Zhan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Sequencing+of+Laser-Capture+Microdissected+compartments+of+the+maize+kernel+identifies+regulatory+modules+associated+with+endosperm+cell+differentiation.">RNA Sequencing of Laser-Capture Microdissected compartments of the maize kernel identifies regulatory modules associated with endosperm cell differentiation.</a> The Plant Cell. 27 (3), 513-531 (2015).</li><li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines.">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).</li><li>Zeb, Q., Wang, C., Shafiq, S., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Cell Omics. , 101-135 (2019).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana.">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Protocols. 6 (1), 56 (2011).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Ducos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection:+A+powerful+tool+for+genomics+at+cell+level.">Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 5-27 (2018).</li><li>Nelson, T., Tausta, S. L., Gandotra, N., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+plant+tissue:+what+you+see+is+what+you+get.">Laser microdissection of plant tissue: what you see is what you get.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 57, 181-201 (2006).</li><li>Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Be+more+specific!+Laser-assisted+microdissection+of+plant+cells.">Be more specific! Laser-assisted microdissection of plant cells.</a> Trends in Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+obtaining+high+quality+RNA+from+paraffin+sections+of+plant+tissues+by+laser+microdissection.">A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection.</a> Journal of Plant Research. 123 (6), 807-813 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7 (1), 3 (2006).</li><li>Ferreira, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+mRNA+amplification+approach+for+RNAseq+from+limited+amount+of+RNA.">Linear mRNA amplification approach for RNAseq from limited amount of RNA.</a> Gene. 564 (2), 220-227 (2015).</li><li>Schneider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+T7+RNA+polymerase+based+in+vitro+linear+RNA+amplification+for+use+in+microarray+experiments.">Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments.</a> BMC Genomics. 5 (1), 29 (2004).</li><li>Shanker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+RNA+amplification+kits+for+RNA+sequencing+using+very+low+input+amounts+of+total+RNA.">Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), 4 (2015).</li><li>Bhattacherjee, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+fluorescently+labeled+embryonic+cranial+neural+crest+cells.">Laser capture microdissection of fluorescently labeled embryonic cranial neural crest cells.</a> Genesis. 39 (1), 58-64 (2004).</li><li>Cl&#233;ment-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenchymal+Cells+Contribute+to+Lignification+of+Tracheids+in+Developing+Xylem+of+Norway+Spruce.">Parenchymal Cells Contribute to Lignification of Tracheids in Developing Xylem of Norway Spruce.</a> Plant Physiology. 181 (4), 1552-1572 (2019).</li><li>Schad, M., Lipton, M. S., Giavalisco, P., Smith, R. D., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two-dimensional+electrophoresis+and+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+tissue-specific+protein+profiling+of+laser-microdissected+plant+samples.">Evaluation of two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for tissue-specific protein profiling of laser-microdissected plant samples.</a> Electrophoresis. 26 (14), 2729-2738 (2005).</li><li>Schad, M., Mungur, R., Fiehn, O., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+laser+microdissected+vascular+bundles+of+Arabidopsis+thaliana.">Metabolic profiling of laser microdissected vascular bundles of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 1 (1), 2 (2005).</li><li>Latrasse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+epigenetic+regulation+underlying+unisexual+flower+development+in+Cucumis+melo.">The quest for epigenetic regulation underlying unisexual flower development in Cucumis melo.</a> Epigenetics &amp; Chromatin. 10 (1), 22 (2017).</li><li>Turco, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+gene+expression+regulation+associated+with+vascularization+in+Sorghum+bicolor.">DNA methylation and gene expression regulation associated with vascularization in Sorghum bicolor.</a> The New Phytologist. 214 (3), 1213-1229 (2017).</li><li>Gomez, S. K., Harrison, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+and+its+application+to+analyze+gene+expression+in+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">Laser microdissection and its application to analyze gene expression in arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Pest Management Science: Formerly Pesticide Science. 65 (5), 504-511 (2009).</li><li>Roux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+analysis+of+plant+and+bacterial+gene+expression+in+symbiotic+root+nodules+using+laser-capture+microdissection+coupled+to+RNA+sequencing.">An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing.</a> The Plant Journal. 77 (6), 817-837 (2014).</li><li>Tang, W., Coughlan, S., Crane, E., Beatty, M., Duvick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+laser+microdissection+to+in+planta+gene+expression+profiling+of+the+maize+anthracnose+stalk+rot+fungus+Colletotrichum+graminicola.">The application of laser microdissection to in planta gene expression profiling of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (11), 1240-1250 (2006).</li></ol>

Mange vævsspecifikke genudtryksundersøgelser er blevet begrænset ved hånddissektion af prøver, som er tidskrævende, arbejdskrævende, har en høj risiko for kontaminering og kan kun udnytte prøver, som en menneskelig agent er tilstrækkelig behændning til at høste. LCM er en præcis og kontaktfri teknik til at indsamle celler fra faste vævssektioner ved hjælp af en mekanisk betjent laserstråle under mikroskopisk visualisering.
God prøve forberedelse er afgørende for LCM. Processe...

Planteudvikling og vækst indebærer en koordineret indsats af transskriptionelle regulerende netværk inden for forskellige celler, der findes i et komplekst cellulært miljø. For at forstå aktiviteten af disse regulatoriske netværk, kræver vi viden om rumlige og tidsmæssige genekspression inden for forskellige celletyper på tværs af udviklingsstadier. Men, analyser af genekspression er mere almindeligt udført i hele organer eller bulk vævsprøver på grund af den tekniske udfordring at isolere og analysere et lille antal celler. Den metode, vi beskriver her, har gjort det muligt at opnå rumlig og tidsspecifik transkriptionsanalyse ved at koble LCM med RNA-seq.
LCM blev udviklet for to årtier siden af Emmert-Buck og kolleger1. Teknikken gjorde det muligt for forskere præcist at isolere enkeltceller eller klynger af celler fra deres miljø ved hjælp af direkte mikroskopisk visualisering og manipulation med en smal strålelaser1. Siden da har metoden været meget anvendt i kræftbiologi og patologi2,3. Mange planteforskningsgrupper har også tilpasset LCM til brug med forskellige plantearterogforskellige vævstyper4, 5,66,7,8,9,10,11. For nylig har flere papirer også brugt LCM på eudicot og monocot frø til at studere embryo, endosperms og andre frø strukturer under frø udvikling og spiring10,12,13. De fleste af de andre almindeligt anvendte encellede isolationsmetoder såsom mikrorør, cellesortering, magnetisk separation og mikrofluidiske platforme afhænger af enzymatisk fordøjelse eller mekanisk homogenisering for at adskille celler. Dette kan forstyrre genekspression, indføre tekniske artefakter, der forvirrede data fortolkning14,15. Disse metoder kræver også tidligere kendskab til markørgener for hver celletype for at relatere de dissocierede celler til deres rumlige placering og sande celletype. En yderligere gruppe af teknikker afhænger af affinitetsbaseret isolering af delcellulære strukturer i stedet for hele celler, for eksempel INTAKT (Isolering af nuklei mærket i celletyper) og TRAP (Oversætte Ribosome Affinity Rensning)16,17. Men affinitet mærkning og rensning af kerner eller ribosomer er teknisk udfordrende i plantearter, der ikke har veletablerede transformation protokoller. LCM udnytter hurtig vævsfiksering til at bevare transskriptionsniveauer og konventionel histologisk identifikation ved direkte visualisering af celler i deres normale vævs-/organsammenhæng, hvilket gør det muligt at isolere diskrete cellerpå kort tid 18,19.
Den protokol, der præsenteres her, er en optimeret metode til isolering af specifikke celler eller celletyper fra vævsafsnittene af kornfrø, som kan anvendes på de fleste af de celler, der kan histologisk identificeres. LCM giver en kontaktfri metode til celleisolering, hvilket i høj grad reducerer forureningen og øger integriteten af genvundet RNA. Desuden illustrerer metoden styrken af LCM på store genom brede undersøgelser startende med små mængder af biologiske materialer. Vi beskriver også lineær forstærkning af RNA til generering af tilstrækkeligt inputmateriale til downstream-transskription/transskriptionsanalyser.
Der er ti hovedtrin i denne LCM RNA-seq-protokol for rumlige og tidsmæssige vævsspecifikke transskriptioner, herunder fiksering af vævsprøver, dehydrering, paraffinfiltration, indlejring, sektionsopdelt, LCM- RNA-ekstraktion, RNA-forstærkning, RNA-kvantificering og qRT-PCR og/eller RNA-seq (Figur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61517/61517fig01.jpg"> Figur 1: Rutediagram over LCM efterfulgt af RNA-seq eller qRT-PCR. LCM er en rumlig præcis og kontaktfri teknik til at indsamle celler fra faste vævssektioner ved hjælp af en laserstråle under mikroskopisk visualisering. Processen starter med fiksering af vævsprøver, efterfulgt af dehydrering ved hjælp af en gradient serie af ethanol og xylen, og færdig med paraffin infiltration. Processen kan være fuldt automatiseret ved hjælp af en vævsprocessor. Når vævet er infiltreret med paraffin, er det indlejret i en støbeform med smeltet paraffin ved hjælp af en indlejring station. Sektionssnit udføres ved hjælp af mikrotom indstillet til den ønskede tykkelse. Lysbilleder fremstilles, og LCM udføres umiddelbart før RNA skal udvindes fra tilfangetagne celler. RNA-ekstraktion efterfølges direkte af to runder RNA-forstærkning før qRT-PCR og/eller RNA-seq. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61517/61517fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid 100 % ACS/R.</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td>
			<td>VWRC20104.323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdhesiveCap 200 opaque</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415190-9181-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear base moulds 8 X 10</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3803015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40718-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity RNA ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low&#173;profile disp.blades DB80LS</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14035843489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PEN</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415190-9041-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td>Ambion (ThermoFisher)</td>
			<td>AMB17515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>On-Column DNase I Digestion Set</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNASE70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation RNA-Seq System V2</td>
			<td>NuGen (Integrated Science)</td>
			<td>7102-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin (Surgipath Paraplast)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>ABI (ThermoFisher)</td>
			<td>KIT0214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Ambion (ThermoFisher)</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td>
			<td>VWRC28975.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Benchtop Tissue Processor</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Heated Paraffin Embedding Module</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>EG1150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Cold Plate</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets</td>
			<td>LAF Technologies Pty Ltd</td>
			<td>Safemate 1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fully Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>RM2265</td>
			<td>with PALMRobo v 4.6 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss PALM MicroBeam LCM system</td>
			<td>Zeiss miscroscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-capture microdissection rna-sequencing for spatial and temporal tissue-specific gene expression analysis in plants

Udviklingen af en kompleks flercellet organisme styres af forskellige celletyper, der har forskellige transskriptionelle profiler. For at identificere transskriptionelle reguleringsnetværk, der styrer udviklingsprocesser, er det nødvendigt at måle de rumlige og tidsmæssige genekspressionsprofiler for disse individuelle celletyper. Derfor er indsigt i spatio-tidsmæssig kontrol af genekspression afgørende for at få forståelse for, hvordan biologiske og udviklingsmæssige processer reguleres. Her beskriver vi en laser-capture microdissection (LCM) metode til at isolere et lille antal celler fra tre byg embryo organer over en tid-kursus under spiring efterfulgt af udskrift profilering. Metoden består af vævsfiksering, vævsbehandling, paraffinindlejring, sektionsoptrækning, LCM- og RNA-ekstraktion efterfulgt af pcr eller RNA-seq i realtid. Denne metode har gjort det muligt for os at opnå rumlige og tidsmæssige profiler af frø organ transkriptomer fra varierende antal celler (tiere til hundredvis), hvilket giver langt større væv-specificitet end typiske bulk-væv analyser. Ud fra disse data var vi i stand til at definere og sammenligne transskriptive regulerende netværk samt forudsige kandidat lovgivningsmæssige transskription faktorer for de enkelte væv. Metoden bør anvendes på andre plantevæv med minimal optimering.

Vi genererede rumlige og tidsmæssige vævsspecifikke transkriptoer fra bygfrø under spiring ved hjælp af vores LCM RNA-seq protokol10. Undersøgelsen blev udført ved at anvende LCM RNA-seq på et lille antal celler fra tre embryoorganer (plumule, radikelspids, scutellum) hver 8 timer over et 48 timers tidsforløb under spiring (0-48 h, 7 tidspoint) (Figur 2A,B).
<img alt="Figure 2" class...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants at JoVE.com

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

Præsenteret her er en protokol for laser-capture microdissection (LCM) af plantevæv. LCM er en mikroskopisk teknik til isolering af vævsområder på en forureningsfri måde. Proceduren omfatter vævsfiksering, paraffinindlejring, sektionsindtrækning, LCM- og RNA-ekstraktion. RNA anvendes i den downstream-vævsspecifikke, tidsmæssigt løste analyse af transskriptomer.

Laser-Capture Microdissection RNA-sekventering for rumlige og tidsmæssige vævsspecifikke genekspressionsanalyser i planter

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Denne protokol bruger Laser-Capture Microdissection kombineret med RNA-Sekventering for at opnå rumlige og tidsmæssige transkriptioner fra specifikke celler i planter af interesse ved hjælp af små mængder biologiske materialer. Den største fordel ved laser teknik er, at det letter den direkte visualisering af celler i normal væv sammenhæng, så de diskrete celler, der skal præcist isoleret i en kontaktfri måde. Selv om denne protokol er optimeret til isolering af planteceller, kan den anvendes på de fleste celler, der kan stologisk identificeres.God prøve forberedelse er kritisk. Derfor er en, der udfører denne teknik for første gang, prop optimering af vævsfiksering og indlejring vigtigt før Laser-Capture Microdissection. Før vævsprøven indsamles, skal der udarbejdes et fiksativ, der passer til den art og vævstype, der skal høstes.For bygfrø skæres frøprøverne i halve, før prøverne nedsænkes i mindst 10 X volumen af ierkold fiksativ. Brug vakuuminfiltration til at fremskynde indtrængningen af fiksativ. Vævet skal synke ved slutningen af infiltration, derefter genopfriske fiksativ for en overnatning inkubation og overføre prøverne i kassetter til vævsbehandling.Placer vævsbelastede kassetter i metalkurven på en automatisk processor, og fastgør metalkurven til holderen over kammeret et. Indstil programmet på kontrolpanelerne af væv processor og tryk på begynde at begynde den automatiske behandling program. Systemet dehydrerer prøverne ved at dyppe kassetterne i en gradientserie ethanol i 90 minutter pr. koncentration som angivet.Efter den sidste ethanolnedsænning nedsænkes prøverne i xylengradienter i 90 minutter pr. opløsning som angivet. Efterfulgt af 290 minutters nedsænkning i smeltet paraffin ved 55 til 60 grader Celsius. Den næste morgen, fjerne paraffin infiltreret kassetter fra væv processor og gå videre til paraffin indlejring.Den næste morgen, bruge fine kraftaffætte til at overføre processen prøver i passende størrelse forme og tilsæt smeltet paraffin over hver prøve. For bygfrø orienteres prøverne i paraffinlangt mod skæreretningen for at lette erhvervelsen af sektioner i længderetningen. Anbevis en ren kassette på formen, og sørg for, at hele kassetten er fuldt dækket med et tilstrækkeligt volumen paraffin til at fastgøre prøven til kassetten.Derefter placere formen på en kold plade i 10 til 20 minutter, indtil paraffin er indstillet, før du slipper blokken fra formen. For at forberede en PEN membran dias, nedsænkes dias i RNS deaktivering løsning i tre sekunder efterfulgt af to korte vasker og DEPC behandlet vand. Kør derefter diasene i en 370 grader Celsius inkubator for at fjerne enhver sidestensopløsning og UV behandle diasene i et laminar flowkabinet i 30 minutter for at forbedre deres paraffin ikke hasselnødder.For en prøve væv sektionssted paraffin blokke på den kolde plade og fylde vandbad med DEPC behandlet vand, derefter varm til 42 grader Celsius. Trim blokke til dybden af regionen af interesse og afsnit paraffin blokke til en seks til 10 mikron tykkelse. En godt sektionsafsnit blok vil danne et bånd på kanten af bladet.Brug en fin pincet til forsigtigt at overføre bånd fra mikrotom til vandbadet, idet du skal passe på, at båndet ligger fladt på vandoverfladen. For at indsamle sektioner, holde et dias i en 45 graders vinkel, skal du bruge en opadgående bevægelse til at løfte et bånd op af vandet på diaset og bruge en fnugfri væv til forsigtigt at fjerne det overskydende vand. Når alle sektioner er blevet indsamlet, vaskes objektglassene med 320 sekunder i xylen efterfulgt af 230 sekunder i 100% ethanol og 230 sekunder vasker i 70% ethanol.Til mikrodissect celler af interesse fra de deparraffiniserede og tørre væv sektioner, belastning dias på de tre LCM mikroskop slots og belastning indsamling rør i de tilgængelige slots. Flyt scenen for at finde det område af prøven, der skal skæres og skæres et tomt segment fri for væv på membransliden. For at optimere skærehastigheden og skæringen i lasertryk katapulterende energi og fokus.Brug tegneværktøjerne til at skitsere området for interesse i vævet og bruge de optimerede parametre og Robo LPC-funktionen til at katapultere celler i de klæbende hætter. Vælg flag på grund af elementerne for at bruge flagværktøjet til at markere de områder, der er af interesse. Kontroller hættekontrolknappen for at inspicere klæbehætten for at bekræfte, at prøverne er blevet taget.Typisk 10 til 15 sektioner pr cap er nødvendige for RNA ekstraktion. Umiddelbart efter at alle prøverne er anskaffet, skal du straks gå til RNA-ekstraktion for at undgå RNA-nedbrydning. Efter RNA-ekstraktion og RNA forstærkning bruge en automatiseret elektroforese system, i henhold til producentens anvisninger til at kvantificere og kvalificere antisense RNA.I denne undersøgelse blev LCM, RNA-sekventering anvendt på et lille antal celler fra tre embryoorganer, hver otte timer over et 48 timers tidsforløb under spiring. Det er vigtigt at justere skæreparametrene korrekt, så det pågældende væv præcist skæres og løsnes fra det omgivende væv uden at brænde kanten af det valgte område. Forgrening af den samlede RNA før RNA forstærkning tillader påvisning af forskellige elektroforetiske bånd og fluorescerende toppe af 18 og 28S ribosomal underenheder i god kvalitet RNA prøver.Succesfuldt syntetiseret antisense RNA vil udvise en unimodal symmetrisk størrelsesfordeling fra 100 til 1000 nukleotider med et højdepunkt omkring 300 nukleotider efter to runder forstærkning. Multi-dimensionelle skala plotte af gener udtrykt i de forskellige væv over 48 timers spiring, illustrerer en større lighed mellem prøver af et enkelt væv end mellem prøver fra samme tidspunkt, men forskellige væv. Antallet af differentierede gener stiger gradvist i løbet af spiring i hvert væv i forhold til nul timers tidspunktet for vævet.I denne repræsentative analyse blev det konstateret, at 25 % af fjerdragt, 34 % af radilen og 41 % af de forskellige scutellum-udtrykte gener udelukkende var udtrykt i hvert væv. Det er vigtigt at justere skæreparametrene korrekt for en præcis udskillelse og dislodging af selektorområdet fra det omgivende væv uden at brænde kanten af det valgte område. Med forbedrede kromatin og protein rensning metoder, og forbedre massespektrometri instrument, LCM kan bruges til celletype specifikke epigenomic og proteomics undersøgelser implantater.

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse af Global RNA-syntese på enkelt celle niveau efter Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...