Name: laser-capture microdissection rna-sequencing for spatial and temporal tissue-specific gene expression analysis in plants
Uploaded: 2020-08-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom Australian Research Council Centre of Excellence in Plant Energy Biology (CE140100008) an JW unterstützt. M.G.L wurde von einem Startstipendium der La Trobe University unterstützt. Wir danken der La Trobe Genomics Platform für ihre Unterstützung bei der Sequenzierung und Datenanalyse mit hohem Durchsatz. Wir danken Associate Professor Matthew Tucker für die fachkundige Beratung bei der Einrichtung von LCM in unserem Labor.

Da das Endprodukt RNA ist, achten Sie darauf, die Arbeit mit RNases nicht zu kontaminieren. Das Tragen von Handschuhen ist ein Muss. Verwenden Sie Diethylpyrocarbonat (DEPC) -behandeltes Wasser, Puffer usw. Autoklav-Puffer und backen Glaswaren vor der Verwendung.
1. Gewebefixierung
<ol><li>Vorbereitung Fixierung der Wahl je nach Art und Gewebetypen; für Gerstensaatgut verwenden Sie Farmer es fixative (75% Ethanol, 25% Eisessigsäure (v/v)).</li>
	<li>Kühlen Sie das Fixativ auf Eis vor der ...

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Alevizos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+cancer+in+vivo+gene+expression+profiling+assisted+by+laser+capture+microdissection+and+microarray+analysis.">Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis.</a> Oncogene. 20 (43), 6196-6204 (2001).</li><li>Cong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+follicular+lymphoma:+description+and+analysis+by+laser+capture+microdissection.">In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection.</a> Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 99 (9), 3376-3382 (2002).</li><li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+protocol+for+xylem+tissues+of+woody+plants.">Laser capture microdissection protocol for xylem tissues of woody plants.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 1965 (2017).</li><li>Casson, S., Spencer, M., Walker, K., Lindsey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+for+the+analysis+of+gene+expression+during+embryogenesis+of+Arabidopsis.">Laser capture microdissection for the analysis of gene expression during embryogenesis of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 42 (1), 111-123 (2005).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LCM-seq+reveals+the+crucial+role+of+LsSOC1+in+heat-promoted+bolting+of+lettuce+(Lactuca+sativa+L.).">LCM-seq reveals the crucial role of LsSOC1 in heat-promoted bolting of lettuce (Lactuca sativa L.).</a> The Plant Journal. 95 (3), 516-528 (2018).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+atlas+of+rice+cell+types+uncovers+cellular,+functional+and+developmental+hierarchies.">A transcriptome atlas of rice cell types uncovers cellular, functional and developmental hierarchies.</a> Nature Genetics. 41 (2), 258-263 (2009).</li><li>Kivivirta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+laser+microdissection+(LMD)+followed+by+transcriptome+analysis+of+plant+reproductive+tissue+in+phylogenetically+distant+angiosperms.">A protocol for laser microdissection (LMD) followed by transcriptome analysis of plant reproductive tissue in phylogenetically distant angiosperms.</a> Plant Methods. 15 (1), 1-11 (2019).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+dynamics+of+the+maize+leaf+transcriptome.">The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome.</a> Nature Genetics. 42 (12), 1060-1067 (2010).</li><li>Liew, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+tissue-specific+regulation+of+transcriptomes+during+barley+(Hordeum+vulgare)+seed+germination.">Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination.</a> The Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).</li><li>Matas, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-and+cell-type+specific+transcriptome+profiling+of+expanding+tomato+fruit+provides+insights+into+metabolic+and+regulatory+specialization+and+cuticle+formation.">Tissue-and cell-type specific transcriptome profiling of expanding tomato fruit provides insights into metabolic and regulatory specialization and cuticle formation.</a> The Plant Cell. 23 (11), 3893-3910 (2011).</li><li>Sakai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser-assisted+microdissection+(LAM)+and+RNA-seq+allows+to+perform+a+comprehensive+transcriptomic+analysis+of+epidermal+cells+of+Arabidopsis+embryo.">Combining laser-assisted microdissection (LAM) and RNA-seq allows to perform a comprehensive transcriptomic analysis of epidermal cells of Arabidopsis embryo.</a> Plant Methods. 14 (1), 10 (2018).</li><li>Zhan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Sequencing+of+Laser-Capture+Microdissected+compartments+of+the+maize+kernel+identifies+regulatory+modules+associated+with+endosperm+cell+differentiation.">RNA Sequencing of Laser-Capture Microdissected compartments of the maize kernel identifies regulatory modules associated with endosperm cell differentiation.</a> The Plant Cell. 27 (3), 513-531 (2015).</li><li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines.">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).</li><li>Zeb, Q., Wang, C., Shafiq, S., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Cell Omics. , 101-135 (2019).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana.">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Protocols. 6 (1), 56 (2011).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Ducos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection:+A+powerful+tool+for+genomics+at+cell+level.">Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 5-27 (2018).</li><li>Nelson, T., Tausta, S. L., Gandotra, N., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+plant+tissue:+what+you+see+is+what+you+get.">Laser microdissection of plant tissue: what you see is what you get.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 57, 181-201 (2006).</li><li>Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Be+more+specific!+Laser-assisted+microdissection+of+plant+cells.">Be more specific! Laser-assisted microdissection of plant cells.</a> Trends in Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+obtaining+high+quality+RNA+from+paraffin+sections+of+plant+tissues+by+laser+microdissection.">A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection.</a> Journal of Plant Research. 123 (6), 807-813 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7 (1), 3 (2006).</li><li>Ferreira, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+mRNA+amplification+approach+for+RNAseq+from+limited+amount+of+RNA.">Linear mRNA amplification approach for RNAseq from limited amount of RNA.</a> Gene. 564 (2), 220-227 (2015).</li><li>Schneider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+T7+RNA+polymerase+based+in+vitro+linear+RNA+amplification+for+use+in+microarray+experiments.">Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments.</a> BMC Genomics. 5 (1), 29 (2004).</li><li>Shanker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+RNA+amplification+kits+for+RNA+sequencing+using+very+low+input+amounts+of+total+RNA.">Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), 4 (2015).</li><li>Bhattacherjee, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+fluorescently+labeled+embryonic+cranial+neural+crest+cells.">Laser capture microdissection of fluorescently labeled embryonic cranial neural crest cells.</a> Genesis. 39 (1), 58-64 (2004).</li><li>Cl&#233;ment-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenchymal+Cells+Contribute+to+Lignification+of+Tracheids+in+Developing+Xylem+of+Norway+Spruce.">Parenchymal Cells Contribute to Lignification of Tracheids in Developing Xylem of Norway Spruce.</a> Plant Physiology. 181 (4), 1552-1572 (2019).</li><li>Schad, M., Lipton, M. S., Giavalisco, P., Smith, R. D., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two-dimensional+electrophoresis+and+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+tissue-specific+protein+profiling+of+laser-microdissected+plant+samples.">Evaluation of two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for tissue-specific protein profiling of laser-microdissected plant samples.</a> Electrophoresis. 26 (14), 2729-2738 (2005).</li><li>Schad, M., Mungur, R., Fiehn, O., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+laser+microdissected+vascular+bundles+of+Arabidopsis+thaliana.">Metabolic profiling of laser microdissected vascular bundles of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 1 (1), 2 (2005).</li><li>Latrasse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+epigenetic+regulation+underlying+unisexual+flower+development+in+Cucumis+melo.">The quest for epigenetic regulation underlying unisexual flower development in Cucumis melo.</a> Epigenetics &amp; Chromatin. 10 (1), 22 (2017).</li><li>Turco, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+gene+expression+regulation+associated+with+vascularization+in+Sorghum+bicolor.">DNA methylation and gene expression regulation associated with vascularization in Sorghum bicolor.</a> The New Phytologist. 214 (3), 1213-1229 (2017).</li><li>Gomez, S. K., Harrison, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+and+its+application+to+analyze+gene+expression+in+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">Laser microdissection and its application to analyze gene expression in arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Pest Management Science: Formerly Pesticide Science. 65 (5), 504-511 (2009).</li><li>Roux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+analysis+of+plant+and+bacterial+gene+expression+in+symbiotic+root+nodules+using+laser-capture+microdissection+coupled+to+RNA+sequencing.">An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing.</a> The Plant Journal. 77 (6), 817-837 (2014).</li><li>Tang, W., Coughlan, S., Crane, E., Beatty, M., Duvick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+laser+microdissection+to+in+planta+gene+expression+profiling+of+the+maize+anthracnose+stalk+rot+fungus+Colletotrichum+graminicola.">The application of laser microdissection to in planta gene expression profiling of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (11), 1240-1250 (2006).</li></ol>

Viele gewebespezifische Genexpressionsstudien wurden durch die Handsektion von Proben begrenzt, was zeitaufwändig, arbeitsintensiv ist, ein hohes Kontaminationsrisiko hat und nur Proben verwenden kann, die ein menschlicher Aktivist ausreichend geschickt ernten kann. LCM ist eine präzise und berührungslose Technik, um Zellen aus festen Gewebeabschnitten mithilfe eines mechanisch betriebenen Laserstrahls unter mikroskopischer Visualisierung zu sammeln.
Eine gute Probenvorbereitung ist für LC...

Pflanzenentwicklung und -wachstum beinhalten die koordinierte Wirkung transkriptionsregulatorischer Netzwerke innerhalb verschiedener Zellen, die in einer komplexen zellulären Umgebung existieren. Um die Aktivität dieser regulatorischen Netzwerke zu verstehen, benötigen wir das Wissen über die räumliche und zeitliche Genexpression innerhalb verschiedener Zelltypen über Entwicklungsstadien hinweg. Aufgrund der technischen Herausforderung, eine kleine Anzahl von Zellen zu isolieren und zu analysieren, werden jedoch häufiger Analysen der Genexpression in ganzen Organen oder Massengewebeproben durchgeführt. Die Methode, die wir hier beschreiben, hat es ermöglicht, eine räumliche und zeitliche gewebespezifische Transkriptomanalyse durch Kopplung von LCM mit RNA-seq zu erhalten.
LCM wurde vor zwei Jahrzehnten von Emmert-Buck und Kollegen1entwickelt. Die Technik ermöglichte es den Forschern, Einzelne Zellen oder Zellcluster mithilfe direkter mikroskopischer Visualisierung und Manipulation mit einem schmalen Strahllaser1präzise aus ihrer Umgebung zu isolieren. Seitdem ist die Methode weit verbreitet in der Krebsbiologie und Pathologie2,3. Viele Pflanzenforschungsgruppen haben auch LCM für die Verwendung mit verschiedenen Pflanzenarten und verschiedenen Gewebetypen4,5,6,7,8,9,,10,11angepasst. In jüngster Zeit haben mehrere Papiere auch LCM auf Eudikot und Monocot Samen verwendet, um Embryonen, Endospermen und andere Samenstrukturen während der Samenentwicklung und Keimung10,12,13zu untersuchen. Die meisten anderen häufig verwendeten einzelligen Isolationsmethoden wie Mikropipettieren, Zellsortierung, magnetische Trennung und mikrofluidische Plattformen hängen von der enzymatischen Verdauung oder mechanischen Homogenisierung ab, um Zellen zu dissoziieren. Dies kann die Genexpression stören und technische Artefakte einführen, die die Dateninterpretation verwirren14,15. Diese Methoden erfordern auch Vorkenntnisse über Markergene für jeden Zelltyp, um die dissoziierten Zellen mit ihrer räumlichen Position und ihrem wahren Zelltyp in Beziehung zu setzen. Eine weitere Gruppe von Techniken hängt von der Affinitäts-basierten Isolierung subzellulärer Strukturen anstelle von ganzen Zellen ab, z.B. INTACT (Isolation of Nuclei Tagged in Cell Types) und TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification)16,17. Die Affinitätskennzeichnung und -reinigung von Kernen oder Ribosomen ist jedoch bei Pflanzenarten, die keine gut etablierten Transformationsprotokolle haben, technisch eine Herausforderung. LCM nutzt die schnelle Gewebefixierung, um Transkriptionspiegel und konventionelle histologische Identifikation durch direkte Visualisierung von Zellen innerhalb ihres normalen Gewebe-Organ-Kontextes zu erhalten, wodurch diskrete Zellen in kurzer Zeit isoliert werden können18,19.
Das hier vorgestellte Protokoll ist eine optimierte Methode zur Isolierung bestimmter Zellen oder Zelltypen aus den Gewebeabschnitten von Getreidesamen, die auf die meisten Zellen angewendet werden kann, die histologisch identifiziert werden können. LCM bietet eine kontaktfreie Methode der Zellisolierung, die die Kontamination erheblich reduziert und die Integrität der zurückgewonnenen RNA erhöht. Darüber hinaus veranschaulicht die Methode die Leistungsfähigkeit von LCM in groß angelegten genomweiten Studien, beginnend mit kleinen Mengen biologischer Materialien. Wir beschreiben auch die lineare Amplifikation von RNA zur Erzeugung von ausreichendem Inputmaterial für nachgeschaltete Transkript-/Transkriptomanalysen.
Es gibt zehn Hauptschritte in diesem LCM-RNA-Seq-Protokoll für räumliche und zeitliche gewebespezifische Transkriptome, einschließlich Fixierung von Gewebeproben, Dehydrierung, Paraffinininfiltration, Einbettung, Schnitt, LCM, RNA-Extraktion, RNA-Verstärkung, RNA-Quantifizierung und qRT-PCR und/oder RNA-seq (Abbildung 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61517/61517fig01.jpg"> Abbildung 1: Flussdiagramm von LCM, gefolgt von RNA-seq oder qRT-PCR. LCM ist eine räumlich präzise und berührungslose Technik, um Zellen aus festen Gewebeabschnitten mittels eines Laserstrahls unter mikroskopischer Visualisierung zu sammeln. Der Prozess beginnt mit der Fixierung von Gewebeproben, gefolgt von einer Dehydrierung mit einer Gradientenreihe von Ethanol und Xylol und endet mit Paraffinininfiltration. Der Prozess kann mit hilfe eines Tissueprozessors vollautomatisiert werden. Sobald das Gewebe mit Paraffin infiltriert ist, wird es mit einer Einbettstation in eine Form mit geschmolzenem Paraffin eingebettet. Das Schneiden erfolgt mit Mikrotome auf die gewünschte Dicke eingestellt. Dias werden vorbereitet und LCM unmittelbar vor der RNA aus gefangenen Zellen extrahiert. Auf die RNA-Extraktion folgen direkt zwei Runden RNA-Verstärkung vor qRT-PCR und/oder RNA-seq. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61517/61517fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid 100 % ACS/R.</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td>
			<td>VWRC20104.323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdhesiveCap 200 opaque</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415190-9181-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear base moulds 8 X 10</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3803015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40718-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity RNA ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low&#173;profile disp.blades DB80LS</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14035843489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PEN</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415190-9041-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td>Ambion (ThermoFisher)</td>
			<td>AMB17515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>On-Column DNase I Digestion Set</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNASE70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation RNA-Seq System V2</td>
			<td>NuGen (Integrated Science)</td>
			<td>7102-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin (Surgipath Paraplast)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>ABI (ThermoFisher)</td>
			<td>KIT0214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Ambion (ThermoFisher)</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td>
			<td>VWRC28975.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Benchtop Tissue Processor</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Heated Paraffin Embedding Module</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>EG1150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Cold Plate</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets</td>
			<td>LAF Technologies Pty Ltd</td>
			<td>Safemate 1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fully Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>RM2265</td>
			<td>with PALMRobo v 4.6 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss PALM MicroBeam LCM system</td>
			<td>Zeiss miscroscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-capture microdissection rna-sequencing for spatial and temporal tissue-specific gene expression analysis in plants

Die Entwicklung eines komplexen mehrzelligen Organismus wird von unterschiedlichen Zelltypen bestimmt, die unterschiedliche Transkriptionsprofile aufweisen. Um transkriptionelle regulatorische Netzwerke zu identifizieren, die Entwicklungsprozesse steuern, ist es notwendig, die räumlichen und zeitlichen Genexpressionsprofile dieser einzelnen Zelltypen zu messen. Daher ist die Einsicht in die räumlich-zeitliche Kontrolle der Genexpression unerlässlich, um zu verstehen, wie biologische und Entwicklungsprozesse reguliert werden. Hier beschreiben wir eine Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) Methode, um eine kleine Anzahl von Zellen aus drei Gersten-Embryo-Organen während eines Zeitverlaufs während der Keimung zu isolieren, gefolgt von Transkriptprofilierung. Die Methode besteht aus Gewebefixierung, Gewebeverarbeitung, Paraffineinbettung, Schnitt, LCM und RNA-Extraktion, gefolgt von Echtzeit-PCR oder RNA-Seq. Diese Methode hat es uns ermöglicht, räumliche und zeitliche Profile von Samenorgan-Transkriptomen aus unterschiedlicher Anzahl von Zellen (Zehn bis Hunderte) zu erhalten, was eine viel größere Gewebespezifität als typische Massengewebeanalysen bietet. Aus diesen Daten konnten wir transkriptionelle regulatorische Netzwerke definieren und vergleichen sowie kandidatenregulatorische Transkriptionsfaktoren für einzelne Gewebe vorhersagen. Die Methode sollte auf andere Pflanzengewebe mit minimaler Optimierung anwendbar sein.

Mit unserem LCM RNA-seq-Protokoll10haben wir räumliche und zeitliche gewebespezifische Transkriptome aus Gerstensamen während der Keimung erzeugt. Die Studie wurde durchgeführt, indem LCM RNA-seq auf eine kleine Anzahl von Zellen aus drei Embryoorganen (Plumule, Radicle Tip, Scutellum) alle 8 h über einen 48 h-Zeitverlauf während der Keimung (0-48 h, 7 Zeitpunkte) angewendet wurde (Abbildung 2A,B).
<p class="jove_content" fo:keep-together.wit...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants at JoVE.com

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

Hier wird ein Protokoll zur Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) von Pflanzengeweben vorgestellt. LCM ist eine mikroskopische Technik zur kontaminationsfreien Isolierung von Gewebebereichen. Das Verfahren umfasst Gewebefixierung, Paraffineinbettung, Schnitt, LCM und RNA-Extraktion. RNA wird in der nachgeschalteten gewebespezifischen, zeitlich aufgelösten Analyse von Transkriptomen eingesetzt.

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequenzierung für räumliche und zeitliche gewebespezifische Genexpressionsanalyse in Pflanzen

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Dieses Protokoll verwendet Laser-Capture Microdissection gekoppelt mit RNA-Sequenzierung, um räumliche und zeitliche Transkriptome von bestimmten Zellen in Interessenpflanzen zu erhalten, wobei kleine Mengen biologischer Materialien verwendet werden. Der Hauptvorteil der Lasertechnik besteht darin, dass sie die direkte Visualisierung von Zellen im normalen Gewebekontext erleichtert, so dass die diskreten Zellen berührungslos präzise isoliert werden können. Obwohl dieses Protokoll für die Isolierung von Pflanzenzellen optimiert ist, kann es auf die meisten Zellen angewendet werden, die stologisch identifiziert werden können.Eine gute Probenvorbereitung ist entscheidend. Daher ist eine, die diese Technik zum ersten Mal durchführt, die Stützoptimierung der Gewebefixierung und der Einbettung vor der Laser-Capture Microdissection wichtig. Vor dem Sammeln der Gewebeprobe, bereiten Sie ein Fixativ entsprechend der Art und Gewebetyp zu ernten.Bei Gerstensamen die Samenproben halbieren, bevor Sie die Proben in mindestens ein 10-fache Eiskaltfixierungsvolumen untertauchen. Verwenden Sie Vakuuminfiltration, um das Eindringen des Fixiativs zu beschleunigen. Das Gewebe sollte am Ende der Infiltration sinken, dann das Fixativ für eine nächtliche Inkubation auffrischen und die Proben in Kassetten für die Gewebeverarbeitung übertragen.Legen Sie die mit Gewebe beladenen Kassetten in den Metallkorb eines automatischen Prozessors und befestigen Sie den Metallkorb an seinem Halter über Kammer eins. Stellen Sie das Programm auf den Bedienfeldern des Tissueprozessors ein und drücken Sie den Start, um das automatische Verarbeitungsprogramm zu starten. Das System dehydriert die Proben, indem es die Kassetten für 90 Minuten pro Konzentration in eine Gradientenserie von Ethanol eintaucht, wie angegeben.Nach dem letzten Ethanol-Eintauchen taucht das System die Proben wie angegeben 90 Minuten pro Lösung in Xylol-Gradienten unter. Gefolgt von 290 Minuten Eintauchen in geschmolzenes Paraffin bei 55 bis 60 Grad Celsius. Am nächsten Morgen entfernen Sie die paraffininierten Kassetten aus dem Gewebeprozessor und fahren Sie zur Paraffineinbettung fort.Verwenden Sie am nächsten Morgen feine Zangen, um die Prozessproben in entsprechend große Formen zu übertragen und geschmolzenes Paraffin über jede Probe zu geben. Bei Gerstensamen die Proben im Paraffin längs an der Schnittrichtung ausrichten, um den Erwerb von Längsschnitten zu erleichtern. Legen Sie eine saubere Kassette auf die Form und stellen Sie sicher, dass die gesamte Kassette vollständig mit einer ausreichenden Menge Paraffin bedeckt ist, um das Sample an der Kassette zu befestigen.Legen Sie die Form dann 10 bis 20 Minuten auf eine kalte Platte, bis das Paraffin eingestellt ist, bevor Sie den Block aus der Form lösen. Um eine PEN-Membran-Folien vorzubereiten, tauchen Sie die Dias für drei Sekunden in die RNS-Deaktivierungslösung ein, gefolgt von zwei kurzen Wäbungen und DEPC-behandeltem Wasser. Fahren Sie dann die Dias in einem 370 Grad Celsius Inkubator, um jede übrig gebliebene Lösung zu entfernen und UV behandeln Sie die Dias in einem laminaren Strömungsschrank für 30 Minuten, um ihre Paraffin nicht Haselnüsse zu verbessern.Für eine Probengewebesektion die Paraffinblöcke auf die kalte Platte legen und das Wasserbad mit dem DEPC-behandelten Wasser füllen, dann auf 42 Grad Celsius erwärmen. Schneiden Sie die Blöcke auf die Tiefe des Interessenbereichs und schneiden Sie die Paraffinblöcke auf eine Dicke von sechs bis zehn Mikrometern. Ein gut geschnittener Block bildet ein Band am Rand der Klinge.Verwenden Sie eine feine Pinzette, um Bänder sanft vom Mikrotome in das Wasserbad zu übertragen, wobei darauf zu achten ist, dass das Band flach auf der Wasseroberfläche liegt. Um die Abschnitte zu sammeln, halten Sie eine Rutsche in einem 45-Grad-Winkel, verwenden Sie eine Aufwärtsbewegung, um ein Band aus dem Wasser auf die Rutsche zu heben und verwenden Sie ein fusselfreies Gewebe, um das überschüssige Wasser vorsichtig zu entfernen. Wenn alle Abschnitte gesammelt wurden, waschen Sie die Dias mit 320 Sekunden Wäsche in Xylol, gefolgt von 230 Sekunden Wäsche in 100%Ethanol und 230 Sekunden Waschen in 70% Ethanol.Um Zellen von Interesse aus den entparraffinierten und trockenen Gewebeabschnitten zu mikrosektieren, legen Sie die Schlitten auf die drei LCM-Mikroskopschlitze und das Lastsammelrohr in die verfügbaren Schlitze. Bewegen Sie die Stufe, um den Bereich der Probe zu lokalisieren, der geschnitten werden muss, und schneiden Sie ein leeres Segment frei von Gewebe auf dem Membranschlitten. Optimierung der Schnittgeschwindigkeit und des Schneidens im Laserdruck katapultieren Energie und Fokus.Verwenden Sie die Zeichenwerkzeuge, um den Bereich des Interesses am Gewebe zu skizzieren und die optimierten Parameter und die Robo LPC-Funktion zu verwenden, um Zellen in die Klebekappen zu katapultieren. Wählen Sie Flag aus der Elementliste aus, um das Flag-Tool zum Markieren der interessenden Regionen zu verwenden. Überprüfen Sie die Kappenprüftaste, um die Klebekappe zu überprüfen, um zu bestätigen, dass die Proben entnommen wurden.Typischerweise sind 10 bis 15 Abschnitte pro Kappe für die RNA-Extraktion erforderlich. Unmittelbar nachdem alle Proben erworben wurden, gehen Sie sofort zur RNA-Extraktion, um einen RNA-Abbau zu vermeiden. Nach der RNA-Extraktion und RNA-Verstärkung verwenden Sie ein automatisiertes Elektrophorese-System, nach den Anweisungen des Herstellers, um die Antisense-RNA zu quantifizieren und zu qualifizieren.In dieser Studie, LCM, RNA-Sequenzierung wurde auf eine kleine Anzahl von Zellen aus drei Embryo-Organen angewendet, alle acht Stunden über einen 48-Stunden-Zeitkurs während der Keimung. Es ist wichtig, die Schnittparameter richtig einzustellen, damit das Gewebe von Interesse präzise geschnitten und aus dem umgebenden Gewebe entfernt werden kann, ohne den Rand des ausgewählten Bereichs zu verbrennen. Die Verzweigung der gesamten RNA vor der RNA-Verstärkung ermöglicht den Nachweis von unterschiedlichen elektrophoretischen Bändern und Fluoreszenzspitzen von 18 und 28S ribosomalen Untereinheiten in hochwertigen RNA-Proben.Erfolgreich synthetisierte Antisense-RNA wird eine unimodale symmetrische Größenverteilung von 100 bis 1000 Nukleotiden mit einem Spitzenwert von etwa 300 Nukleotiden nach zwei Verstärkerrunden aufweisen. Die mehrdimensionale Maßstabsdarstellung von Genen, die in den verschiedenen Geweben über 48 Stunden Keimung exprimiert werden, veranschaulicht eine größere Ähnlichkeit zwischen Proben eines einzelnen Gewebes als zwischen Proben aus demselben Zeitpunkt, aber unterschiedlichen Geweben. Die Anzahl der differenziell exprimierten Gene nimmt im Laufe der Keimung in jedem Gewebe im Verhältnis zum Null-Stunden-Zeitpunkt des Gewebes schrittweise zu.In dieser repräsentativen Analyse wurden 25 % der Plumule, 34 % der Radikel und 41 % der scutellum differenziell exprimierten Gene ausschließlich in jedem Gewebe exprimiert. Es ist wichtig, die Schnittparameter für eine präzise Ausscheidung und Abscheidung des Selektorbereichs aus dem umgebenden Gewebe korrekt einzustellen, ohne den Rand des ausgewählten Bereichs zu verbrennen. Mit verbesserten Chromatin- und Proteinreinigungsmethoden und einem verbesserten Massenspektrometrie-Instrument kann LCM für zelltypspezifische epigenomische und Proteomik-Studienimplantate verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser Capture Mikrodissektion von Säugetiergewebe

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Forschung

Biologie

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 3

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...