Name: laser-capture microdissection rna-sequencing for spatial and temporal tissue-specific gene expression analysis in plants
Uploaded: 2020-08-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Australian Research Council Centre of Excellence in Plant Energy Biology (CE140100008) a JW. M.G.L è stato sostenuto da una sovvenzione di partenza dell'Università di La Trobe. Ringraziamo la piattaforma Genomica La Trobe per il loro supporto nel sequenziamento ad alta velocità effettiva e nell'analisi dei dati. Ringraziamo il Professore Associato Matthew Tucker per la consulenza di esperti su come stabilire LCM nel nostro laboratorio.

Poiché il prodotto finale è l'RNA, fare attenzione a evitare di contaminare il lavoro con RNases. Indossare i guanti è un must. Utilizzare acqua trattata con dietile pirocarbonato (DEPC), tamponi, ecc. Tamponi autoclave e cuocere bicchieri prima dell'uso.
1. Fissazione dei tessuti
<ol><li>Preparare il fissativo di scelta a seconda della specie e dei tipi di tessuto; per i semi d'orzo, utilizzare il fissativo del contadino (75% etanolo, 25% acido acetico glaciale (v/v)).</li>
	<li>Raffredd...

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Alevizos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+cancer+in+vivo+gene+expression+profiling+assisted+by+laser+capture+microdissection+and+microarray+analysis.">Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis.</a> Oncogene. 20 (43), 6196-6204 (2001).</li><li>Cong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+follicular+lymphoma:+description+and+analysis+by+laser+capture+microdissection.">In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection.</a> Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 99 (9), 3376-3382 (2002).</li><li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+protocol+for+xylem+tissues+of+woody+plants.">Laser capture microdissection protocol for xylem tissues of woody plants.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 1965 (2017).</li><li>Casson, S., Spencer, M., Walker, K., Lindsey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+for+the+analysis+of+gene+expression+during+embryogenesis+of+Arabidopsis.">Laser capture microdissection for the analysis of gene expression during embryogenesis of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 42 (1), 111-123 (2005).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LCM-seq+reveals+the+crucial+role+of+LsSOC1+in+heat-promoted+bolting+of+lettuce+(Lactuca+sativa+L.).">LCM-seq reveals the crucial role of LsSOC1 in heat-promoted bolting of lettuce (Lactuca sativa L.).</a> The Plant Journal. 95 (3), 516-528 (2018).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+atlas+of+rice+cell+types+uncovers+cellular,+functional+and+developmental+hierarchies.">A transcriptome atlas of rice cell types uncovers cellular, functional and developmental hierarchies.</a> Nature Genetics. 41 (2), 258-263 (2009).</li><li>Kivivirta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+laser+microdissection+(LMD)+followed+by+transcriptome+analysis+of+plant+reproductive+tissue+in+phylogenetically+distant+angiosperms.">A protocol for laser microdissection (LMD) followed by transcriptome analysis of plant reproductive tissue in phylogenetically distant angiosperms.</a> Plant Methods. 15 (1), 1-11 (2019).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+dynamics+of+the+maize+leaf+transcriptome.">The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome.</a> Nature Genetics. 42 (12), 1060-1067 (2010).</li><li>Liew, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+tissue-specific+regulation+of+transcriptomes+during+barley+(Hordeum+vulgare)+seed+germination.">Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination.</a> The Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).</li><li>Matas, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-and+cell-type+specific+transcriptome+profiling+of+expanding+tomato+fruit+provides+insights+into+metabolic+and+regulatory+specialization+and+cuticle+formation.">Tissue-and cell-type specific transcriptome profiling of expanding tomato fruit provides insights into metabolic and regulatory specialization and cuticle formation.</a> The Plant Cell. 23 (11), 3893-3910 (2011).</li><li>Sakai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser-assisted+microdissection+(LAM)+and+RNA-seq+allows+to+perform+a+comprehensive+transcriptomic+analysis+of+epidermal+cells+of+Arabidopsis+embryo.">Combining laser-assisted microdissection (LAM) and RNA-seq allows to perform a comprehensive transcriptomic analysis of epidermal cells of Arabidopsis embryo.</a> Plant Methods. 14 (1), 10 (2018).</li><li>Zhan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Sequencing+of+Laser-Capture+Microdissected+compartments+of+the+maize+kernel+identifies+regulatory+modules+associated+with+endosperm+cell+differentiation.">RNA Sequencing of Laser-Capture Microdissected compartments of the maize kernel identifies regulatory modules associated with endosperm cell differentiation.</a> The Plant Cell. 27 (3), 513-531 (2015).</li><li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines.">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).</li><li>Zeb, Q., Wang, C., Shafiq, S., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Cell Omics. , 101-135 (2019).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana.">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Protocols. 6 (1), 56 (2011).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Ducos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection:+A+powerful+tool+for+genomics+at+cell+level.">Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 5-27 (2018).</li><li>Nelson, T., Tausta, S. L., Gandotra, N., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+plant+tissue:+what+you+see+is+what+you+get.">Laser microdissection of plant tissue: what you see is what you get.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 57, 181-201 (2006).</li><li>Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Be+more+specific!+Laser-assisted+microdissection+of+plant+cells.">Be more specific! Laser-assisted microdissection of plant cells.</a> Trends in Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+obtaining+high+quality+RNA+from+paraffin+sections+of+plant+tissues+by+laser+microdissection.">A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection.</a> Journal of Plant Research. 123 (6), 807-813 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7 (1), 3 (2006).</li><li>Ferreira, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+mRNA+amplification+approach+for+RNAseq+from+limited+amount+of+RNA.">Linear mRNA amplification approach for RNAseq from limited amount of RNA.</a> Gene. 564 (2), 220-227 (2015).</li><li>Schneider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+T7+RNA+polymerase+based+in+vitro+linear+RNA+amplification+for+use+in+microarray+experiments.">Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments.</a> BMC Genomics. 5 (1), 29 (2004).</li><li>Shanker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+RNA+amplification+kits+for+RNA+sequencing+using+very+low+input+amounts+of+total+RNA.">Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), 4 (2015).</li><li>Bhattacherjee, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+fluorescently+labeled+embryonic+cranial+neural+crest+cells.">Laser capture microdissection of fluorescently labeled embryonic cranial neural crest cells.</a> Genesis. 39 (1), 58-64 (2004).</li><li>Cl&#233;ment-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenchymal+Cells+Contribute+to+Lignification+of+Tracheids+in+Developing+Xylem+of+Norway+Spruce.">Parenchymal Cells Contribute to Lignification of Tracheids in Developing Xylem of Norway Spruce.</a> Plant Physiology. 181 (4), 1552-1572 (2019).</li><li>Schad, M., Lipton, M. S., Giavalisco, P., Smith, R. D., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two-dimensional+electrophoresis+and+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+tissue-specific+protein+profiling+of+laser-microdissected+plant+samples.">Evaluation of two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for tissue-specific protein profiling of laser-microdissected plant samples.</a> Electrophoresis. 26 (14), 2729-2738 (2005).</li><li>Schad, M., Mungur, R., Fiehn, O., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+laser+microdissected+vascular+bundles+of+Arabidopsis+thaliana.">Metabolic profiling of laser microdissected vascular bundles of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 1 (1), 2 (2005).</li><li>Latrasse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+epigenetic+regulation+underlying+unisexual+flower+development+in+Cucumis+melo.">The quest for epigenetic regulation underlying unisexual flower development in Cucumis melo.</a> Epigenetics &amp; Chromatin. 10 (1), 22 (2017).</li><li>Turco, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+gene+expression+regulation+associated+with+vascularization+in+Sorghum+bicolor.">DNA methylation and gene expression regulation associated with vascularization in Sorghum bicolor.</a> The New Phytologist. 214 (3), 1213-1229 (2017).</li><li>Gomez, S. K., Harrison, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+and+its+application+to+analyze+gene+expression+in+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">Laser microdissection and its application to analyze gene expression in arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Pest Management Science: Formerly Pesticide Science. 65 (5), 504-511 (2009).</li><li>Roux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+analysis+of+plant+and+bacterial+gene+expression+in+symbiotic+root+nodules+using+laser-capture+microdissection+coupled+to+RNA+sequencing.">An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing.</a> The Plant Journal. 77 (6), 817-837 (2014).</li><li>Tang, W., Coughlan, S., Crane, E., Beatty, M., Duvick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+laser+microdissection+to+in+planta+gene+expression+profiling+of+the+maize+anthracnose+stalk+rot+fungus+Colletotrichum+graminicola.">The application of laser microdissection to in planta gene expression profiling of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (11), 1240-1250 (2006).</li></ol>

Molti studi sull'espressione genica specifici dei tessuti sono stati limitati dalla dissezione manuale di campioni, che richiede molto tempo e richiede lavoro, ha un alto rischio di contaminazione e può utilizzare solo campioni che un operatore umano è sufficientemente abile da raccogliere. LCM è una tecnica precisa e senza contatto per raccogliere cellule da sezioni di tessuto fisse utilizzando un raggio laser azionato meccanicamente sotto visualizzazione microscopica.
Una buona preparazio...

Lo sviluppo e la crescita delle piante comportano l'azione coordinata delle reti di regolamentazione trascrizionali all'interno di diverse cellule esistenti in un ambiente cellulare complesso. Per comprendere l'attività di queste reti normative, abbiamo bisogno della conoscenza dell'espressione genica spaziale e temporale all'interno di diversi tipi di cellule attraverso le fasi di sviluppo. Tuttavia, le analisi dell'espressione genica sono più comunemente condotte in interi organi o campioni di tessuto sfusa a causa della sfida tecnica di isolare e analizzare un piccolo numero di cellule. Il metodo che descriviamo qui ha permesso di ottenere un'analisi del trascrittura specifica del tessuto spaziale e temporale accoppiando LCM con RNA-seq.
LCM è stato sviluppato due decenni fa da Emmert-Buck e colleghi1. La tecnica ha permesso ai ricercatori di isolare con precisione singole cellule o ammassi di cellule dal loro ambiente utilizzando la visualizzazione e la manipolazione microscopiche dirette con un laser a fasciostretto 1. Da allora il metodo è stato ampiamente utilizzato nella biologia del cancro e nellapatologia 2,3. Molti gruppi di ricerca vegetali hanno anche adattato LCM per l'uso con diverse specie vegetali e diversi tipi ditessuto 4,5,6,7,8,9,10,11. Recentemente, diversi documenti hanno anche usato LCM su semi di eudicot e monocot per studiare embrioni, endospermemi e altre strutture di semi durante lo sviluppo dei semi e lagerminazione 10,12,13. La maggior parte degli altri metodi di isolamento a cella singola comunemente utilizzati come micro-pipettazione, smistamento cellulare, separazione magnetica e piattaforme microfluidiche dipendono dalla digestione ezimatica o dall'omogeneizzazione meccanica per dissociare le cellule. Questo può perturbare l'espressione genica, introducendo artefatti tecnici che confondono l'interpretazionedei dati 14,15. Questi metodi richiedono anche una conoscenza precedente dei geni marcatori per ogni tipo di cellula per correlare le cellule dissociate alla loro posizione spaziale e al vero tipo di cellula. Un ulteriore gruppo di tecniche dipende dall'isolamento basato sull'affinità delle strutture subcellulari anziché delle celle intere, ad esempio INTACT (Isolation of Nuclei Tagged in Cell Types) e TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification)16,17. Tuttavia, l'etichettatura di affinità e la purificazione di nuclei o ribosomi sono tecnicamente impegnative nelle specie vegetali che non hanno protocolli di trasformazione ben consolidati. LCM sfrutta la fissazione rapida dei tessuti per preservare i livelli di trascrizione e l'identificazione ircologica convenzionale mediante la visualizzazione diretta delle cellule all'interno del loro normale contesto di tessuto/organo, che consente alle cellule discrete di essere isolate in un breveperiodo di tempo 18,19.
Il protocollo qui presentato è un metodo ottimizzato per l'isolamento di cellule o tipi di cellule specifiche dalle sezioni tisssate dei semi di cereali, che possono essere applicate alla maggior parte delle cellule che possono essere identificate istologicamente. LCM fornisce un metodo senza contatto di isolamento cellulare, riducendo notevolmente la contaminazione e aumentando l'integrità dell'RNA recuperato. Inoltre, il metodo illustra la potenza della ML su larga scala su studi su tutto il genoma a partire da piccole quantità di materiali biologici. Descriviamo anche l'amplificazione lineare dell'RNA per generare materiale di input sufficiente per le analisi di trascrizione/trascrizione a valle.
Ci sono dieci passaggi principali in questo protocollo LCM RNA-seq per trascrittori spaziali e temporali specifici del tessuto, tra cui la fissazione di campioni di tessuto, disidratazione, infiltrazione di paraffina, incorporamento, sezionazione, LCM, estrazione dell'RNA, amplificazione dell'RNA, quantificazione dell'RNA e qRT-PCR e/o RNA-seq (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61517/61517fig01.jpg"> Figura 1: diagramma di flusso di LCM seguito da RNA-seq o qRT-PCR. LCM è una tecnica spazialmente precisa e senza contatto per raccogliere cellule da sezioni di tessuto fisse utilizzando un raggio laser sotto visualizzazione microscopica. Il processo inizia con la fissazione di campioni di tessuto, seguita da disidratazione utilizzando una serie di gradienti di etanolo e xylene, e finito con infiltrazione di paraffina. Il processo può essere completamente automatizzato utilizzando un processore di tessuto. Una volta che il tessuto è infiltrato con paraffina, è incorporato in uno stampo con paraffina fusa utilizzando una stazione di incorporamento. Il sessaggio viene eseguito utilizzando microtomo impostato allo spessore desiderato. I vetrini vengono preparati e LCM condotto immediatamente prima che l'RNA venga estratto dalle cellule catturate. L'estrazione dell'RNA è seguita direttamente da due cicli di amplificazione dell'RNA prima di qRT-PCR e/o RNA-seq. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61517/61517fig01large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid 100 % ACS/R.</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td>
			<td>VWRC20104.323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdhesiveCap 200 opaque</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415190-9181-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear base moulds 8 X 10</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3803015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40718-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity RNA ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low&#173;profile disp.blades DB80LS</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14035843489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PEN</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415190-9041-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td>Ambion (ThermoFisher)</td>
			<td>AMB17515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>On-Column DNase I Digestion Set</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNASE70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation RNA-Seq System V2</td>
			<td>NuGen (Integrated Science)</td>
			<td>7102-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin (Surgipath Paraplast)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>ABI (ThermoFisher)</td>
			<td>KIT0214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Ambion (ThermoFisher)</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td>
			<td>VWRC28975.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Benchtop Tissue Processor</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Heated Paraffin Embedding Module</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>EG1150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Cold Plate</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets</td>
			<td>LAF Technologies Pty Ltd</td>
			<td>Safemate 1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fully Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>RM2265</td>
			<td>with PALMRobo v 4.6 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss PALM MicroBeam LCM system</td>
			<td>Zeiss miscroscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-capture microdissection rna-sequencing for spatial and temporal tissue-specific gene expression analysis in plants

Lo sviluppo di un organismo multicellulare complesso è governato da tipi di cellule distinti che hanno diversi profili trascrizioni. Per identificare le reti di regolamentazione trascrizionali che governano i processi di sviluppo è necessario misurare i profili di espressione genica spaziale e temporale di questi singoli tipi di cellule. Pertanto, la comprensione del controllo spatio-temporale dell'espressione genica è essenziale per comprendere come sono regolati i processi biologici e di sviluppo. Qui, descriviamo un metodo di microdissezione laser-cattura (LCM) per isolare un piccolo numero di cellule da tre organi embrionali d'orzo in un corso di tempo durante la germinazione seguito dalla profilazione della trascrizione. Il metodo consiste nella fissazione dei tessuti, nell'elaborazione dei tessuti, nell'incorporazione di paraffina, nella sessazione, nell'estrazione di LCM e RNA seguita da PCR o RNA-seq in tempo reale. Questo metodo ci ha permesso di ottenere profili spaziali e temporali di trascrittori di organi di semi da un numero variabile di cellule (da decine a centinaia), fornendo una specificità del tessuto molto maggiore rispetto alle tipiche analisi dei tessuti sfusi. Da questi dati siamo stati in grado di definire e confrontare le reti normative trascrizioni, nonché prevedere i fattori di trascrizione normativa candidati per i singoli tessuti. Il metodo deve essere applicabile ad altri tessuti vegetali con ottimizzazione minima.

Abbiamo generato trascrittori spaziali e temporali specifici del tessuto da semi d'orzo durante la germinazione utilizzando il nostro protocollo LCM RNA-seq10. Lo studio è stato condotto applicando LCM RNA-seq a un piccolo numero di cellule di tre organi embrionali (plumule, punta di radicolo, scutellum) ogni 8 h su un corso di tempo di 48 h durante la germinazione (0-48 h, 7 punti di tempo)(Figura 2A,B).
<p class="jove_content" fo:keep-together....

Watch this Scientific Journal Video about Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants at JoVE.com

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

Presentato qui è un protocollo per la microdissezione laser-cattura (LCM) di tessuti vegetali. LCM è una tecnica microscopica per isolare aree di tessuto in modo privo di contaminazione. La procedura include fissazione del tessuto, incorporamento di paraffina, sessazione, LCM e estrazione dell'RNA. L'RNA viene utilizzato nell'analisi dei trascrimi specifici del tessuto a valle e tempormente risolta.

Microsezione laser-cattura RNA-Sequenziamento per l'analisi dell'espressione genica spaziale e temporale specifica del tessuto nelle piante

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Questo protocollo utilizza la microdisezione laser-capture accoppiata con RNA-Sequenziamento per ottenere trascrizioni spaziali e temporali da cellule specifiche in piante di interesse, utilizzando piccole quantità di materiali biologici. Il principale vantaggio della tecnica laser è che facilita la visualizzazione diretta delle cellule all'interno del normale contesto tissutale, consentendo alle cellule discrete di essere isolate con precisione in modo privo di contatto. Sebbene questo protocollo sia ottimizzato per l'isolamento delle cellule vegetali, può essere applicato alla maggior parte delle cellule che possono essere identificate istologicamente.Una buona preparazione del campione è fondamentale. Pertanto, uno che esegue questa tecnica per la prima volta, l'ottimizzazione prop della fissazione dei tessuti e dell'incorporamento è importante prima della microdisezione laser-capture. Prima di raccogliere il campione di tessuto, preparare un fissatore appropriato alla specie e al tipo di tessuto da raccogliere.Per i semi d'orzo, tagliare i campioni di semi a metà prima di immergere i campioni in almeno un volume di 10 volte di freddo ghiacciato fissatore. Utilizzare l'infiltrazione sottovuoto per accelerare la penetrazione del fissatore. Il tessuto dovrebbe affondare entro la fine dell'infiltrazione, quindi aggiornare il fissatore per un'incubazione notturna e trasferire i campioni in cassette per la lavorazione dei tessuti.Posizionare le cassette caricate in tessuto nel cestello metallico di un processore automatico e collegare il cestello metallico al supporto sopra la camera uno. Impostare il programma sui pannelli di controllo del processore tissutale e premere start per avviare il programma di elaborazione automatica. Il sistema disidrata i campioni immergere le cassette in una serie gradiente di etanolo per 90 minuti per concentrazione come indicato.Dopo l'ultima immersione in etanolo, il sistema immergerà i campioni in gradienti di xilene per 90 minuti per soluzione come indicato. Seguito da immersioni di 290 minuti in paraffina fusa a 55-60 gradi Celsius. La mattina seguente, rimuovere le cassette infiltrate di paraffina dal processore tissutale e procedere all'incorporamento della paraffina.La mattina successiva, utilizzare le forcep fini per trasferire i campioni di processo in stampi di dimensioni adeguatamente dimensionate e aggiungere paraffina fusa su ogni campione. Per i semi d'orzo, orientare longitudinalmente i campioni nella paraffina verso la direzione di taglio per facilitare l'acquisizione di sezioni longitudinali. Posizionare una cassetta pulita sullo stampo e assicurarsi che l'intera cassetta sia completamente coperta con un volume sufficiente di paraffina per fissare il campione alla cassetta.Quindi posizionare lo stampo su una piastra fredda per 10-20 minuti fino a quando la paraffina non viene impostata prima di rilasciare il blocco dallo stampo. Per preparare uno slide a membrana PEN, immergere gli scivoli in soluzione disattivante RNS per tre secondi seguiti da due brevi lavaggi e acqua trattata con DEPC. Quindi guidare le diapositive in un incubatore di 370 gradi Celsius per rimuovere qualsiasi soluzione rimasta e i raggi UV trattano le diapositive in un armadio a flusso laminare per 30 minuti per migliorare la loro paraffina e non le nocciole.Per un sessatura del tessuto campione posizionare i blocchi di paraffina sulla piastra fredda e riempire il bagno d'acqua con l'acqua trattata con DEPC, quindi riscaldare a 42 gradi Celsius. Tagliare i blocchi alla profondità della regione di interesse e sessare i blocchi di paraffina fino a uno spessore da sei a 10 micron. Un blocco ben seghettato formerà un nastro sul bordo della lama.Utilizzare una pinzetta fine per trasferire delicatamente nastri dal microtomo al bagno d'acqua, facendo attenzione che il nastro giace piatto sulla superficie dell'acqua. Per raccogliere le sezioni, tenendo uno scivolo con un angolo di 45 gradi, utilizzare un movimento verso l'alto per sollevare un nastro dall'acqua sullo scivolo e utilizzare un tessuto privo di pelucchi per rimuovere con cura l'acqua in eccesso. Una volta raccolte tutte le sezioni, lavare gli scivoli con lavaggi di 320 secondi in xilene, seguiti da lavaggi di 230 secondi in etanolo al 100% e lavaggi di 230 secondi in etanolo al 70%.Per microsezionare le cellule di interesse dalle sezioni di tessuto deparraffinizzato e secco, caricare le diapositive sulle tre fessure del microscopio LCM e il tubo di raccolta del carico negli slot disponibili. Spostare lo stage per individuare la regione del campione che deve essere tagliata e tagliare un segmento vuoto privo di tessuto sullo scivolo della membrana. Ottimizzare la velocità di taglio e il taglio della pressione laser catapultando energia e messa a fuoco.Utilizzare gli strumenti di disegno per delineare l'area di interesse nel tessuto e utilizzare i parametri ottimizzati e la funzione Robo LPC per catapultare le cellule nei tappi adesivi. Selezionare il contrassegno dall'elenco degli elementi per utilizzare lo strumento contrassegno per contrassegnare le aree di interesse. Controllare il pulsante di controllo del cappuccio per ispezionare il cappuccio adesivo, per confermare che i campioni sono stati acquisiti.In genere sono necessarie da 10 a 15 sezioni per tappo per l'estrazione dell'RNA. Subito dopo che tutti i campioni sono stati acquisiti, procedere immediatamente all'estrazione dell'RNA per evitare la degradazione dell'RNA. Dopo l'estrazione dell'RNA e l'amplificazione dell'RNA utilizzare un sistema automatizzato di elettroforesi, secondo le istruzioni del produttore per quantificare e qualificare l'RNA antisense.In questo studio, LCM, il sequenziamento dell'RNA è stato applicato a un piccolo numero di cellule di tre organi embrionali, ogni otto ore su un corso di 48 ore durante la germinazione. È importante regolare correttamente i parametri di taglio per consentire al tessuto di interesse di essere tagliato e slogato con precisione dal tessuto circostante senza bruciare il bordo dell'area selezionata. La ramificazione dell'RNA totale prima dell'amplificazione dell'RNA consente il rilevamento di bande elettroforetiche distinte e picchi fluorescenti di subunità ribosomiche 18 e 28S in campioni di RNA di buona qualità.L'RNA antisense sintetizzato con successo esporrà una distribuzione unimodale simmetrica delle dimensioni da 100 a 1000 nucleotidi con un picco di circa 300 nucleotidi dopo due cicli di amplificazione. La tracciazione su scala multidimensionale di geni espressi nei diversi tessuti in 48 ore di germinazione, illustra una maggiore somiglianza tra campioni di un singolo tessuto rispetto a tra campioni dallo stesso punto di tempo, ma tessuti diversi. Il numero di geni espressi in modo differenziato aumenta progressivamente nel corso della germinazione in ogni tessuto rispetto al punto di ora zero del tessuto.In questa analisi rappresentativa, il 25% del plumule, il 34% del radiolo e il 41% dei geni espressi in modo differenziato dello scutello sono risultati espressi esclusivamente all'interno di ciascun tessuto. È importante regolare correttamente i parametri di taglio per un'escissione precisa e lo slogaggio dell'area del selettore dal tessuto circostante senza bruciare il bordo della regione selezionata. Con metodi migliorati di purificazione della cromatina e delle proteine e migliorare lo strumento di spettrometria di massa, LCM può essere utilizzato per impianti di studio epigenomici e proteomici specifici del tipo cellulare.

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser Microdissezione Cattura di tessuti di mammiferi

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Ricerca

Biologia

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Parte 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Part 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Parte 3

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

L&#39;utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull&#39;espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...