Name: laser-capture microdissection rna-sequencing for spatial and temporal tissue-specific gene expression analysis in plants
Uploaded: 2020-08-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מרכז מועצת המחקר האוסטרלית למצוינות בביולוגיה של אנרגיה צמחית (CE140100008) עד JW. M.G.L נתמך על ידי מענק מתחיל של אוניברסיטת לה טרוב. אנו מודים לפלטפורמת הגנומיקה La Trobe על תמיכתם בהנחיתות גבוהות וניתוח נתונים. אנו מודים לפרופסור מת'יו טאקר על ייעוץ מומחה להקמת LCM במעבדה שלנו.

כמו המוצר הסופי הוא RNA, לדאוג להימנע מזהם את העבודה עם RNases. לבישת כפפות היא חובה. השתמש diethyl pyrocarbonate (DEPC) -מטופלים מים, מאגרים, וכו '. אוטוקלב מאגרים ואופים כלי זכוכית לפני השימוש.
1. קיבעון רקמות
<ol><li>להכין קיבעון של בחירה בהתאם לסוגי מינים ורקמות; עבור זרעי שורה, להשתמש קיבעון של...

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Alevizos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+cancer+in+vivo+gene+expression+profiling+assisted+by+laser+capture+microdissection+and+microarray+analysis.">Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis.</a> Oncogene. 20 (43), 6196-6204 (2001).</li><li>Cong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+follicular+lymphoma:+description+and+analysis+by+laser+capture+microdissection.">In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection.</a> Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 99 (9), 3376-3382 (2002).</li><li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+protocol+for+xylem+tissues+of+woody+plants.">Laser capture microdissection protocol for xylem tissues of woody plants.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 1965 (2017).</li><li>Casson, S., Spencer, M., Walker, K., Lindsey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+for+the+analysis+of+gene+expression+during+embryogenesis+of+Arabidopsis.">Laser capture microdissection for the analysis of gene expression during embryogenesis of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 42 (1), 111-123 (2005).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LCM-seq+reveals+the+crucial+role+of+LsSOC1+in+heat-promoted+bolting+of+lettuce+(Lactuca+sativa+L.).">LCM-seq reveals the crucial role of LsSOC1 in heat-promoted bolting of lettuce (Lactuca sativa L.).</a> The Plant Journal. 95 (3), 516-528 (2018).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+atlas+of+rice+cell+types+uncovers+cellular,+functional+and+developmental+hierarchies.">A transcriptome atlas of rice cell types uncovers cellular, functional and developmental hierarchies.</a> Nature Genetics. 41 (2), 258-263 (2009).</li><li>Kivivirta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+laser+microdissection+(LMD)+followed+by+transcriptome+analysis+of+plant+reproductive+tissue+in+phylogenetically+distant+angiosperms.">A protocol for laser microdissection (LMD) followed by transcriptome analysis of plant reproductive tissue in phylogenetically distant angiosperms.</a> Plant Methods. 15 (1), 1-11 (2019).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+dynamics+of+the+maize+leaf+transcriptome.">The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome.</a> Nature Genetics. 42 (12), 1060-1067 (2010).</li><li>Liew, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+tissue-specific+regulation+of+transcriptomes+during+barley+(Hordeum+vulgare)+seed+germination.">Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination.</a> The Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).</li><li>Matas, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-and+cell-type+specific+transcriptome+profiling+of+expanding+tomato+fruit+provides+insights+into+metabolic+and+regulatory+specialization+and+cuticle+formation.">Tissue-and cell-type specific transcriptome profiling of expanding tomato fruit provides insights into metabolic and regulatory specialization and cuticle formation.</a> The Plant Cell. 23 (11), 3893-3910 (2011).</li><li>Sakai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser-assisted+microdissection+(LAM)+and+RNA-seq+allows+to+perform+a+comprehensive+transcriptomic+analysis+of+epidermal+cells+of+Arabidopsis+embryo.">Combining laser-assisted microdissection (LAM) and RNA-seq allows to perform a comprehensive transcriptomic analysis of epidermal cells of Arabidopsis embryo.</a> Plant Methods. 14 (1), 10 (2018).</li><li>Zhan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Sequencing+of+Laser-Capture+Microdissected+compartments+of+the+maize+kernel+identifies+regulatory+modules+associated+with+endosperm+cell+differentiation.">RNA Sequencing of Laser-Capture Microdissected compartments of the maize kernel identifies regulatory modules associated with endosperm cell differentiation.</a> The Plant Cell. 27 (3), 513-531 (2015).</li><li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines.">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).</li><li>Zeb, Q., Wang, C., Shafiq, S., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Cell Omics. , 101-135 (2019).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana.">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Protocols. 6 (1), 56 (2011).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Ducos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection:+A+powerful+tool+for+genomics+at+cell+level.">Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 5-27 (2018).</li><li>Nelson, T., Tausta, S. L., Gandotra, N., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+plant+tissue:+what+you+see+is+what+you+get.">Laser microdissection of plant tissue: what you see is what you get.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 57, 181-201 (2006).</li><li>Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Be+more+specific!+Laser-assisted+microdissection+of+plant+cells.">Be more specific! Laser-assisted microdissection of plant cells.</a> Trends in Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+obtaining+high+quality+RNA+from+paraffin+sections+of+plant+tissues+by+laser+microdissection.">A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection.</a> Journal of Plant Research. 123 (6), 807-813 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7 (1), 3 (2006).</li><li>Ferreira, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+mRNA+amplification+approach+for+RNAseq+from+limited+amount+of+RNA.">Linear mRNA amplification approach for RNAseq from limited amount of RNA.</a> Gene. 564 (2), 220-227 (2015).</li><li>Schneider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+T7+RNA+polymerase+based+in+vitro+linear+RNA+amplification+for+use+in+microarray+experiments.">Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments.</a> BMC Genomics. 5 (1), 29 (2004).</li><li>Shanker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+RNA+amplification+kits+for+RNA+sequencing+using+very+low+input+amounts+of+total+RNA.">Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), 4 (2015).</li><li>Bhattacherjee, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+fluorescently+labeled+embryonic+cranial+neural+crest+cells.">Laser capture microdissection of fluorescently labeled embryonic cranial neural crest cells.</a> Genesis. 39 (1), 58-64 (2004).</li><li>Cl&#233;ment-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenchymal+Cells+Contribute+to+Lignification+of+Tracheids+in+Developing+Xylem+of+Norway+Spruce.">Parenchymal Cells Contribute to Lignification of Tracheids in Developing Xylem of Norway Spruce.</a> Plant Physiology. 181 (4), 1552-1572 (2019).</li><li>Schad, M., Lipton, M. S., Giavalisco, P., Smith, R. D., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two-dimensional+electrophoresis+and+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+tissue-specific+protein+profiling+of+laser-microdissected+plant+samples.">Evaluation of two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for tissue-specific protein profiling of laser-microdissected plant samples.</a> Electrophoresis. 26 (14), 2729-2738 (2005).</li><li>Schad, M., Mungur, R., Fiehn, O., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+laser+microdissected+vascular+bundles+of+Arabidopsis+thaliana.">Metabolic profiling of laser microdissected vascular bundles of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 1 (1), 2 (2005).</li><li>Latrasse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+epigenetic+regulation+underlying+unisexual+flower+development+in+Cucumis+melo.">The quest for epigenetic regulation underlying unisexual flower development in Cucumis melo.</a> Epigenetics &amp; Chromatin. 10 (1), 22 (2017).</li><li>Turco, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+gene+expression+regulation+associated+with+vascularization+in+Sorghum+bicolor.">DNA methylation and gene expression regulation associated with vascularization in Sorghum bicolor.</a> The New Phytologist. 214 (3), 1213-1229 (2017).</li><li>Gomez, S. K., Harrison, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+and+its+application+to+analyze+gene+expression+in+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">Laser microdissection and its application to analyze gene expression in arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Pest Management Science: Formerly Pesticide Science. 65 (5), 504-511 (2009).</li><li>Roux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+analysis+of+plant+and+bacterial+gene+expression+in+symbiotic+root+nodules+using+laser-capture+microdissection+coupled+to+RNA+sequencing.">An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing.</a> The Plant Journal. 77 (6), 817-837 (2014).</li><li>Tang, W., Coughlan, S., Crane, E., Beatty, M., Duvick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+laser+microdissection+to+in+planta+gene+expression+profiling+of+the+maize+anthracnose+stalk+rot+fungus+Colletotrichum+graminicola.">The application of laser microdissection to in planta gene expression profiling of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (11), 1240-1250 (2006).</li></ol>

מחקרים רבים ביטוי גנים ספציפיים לרקמות הוגבלו על ידי ניתוח יד של דגימות, אשר גוזל זמן, עבודה אינטנסיבית, יש סיכון גבוה של זיהום והוא יכול רק לנצל דגימות כי פעיל אנושי הוא מספיק מיומן לקצור. LCM היא טכניקה מדויקת ונלויה במגע לאיסוף תאים מקטעי רקמות קבועות באמצעות קרן לייזר המופעלת מכנית תחת ה?...

פיתוח צמחים וצמיחה כרוכים בפעולה מתואמת של רשתות רגולטוריות שעתוק בתוך תאים שונים הקיימים בסביבה סלולרית מורכבת. כדי להבין את הפעילות של רשתות רגולטוריות אלה, אנו דורשים את הידע של ביטוי גנים מרחבי וזמן בתוך סוגי תאים שונים על פני שלבים התפתחותיים. עם זאת, ניתוחים של ביטוי גנים מתבצעים בדרך כלל באיברים שלמים או דגימות רקמות בתפזורת בשל האתגר הטכני של בידוד וניתוח של מספר קטן של תאים. השיטה שאנו מתארים כאן אפשרה להשיג ניתוח תמלול ספציפי לרקמות מרחביות וזקופיות על ידי צימוד LCM עם RNA-seq.
LCM פותחה לפני שני עשורים על ידי אמרט-באק ועמיתיו1. הטכניקה אפשרה לחוקרים לבודד במדויק תאים בודדים או אשכולות של תאים מהסביבה שלהם באמצעות הדמיה מיקרוסקופית ישירה ומניפולציה עם לייזר קרןצרה 1. מאז השיטה שימשה באופן נרחב בביולוגיה סרטן ופתולוגיה2,3. קבוצות מחקר צמחים רבות גם התאימו LCM לשימוש עם מיניצמחים שונים וסוגי רקמות שונים 4,,5,,6,,7,,8,,9,,10,,11. לאחרונה, מספר ניירות השתמשו גם LCM על זרעי אפדו ומונוקוט כדי ללמוד עובר, אנדוספרמים ומבנים זרעים אחרים במהלך פיתוחזרע ונביטה 10,12,13. רוב שיטות הבידוד האחרות הנפוצות של תאים בודדים כגון מיקרו-צנרת, מיון תאים, הפרדה מגנטית ופלטפורמות מיקרו-נוזלים תלויות בעיכול אנזימטי או הומוגניזציה מכנית כדי לנתק תאים. זה עלול לפוג ביטוי גנים, הצגת חפצים טכניים כי פרשנות נתוניםמבלבלים 14,15. שיטות אלה דורשות גם ידע קודם של גנים סמן עבור כל סוג תא לקשר את התאים התנתקו למיקום המרחבי שלהם וסוג תא אמיתי. קבוצה נוספת של טכניקות תלויה בבידוד מבוסס זיקה של מבנים תת תאיים במקום תאים שלמים, למשל INTACT (בידוד של Nuclei מתויג בסוגי תאים) ו TRAP (תרגום טיהור זיקה ריבוזום)16,17. עם זאת, תיוג זיקה וטיהור של גרעין או ריבוזומים הם מאתגרים מבחינה טכנית במין צמחים שאין להם פרוטוקולי טרנספורמציה מבוססים היטב. LCM מנצל קיבעון רקמות מהיר כדי לשמר את רמות התמליל וזיהוי היסטולוגי קונבנציונלי על ידי הדמיה ישירה של תאים בתוך הקשר הרקמה / איבר הרגיל שלהם, המאפשר תאים דיסקרטיים להיות מבודדבפרק זמן קצר של 18,19.
הפרוטוקול המוצג כאן הוא שיטה ממוטבת לבידוד של תאים ספציפיים או סוגי תאים מקטעי הרקמה של זרעי דגנים, אשר ניתן להחיל על רוב התאים שניתן לזהות היסטולוגית. LCM מספק שיטה ללא מגע של בידוד תאים, צמצום משמעותי של זיהום והגדלת שלמות של RNA התאושש. יתר על כן, השיטה ממחישה את העוצמה של LCM על מחקרים רחבים גנום בקנה מידה גדול החל בכמויות קטנות של חומרים ביולוגיים. אנו גם מתארים את ההגדלה ליניארית של RNA ליצירת חומר קלט מספיק עבור ניתוחי תעתיק/תעתיק במורד הזרם.
ישנם עשרה שלבים עיקריים בפרוטוקול LCM RNA-seq זה עבור תעתיקים מרחביים ורקתיים ספציפיים לרקמות, כולל קיבעון של דגימות רקמה, התייבשות, חדירת פרפין, הטבעה, מקטע, LCM, חילוץ RNA, התעצמות RNA, כימות RNA ו- qRT-PCR ו/או RNA-seq(איור 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61517/61517fig01.jpg"> איור 1: תרשים זרימה של LCM ואחריו RNA-seq או qRT-PCR. LCM היא טכניקה מרחבית מדויקת ונחינם במגע כדי לאסוף תאים מקטעי רקמה קבועה באמצעות קרן לייזר תחת הדמיה מיקרוסקופית. התהליך מתחיל עם קיבעון של דגימות רקמה, ואחריו התייבשות באמצעות סדרה הדרגתית של אתנול ותו לא, וסיים עם הסתננות פרפין. התהליך יכול להיות אוטומטי לחלוטין באמצעות מעבד רקמות. ברגע שהרקמות מסתננות עם פרפין, היא מוטבעת בתבנית עם פרפין מותך באמצעות תחנת הטבעה. המקטע מתבצע באמצעות מיקרוטומי מוגדר לעובי הרצוי. שקופיות מוכנות LCM שנערך מיד לפני RNA הוא להיות מופק מתאי שנתפסו. חילוץ RNA מלווה ישירות על ידי שני סיבובים של הגברת RNA לפני qRT-PCR ו /או RNA-seq. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61517/61517fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid 100 % ACS/R.</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td>
			<td>VWRC20104.323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdhesiveCap 200 opaque</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415190-9181-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear base moulds 8 X 10</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3803015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40718-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity RNA ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low&#173;profile disp.blades DB80LS</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14035843489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PEN</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415190-9041-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td>Ambion (ThermoFisher)</td>
			<td>AMB17515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>On-Column DNase I Digestion Set</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNASE70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation RNA-Seq System V2</td>
			<td>NuGen (Integrated Science)</td>
			<td>7102-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin (Surgipath Paraplast)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>ABI (ThermoFisher)</td>
			<td>KIT0214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Ambion (ThermoFisher)</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td>
			<td>VWRC28975.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Benchtop Tissue Processor</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Heated Paraffin Embedding Module</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>EG1150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Cold Plate</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets</td>
			<td>LAF Technologies Pty Ltd</td>
			<td>Safemate 1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fully Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>RM2265</td>
			<td>with PALMRobo v 4.6 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss PALM MicroBeam LCM system</td>
			<td>Zeiss miscroscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-capture microdissection rna-sequencing for spatial and temporal tissue-specific gene expression analysis in plants

הפיתוח של אורגניזם רב-תאי מורכב נשלט על ידי סוגי תאים שונים בעלי פרופילים תמלול שונים. כדי לזהות רשתות רגולטוריות שעתוק השולטות בתהליכים התפתחותיים, יש צורך למדוד את פרופילי ביטוי הגנים המרחביים והזמניים של סוגי תאים בודדים אלה. לכן, תובנה על השליטה spatio-זמני של ביטוי גנים היא חיונית כדי לקבל הבנה של איך תהליכים ביולוגיים והתפתחותיים מוסדרים. כאן, אנו מתארים שיטת microdissection לכידת לייזר (LCM) כדי לבודד מספר קטן של תאים משלושה איברי עובר שאורה על פני קורס זמן במהלך נביטה ואחריו פרופיל תעתיק. השיטה מורכבת קיבעון רקמות, עיבוד רקמות, הטבעת פרפין, מקטע, LCM וחילוץ RNA ואחריו PCR בזמן אמת או RNA-seq. שיטה זו אפשרה לנו להשיג פרופילים מרחביים וזמניים של תמלול איברים זרעים ממספרים שונים של תאים (עשרות עד מאות), מתן ספציפיות רקמות הרבה יותר גדול מאשר ניתוחים טיפוסיים של רקמות בתפזורת. מנתונים אלה הצלחנו להגדיר ולהשוות רשתות רגולטוריות שעתוק, כמו גם לחזות גורמי שעתוק רגולטורי מועמד עבור רקמות בודדות. השיטה צריכה להיות ישימה לרקמות צמח אחרות עם אופטימיזציה מינימלית.

יצרנו תעתיקים מרחביים וזמניים ספציפיים לרקמות מזרעי שורה במהלך נביטה באמצעות פרוטוקול RNA-seq LCMשלנו 10. המחקר בוצע על ידי החלת LCM RNA-seq על מספר קטן של תאים משלושה איברי עובר (plumule, קצה רדיק, scutellum) כל 8 שעות על 48 שעות כמובן זמן במהלך נביטה (0-48 שעות, 7 נקודות זמן) (איור 2<stron...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants at JoVE.com

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

מוצג כאן פרוטוקול עבור microdissection לכידת לייזר (LCM) של רקמות צמח. LCM היא טכניקה מיקרוסקופית לבידוד אזורים של רקמות באופן ללא זיהום. ההליך כולל קיבעון רקמות, הטמת פרפין, מקטע, LCM וחילוץ RNA. RNA משמש במורד הזרם ספציפי רקמה, ניתוח נפתר זמנית של transcriptomes.

לכידת לייזר מיקרודיסציה RNA-רצף לניתוח ביטוי גנים ספציפי רקמה מרחבית וזמנית בצמחים

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

פרוטוקול זה משתמש במיקרו-דיסקטמנט לכידת לייזר יחד עם רצף RNA כדי להשיג תעתיקים מרחביים ותעתיקים זמניים מתאים ספציפיים בצמחים בעלי תחומי עניין, תוך שימוש בכמויות קטנות של חומרים ביולוגיים. היתרון העיקרי של טכניקת הלייזר הוא שהיא מקלה על הדמיה ישירה של תאים בהקשר של רקמות נורמליות, ומאפשרת לתאים הדיסקרטיים להיות מבודדים במדויק באופן חופשי ממגע. למרות פרוטוקול זה ממוטב לבידוד של תאי צמח, זה יכול להיות מיושם על רוב התאים שניתן לזהות stologically.הכנת מדגם טובה היא קריטית. לכן, אחד ביצוע טכניקה זו בפעם הראשונה, אופטימיזציה של קיבוע הרקמה ואת הטבעה חשוב לפני לייזר לכידת מיקרודיסקציה. לפני איסוף דגימת הרקמה, להכין תיקון מתאים למינים וסוג הרקמה להיות שנקטפו.עבור זרעי שעורה, לחתוך את דגימות הזרעים לשניים לפני שקוע הדגימות לתוך לפחות 10 X נפח של קרח קר תיקון. השתמש חדירת ואקום כדי להאיץ את החדירה של התיקון. הרקמה צריכה לשקוע עד סוף החדירה, ואז לרענן את התיקון עבור דגירה לילה ולהעביר את הדגימות לתוך קלטות לעיבוד רקמות.מניחים את קלטות טעונה רקמה לתוך סל המתכת של מעבד אוטומטי ולחבר את סל המתכת למחזיק שלה מעל התא אחד. הגדר את התוכנית בלוחות הבקרה של מעבד הרקמות ולחץ להתחיל את תוכנית העיבוד האוטומטי. המערכת תייבש את הדגימות על ידי טבילת הקלטות לתוך סדרה הדרגתית של אתנול במשך 90 דקות לכל ריכוז כפי שצוין.לאחר טבילת האתנול האחרונה, המערכת תטביע את הדגימות בשיפוע קסילן למשך 90 דקות לכל פתרון כמצוין. ואחריו טבילה של 290 דקות בפרפין מותך ב-55 עד 60 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, להסיר את הקלטות הסתנן פרפין ממעבד הרקמות ולהמשיך להטמיע פרפין.למחרת בבוקר, השתמש במטסים עדין כדי להעביר את דגימות התהליך לתבניות בגודל מתאים ולהוסיף פרפין מותך על כל מדגם. עבור זרעי שעורה, לכוון את הדגימות בפרפין longitudinally לכיוון החיתוך כדי להקל על רכישת סעיפים אורך. מניחים קלטת נקייה על התבנית ומבטיחים כי הקלטת כולה מכוסה במלואה עם נפח מספיק של פרפין כדי לאבטח את הדגימה לקלטת.לאחר מכן מניחים את התבנית על צלחת קרה במשך 10 עד 20 דקות עד הפרפין מוגדר לפני שחרור הבלוק מן התבנית. כדי להכין שקופיות ממברנה PEN, להטביע את השקופיות ב פתרון השבתת RNS במשך שלוש שניות ואחריו שתי שטיפות קצרות ומים מטופלים DEPC. ואז לנהוג במגלשות באינקובטור 370 מעלות צלזיוס כדי להסיר כל פתרון שאריות UV לטפל שקופיות ארון זרימה למינאר במשך 30 דקות כדי לשפר את הפרפין שלהם לא אגוזי לוז.עבור רקמה מדגם ניתוב מקום גושי פרפין על הצלחת הקרה ולמלא את אמבט המים עם מים מטופלים DEPC, ולאחר מכן חם עד 42 מעלות צלזיוס. חותכים בלוקים לעומק אזור העניין וחותכים את גושי הפרפין לעובי של 6 עד 10 מיקרון. בלוק חתוך היטב יהיה ליצור סרט בקצה הלהב.השתמש פינצטה בסדר להעביר בעדינות סרטים מן microtome לאמבט המים, דואג כי הסרט שוכב שטוח על פני המים. כדי לאסוף את החלקים, מחזיק שקופית בזווית של 45 מעלות, השתמש בתנועה כלפי מעלה כדי להרים סרט מהמים אל המגלשה ולהשתמש ברקמה חופשית מוך כדי להסיר בזהירות את המים העודפים. כאשר כל החלקים נאספו, לשטוף את השקופיות עם 320 שטיפות השני קסילן ואחריו 230 שניות שוטף ב 100% אתנול ו 230 שטיפות השני ב 70%אתנול.כדי מיקרודיסקט תאים מעניינים מן מקטעי רקמות deparraffinized ויבש, לטעון שקופיות על שלושת חריצי מיקרוסקופ LCM וצינור איסוף עומס לתוך החריצים הזמינים. להזיז את הבמה כדי לאתר את האזור של המדגם כי צריך להיות חתוך לחתוך קטע ריק ללא רקמה על שקופית הממברנה. כדי לייעל את מהירות החיתוך ואת החיתוך בלחץ לייזר מעוט אנרגיה ומיקוד.השתמש בכלי הציור כדי לתאר את אזור העניין ברקמה ולהשתמש בפרמטרים הממוטבים ובפונקציה Robo LPC כדי להזניק תאים לתוך מכסות דבק. בחר דגל מרשימת הרכיבים כדי להשתמש בכלי הדגל כדי לסמן את אזורי העניין. בדוק את כפתור בדיקת המכסה כדי לבדוק את מכסה דבק, כדי לוודא כי הדגימות נלכדו.בדרך כלל 10 עד 15 חלקים לכל כובע נדרשים עבור מיצוי RNA. מיד לאחר כל הדגימות נרכשו, להמשיך מיד מיצוי RNA, כדי למנוע השפלה RNA. לאחר מיצוי RNA והגברה RNA להשתמש במערכת אלקטרופורזה אוטומטית, על פי הוראות היצרן לכמת ולהעפיל RNA antisense.במחקר זה, LCM, ריצוף RNA הוחל על מספר קטן של תאים משלושה איברי עובר, כל שמונה שעות על פני קורס זמן של 48 שעות במהלך הנביטה. חשוב להתאים את פרמטרי החיתוך בצורה נכונה כדי לאפשר לרקמת העניין להיחתך ולפרוק במדויק מהרקמות שמסביב מבלי לשרוף את קצה האזור הנבחר. ההשלכות של RNA הכולל לפני הגברה RNA מאפשר זיהוי של להקות אלקטרופורטיות ברורות פסגות פלואורסצנטיות של 18 ו 28S תת-יוניות ריבוזומליות בדגימות RNA באיכות טובה.RNA אנטיסנס מסונתז בהצלחה יציג התפלגות גודל סימטרי unimodal מ 100 כדי 1000 נוקלאוטידים עם שיא סביב 300 נוקלאוטידים לאחר שני סיבובים של הגברה. התוויית סולם רב מימדי של גנים לידי ביטוי ברקמות השונות מעל 48 שעות של נביטה, ממחישה דמיון גדול יותר בין דגימות של רקמה אחת מאשר בין דגימות מאותה נקודת זמן, אבל רקמות שונות. מספר הגנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי עולה בהדרגה במהלך הנביטה בכל רקמה ביחס לנקודת הזמן של שעת האפס של הרקמה.בניתוח מייצג זה, 25% של פלומול, 34% של radicle ו 41% של scutellum גנים מבוטאים באופן דיפרנציאלי נמצאו לידי ביטוי באופן בלעדי בתוך כל רקמה. חשוב להתאים כראוי את פרמטרי החיתוך עבור כריתה מדויקת ופריקת אזור הבורר מהרקמות שמסביב מבלי לשרוף את קצה האזור הנבחר. עם שיטות משופרות לטיהור כרומטין וחלבונים, ולשפר את מכשיר ספקטרומטריית המסה, LCM יכול לשמש עבור סוג התא ספציפי אפיגנומי ופרוטאומיקה מחקרים שתלים.

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

לייזר Microdissection לכידה של רקמות היונקים

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 3

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...