Name: laser-capture microdissection rna-sequencing for spatial and temporal tissue-specific gene expression analysis in plants
Uploaded: 2020-08-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants at JoVE.com

이 작품은 식물 에너지 생물학 (CE140100008)에서 JW에 우수의 호주 연구 위원회 센터에 의해 지원되었다. M.G.L은 라 트로브 대학 시작 보조금에 의해 지원되었다. 우리는 높은 처리량 시퀀싱 및 데이터 분석에 대한 지원에 대한 La Trobe 유전체학 플랫폼에 감사드립니다. 우리는 우리의 실험실에서 LCM을 설립에 대한 전문가의 조언을 준 교수 매튜 터커 에게 감사드립니다.

최종 제품은 RNA이기 때문에 RNases와 함께 작업을 오염하지 않도록주의하십시오. 장갑을 착용하는 것은 필수입니다. 다이틸 파이로카보네이트(DEPC) -처리된 물, 완충제 등을 사용하십시오. 자동 클래브 버퍼와 사용하기 전에 유리 제품을 굽습니다.
1. 조직 고정
<ol><li>종 과 조직 유형에 따라 선택의 고정을 준비; 보리 씨앗의 경우 농부의 고정 (75 % 에탄올, 25 % 빙하 아세트산 (v ...

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Alevizos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+cancer+in+vivo+gene+expression+profiling+assisted+by+laser+capture+microdissection+and+microarray+analysis.">Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis.</a> Oncogene. 20 (43), 6196-6204 (2001).</li><li>Cong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+follicular+lymphoma:+description+and+analysis+by+laser+capture+microdissection.">In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection.</a> Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 99 (9), 3376-3382 (2002).</li><li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+protocol+for+xylem+tissues+of+woody+plants.">Laser capture microdissection protocol for xylem tissues of woody plants.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 1965 (2017).</li><li>Casson, S., Spencer, M., Walker, K., Lindsey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+for+the+analysis+of+gene+expression+during+embryogenesis+of+Arabidopsis.">Laser capture microdissection for the analysis of gene expression during embryogenesis of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 42 (1), 111-123 (2005).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LCM-seq+reveals+the+crucial+role+of+LsSOC1+in+heat-promoted+bolting+of+lettuce+(Lactuca+sativa+L.).">LCM-seq reveals the crucial role of LsSOC1 in heat-promoted bolting of lettuce (Lactuca sativa L.).</a> The Plant Journal. 95 (3), 516-528 (2018).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+atlas+of+rice+cell+types+uncovers+cellular,+functional+and+developmental+hierarchies.">A transcriptome atlas of rice cell types uncovers cellular, functional and developmental hierarchies.</a> Nature Genetics. 41 (2), 258-263 (2009).</li><li>Kivivirta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+laser+microdissection+(LMD)+followed+by+transcriptome+analysis+of+plant+reproductive+tissue+in+phylogenetically+distant+angiosperms.">A protocol for laser microdissection (LMD) followed by transcriptome analysis of plant reproductive tissue in phylogenetically distant angiosperms.</a> Plant Methods. 15 (1), 1-11 (2019).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+dynamics+of+the+maize+leaf+transcriptome.">The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome.</a> Nature Genetics. 42 (12), 1060-1067 (2010).</li><li>Liew, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+tissue-specific+regulation+of+transcriptomes+during+barley+(Hordeum+vulgare)+seed+germination.">Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination.</a> The Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).</li><li>Matas, A. 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H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines.">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).</li><li>Zeb, Q., Wang, C., Shafiq, S., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Cell Omics. , 101-135 (2019).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana.">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Protocols. 6 (1), 56 (2011).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. 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L., Gandotra, N., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+plant+tissue:+what+you+see+is+what+you+get.">Laser microdissection of plant tissue: what you see is what you get.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 57, 181-201 (2006).</li><li>Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Be+more+specific!+Laser-assisted+microdissection+of+plant+cells.">Be more specific! Laser-assisted microdissection of plant cells.</a> Trends in Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+obtaining+high+quality+RNA+from+paraffin+sections+of+plant+tissues+by+laser+microdissection.">A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection.</a> Journal of Plant Research. 123 (6), 807-813 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7 (1), 3 (2006).</li><li>Ferreira, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+mRNA+amplification+approach+for+RNAseq+from+limited+amount+of+RNA.">Linear mRNA amplification approach for RNAseq from limited amount of RNA.</a> Gene. 564 (2), 220-227 (2015).</li><li>Schneider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+T7+RNA+polymerase+based+in+vitro+linear+RNA+amplification+for+use+in+microarray+experiments.">Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments.</a> BMC Genomics. 5 (1), 29 (2004).</li><li>Shanker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+RNA+amplification+kits+for+RNA+sequencing+using+very+low+input+amounts+of+total+RNA.">Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), 4 (2015).</li><li>Bhattacherjee, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+fluorescently+labeled+embryonic+cranial+neural+crest+cells.">Laser capture microdissection of fluorescently labeled embryonic cranial neural crest cells.</a> Genesis. 39 (1), 58-64 (2004).</li><li>Cl&#233;ment-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenchymal+Cells+Contribute+to+Lignification+of+Tracheids+in+Developing+Xylem+of+Norway+Spruce.">Parenchymal Cells Contribute to Lignification of Tracheids in Developing Xylem of Norway Spruce.</a> Plant Physiology. 181 (4), 1552-1572 (2019).</li><li>Schad, M., Lipton, M. S., Giavalisco, P., Smith, R. D., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two-dimensional+electrophoresis+and+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+tissue-specific+protein+profiling+of+laser-microdissected+plant+samples.">Evaluation of two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for tissue-specific protein profiling of laser-microdissected plant samples.</a> Electrophoresis. 26 (14), 2729-2738 (2005).</li><li>Schad, M., Mungur, R., Fiehn, O., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+laser+microdissected+vascular+bundles+of+Arabidopsis+thaliana.">Metabolic profiling of laser microdissected vascular bundles of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 1 (1), 2 (2005).</li><li>Latrasse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+epigenetic+regulation+underlying+unisexual+flower+development+in+Cucumis+melo.">The quest for epigenetic regulation underlying unisexual flower development in Cucumis melo.</a> Epigenetics &amp; Chromatin. 10 (1), 22 (2017).</li><li>Turco, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+gene+expression+regulation+associated+with+vascularization+in+Sorghum+bicolor.">DNA methylation and gene expression regulation associated with vascularization in Sorghum bicolor.</a> The New Phytologist. 214 (3), 1213-1229 (2017).</li><li>Gomez, S. K., Harrison, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+and+its+application+to+analyze+gene+expression+in+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">Laser microdissection and its application to analyze gene expression in arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Pest Management Science: Formerly Pesticide Science. 65 (5), 504-511 (2009).</li><li>Roux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+analysis+of+plant+and+bacterial+gene+expression+in+symbiotic+root+nodules+using+laser-capture+microdissection+coupled+to+RNA+sequencing.">An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing.</a> The Plant Journal. 77 (6), 817-837 (2014).</li><li>Tang, W., Coughlan, S., Crane, E., Beatty, M., Duvick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+laser+microdissection+to+in+planta+gene+expression+profiling+of+the+maize+anthracnose+stalk+rot+fungus+Colletotrichum+graminicola.">The application of laser microdissection to in planta gene expression profiling of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (11), 1240-1250 (2006).</li></ol>

많은 조직 별 유전자 발현 연구는 시간이 많이 소요되는, 노동 집약적인 시료의 손 해부에 의해 제한되었으며, 오염위험이 높으며 인간 수술이 수확하기에 충분히 손재주적이라는 시료만 활용할 수 있습니다. LCM은 현미경 시각화 하에서 기계적으로 작동하는 레이저 빔을 사용하여 고정 조직 섹션에서 세포를 수집하는 정확하고 접촉없는 기술입니다.
좋은 샘플 준비는 LCM에 ?...

식물 개발 및 성장은 복잡한 세포 환경에 존재하는 다른 세포 내의 전사 규제 네트워크의 조정 된 작용을 포함한다. 이러한 규제 네트워크의 활동을 이해하기 위해, 우리는 발달 단계에 걸쳐 다른 세포 모형 내의 공간 및 측두성 유전자 발현의 지식을 요구합니다. 그러나, 유전자 발현의 분석은 세포의 작은 숫자를 격리하고 분석의 기술적 인 도전 때문에 전체 기관 또는 대량 조직 샘플에서 더 일반적으로 수행됩니다. 여기서 설명하는 방법은 LCM과 RNA-seq를 결합하여 공간 및 측두조직 특이적 전사 분석을 얻을 수 있게 하였다.
LCM은 에머트 벅과 동료에머트벅에 의해 이십 년 전에 개발되었다 1 . 이 기술을 통해 연구자들은 좁은 빔 레이저1을사용하여 직접 현미경 시각화 및 조작을 사용하여 단일 세포 또는 세포 클러스터를 환경으로부터 정확하게 분리할 수 있었습니다. 그 이후로 이 방법은 암 생물학 및 병리학2,,3에서널리 사용되고 있다. ,많은 식물 연구 그룹은 또한 다른 식물 종 및 다른 조직 유형,4,,5,,6,7,8,9,10,11과함께 사용하기 위해,LCM을적응시켰다. 최근에는, 몇몇 논문은 또한 종자 발달 및 발아 도중 배아, 내배식 및 그밖 종자 구조물을 공부하기 위하여 eudicot 및 단장화장 씨앗에LCM을 이용했습니다10,,12,13. 마이크로 파이펫팅, 세포 선별, 자기 분리 및 미세 유체 플랫폼과 같은 다른 일반적으로 사용되는 단일 세포 격리 방법의 대부분은 세포를 해리하기 위해 효소 소화 또는 기계적 균질화에 의존한다. 이는 데이터해석(14,15)을혼동하는 기술 적 유물을 도입하여 유전자발현을방해할 수 있다. 이러한 방법은 또한 해리된 세포를 공간 위치 및 진정한 세포 유형에 연관시키기 위해 각 세포 유형에 대한 마커 유전자에 대한 이전 지식을 요구합니다. 기술의 추가 그룹은 전체 세포 대신 세포 체형 구조의 친화성 기반 절연에 따라 달라집니다, 예를 들어 INTACT (세포 유형에서 태그 핵의 격리) 및 TRAP (리보솜 친화 정화 번역)16,,17. 그러나 핵 이나 리보좀의 선호도 라벨링 및 정제는 잘 확립 된 변형 프로토콜이없는 식물 종에서 기술적으로 도전적입니다. LCM은 짧은기간동안 이산 세포를 단기간에 격리할 수 있도록 하는 정상 조직/장기 문맥 내에서 세포의 직접 시각화에 의한 성적증명서 수준 및 종래의 조직학적 식별을 보존하기 위해 빠른 조직 고정을활용한다.19
여기에 제시된 프로토콜은 조직학적으로 식별될 수 있는 대부분의 세포에 적용될 수 있는 시리얼 씨앗의 조직 섹션에서 특정 세포 또는 세포 유형의 분리를 위한 최적화된 방법입니다. LCM은 접촉없는 세포 격리 방법을 제공하여 오염을 크게 줄이고 회수 된 RNA의 무결성을 증가시킵니다. 더욱이, 이 방법은 소량의 생물학적 물질로 시작하는 대규모 게놈 넓은 연구에 대한 LCM의 힘을 보여줍니다. 우리는 또한 다운스트림 전사/전사 분석을 위한 충분한 입력 물질을 생성하기 위한 RNA의 선형 증폭을 기술합니다.
이 LCM RNA-seq 프로토콜에는 조직 샘플, 탈수, 파라핀 침투, 임베딩, 단면, LCM, RNA 추출, RNA 증폭, RNA 정량화 및 qRT-PCR 및/또는 RNA-seq(그림1)의고정을 포함하는 공간 및 측두조직 특이적 전사에 대한 10가지 주요 단계가 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61517/61517fig01.jpg"> 그림 1: LCM의 순서도는 RNA-seq 또는 qRT-PCR이 그 뒤를 따릅니다. LCM은 현미경 시각화 하에서 레이저 빔을 사용하여 고정 조직 섹션에서 세포를 수집하는 공간적으로 정확하고 접촉이 없는 기술입니다. 이 과정은 조직 샘플의 고정으로 시작하여 에탄올과 자일렌의 그라데이션 시리즈를 사용하여 탈수로 시작하여 파라핀 침투로 완성됩니다. 이 과정은 티슈 프로세서를 사용하여 완전히 자동화될 수 있습니다. 조직이 파라핀으로 침투하면 포함 스테이션을 사용하여 용융 파라핀이있는 금형에 내장됩니다. 절제는 원하는 두께로 설정된 마이크로토메를 사용하여 수행됩니다. 슬라이드는 RNA가 포획된 세포에서 추출되기 직전에 제조되고 LCM이 수행됩니다. RNA 추출은 qRT-PCR 및/또는 RNA-seq 이전에 RNA 증폭의 2라운드에 의해 직접 뒤따릅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61517/61517fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid 100 % ACS/R.</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td>
			<td>VWRC20104.323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdhesiveCap 200 opaque</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415190-9181-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear base moulds 8 X 10</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3803015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40718-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity RNA ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low&#173;profile disp.blades DB80LS</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14035843489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PEN</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415190-9041-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td>Ambion (ThermoFisher)</td>
			<td>AMB17515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>On-Column DNase I Digestion Set</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNASE70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation RNA-Seq System V2</td>
			<td>NuGen (Integrated Science)</td>
			<td>7102-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin (Surgipath Paraplast)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>ABI (ThermoFisher)</td>
			<td>KIT0214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Ambion (ThermoFisher)</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td>
			<td>VWRC28975.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Benchtop Tissue Processor</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Heated Paraffin Embedding Module</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>EG1150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Cold Plate</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets</td>
			<td>LAF Technologies Pty Ltd</td>
			<td>Safemate 1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fully Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>RM2265</td>
			<td>with PALMRobo v 4.6 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss PALM MicroBeam LCM system</td>
			<td>Zeiss miscroscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-capture microdissection rna-sequencing for spatial and temporal tissue-specific gene expression analysis in plants

복잡한 다세포 유기체의 발달은 상이한 전사 단면도가 있는 명백한 세포 모형에 의해 지배됩니다. 발달 과정을 제어하는 전사 적 규제 네트워크를 식별하려면 이러한 개별 세포 유형의 공간 및 측두성 유전자 발현 프로파일을 측정할 필요가 있습니다. 따라서 유전자 발현의 현세-측량 제어에 대한 통찰력은 생물학적 및 발달 과정이 어떻게 규제되는지 이해하는 데 필수적입니다. 여기서는 발아 중에 시간 과정을 통해 3개의 보리 배아 기관에서 소수의 세포를 분리하는 레이저 포획 미세 절(LCM) 방법을 설명하고 전사체 프로파일링을 실시한다. 이 방법은 조직 고정, 조직 처리, 파라핀 포함, 단면, LCM 및 RNA 추출 다음으로 실시간 PCR 또는 RNA-seq로 구성됩니다. 이 방법을 통해 종자 장기 전사의 공간적 및 측두프로파일을 다양한 수의 세포(수십~수백 개)에서 얻을 수 있게 되어 일반적인 벌크 조직 분석보다 훨씬 더 큰 조직 특이성을 제공합니다. 이러한 데이터에서 우리는 전사 적 규제 네트워크를 정의하고 비교할 뿐만 아니라 개별 조직에 대한 후보 규제 전사 요인을 예측할 수 있었습니다. 이 방법은 최소한의 최적화를 가진 다른 플랜트 조직에 적용되어야 합니다.

우리는 우리의 LCM RNA-seq 프로토콜10을사용하여 발아 하는 동안 보리 씨앗에서 공간 및 측두 조직 특이적인 전사를 생성 했다. 이 연구는 발아 중 48시간 코스(0-48h, 7시간 포인트)를 통해 3개의 배아 기관(plumule, radicle tip, scutellum)에서 소수의 세포에 LCM RNA-seq를 적용하여 수행하였다(도2A,B).
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Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

여기에 제시된 것은 식물 조직의 레이저 포획 미세 절(LCM)을 위한 프로토콜입니다. LCM은 오염없는 방식으로 조직의 영역을 격리하기위한 현미경 기술입니다. 절차는 조직 고정, 파라핀 포함, 단면, LCM 및 RNA 추출을 포함한다. RNA는 다운스트림 조직 특이적, 전사의 현세적으로 해결된 분석에서 사용된다.

레이저 캡처 미세 절 RNA-시퀀싱 용 공간 및 측두 조직 -특정 유전자 발현 분석

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

이 프로토콜은 소량의 생물학적 물질을 사용하여 이해 분야의 특정 세포로부터 공간 및 측두전사를 얻기 위해 RNA-시퀀싱과 결합된 레이저 포획 미세 절위를 사용합니다. 레이저 기술의 주요 장점은 정상적인 조직 컨텍스트 내에서 세포의 직접 시각화를 용이하게하여 이산 세포가 접촉없는 방식으로 정확하게 분리 될 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 식물 세포의 격리에 최적화되어 있지만, 그것은 stologically 식별 될 수있는 대부분의 세포에 적용 할 수있다.좋은 샘플 준비는 중요합니다. 따라서, 이 기술을 처음으로 수행하는 사람은, 조직 고정 및 포함의 소품 최적화는 레이저 캡처 마이크로절 전에 중요하다. 조직 샘플을 수집하기 전에, 수확할 종 및 조직 유형에 적합한 고정을 준비한다.보리 씨앗의 경우, 시료를 얼음 냉간 고정물의 최소 10X 부피로 잠기 전에 종자 샘플을 반으로 자른다. 진공 침투를 사용하여 고정물의 침투를 가속화하십시오. 조직은 침투의 끝에 의해 침몰해야, 다음 하룻밤 잠복에 대한 고정을 새로 고침하고 조직 처리를위한 카세트로 샘플을 전송.자동 프로세서의 금속 바구니에 적재된 카세트를 배치하고 금속 바구니를 챔버 1 위의 홀더에 부착합니다. 티슈 프로세서의 제어판에 프로그램을 설정하고 자동 처리 프로그램을 시작하기 시작 프레스. 시스템은 카세트를 에탄올의 그라데이션 시리즈로 찍어 서 샘플을 농도당 90분 동안 탈수합니다.마지막 에탄올 침수 후, 시스템은 표시된 대로 솔루션당 90분 동안 자일렌 그라데이션에 샘플을 담급합니다. 그 다음에 는 55~60°C의 용융 파라핀에 290분이 침수되었습니다. 다음 날 아침, 티슈 프로세서에서 파라핀 침투 카세트를 제거하고 파라핀 포함으로 진행한다.다음 날 아침, 미세 한 집게를 사용하여 공정 샘플을 적절하게 크기의 금형으로 옮기고 각 샘플에 용융 파라핀을 추가하십시오. 보리 씨앗의 경우 파라핀의 샘플을 세로방향으로 방향을 지정하여 종방향 섹션의 획득을 용이하게 합니다. 깨끗한 카세트를 금형에 놓고 전체 카세트가 충분한 양의 파라핀으로 완전히 덮여 있는지 확인하여 샘플을 카세트에 고정시하십시오.그런 다음 금형에서 블록을 해제하기 전에 파라핀이 설정 될 때까지 10 ~ 20 분 동안 콜드 플레이트에 금형을 놓습니다. PEN 멤브레인 슬라이드를 준비하려면 RNS 비활성화 솔루션에 슬라이드를 3초 동안 잠근 다음 두 개의 간단한 세차및 DEPC 처리 된 물을 넣습니다. 그런 다음 370섭씨 인큐베이터에서 슬라이드를 운전하여 남은 용액을 제거하고 UV는 헤이즐넛이 아닌 파라핀을 향상시키기 위해 30 분 동안 라미나르 흐름 캐비닛에서 슬라이드를 처리합니다.샘플 조직 단면의 경우 파라핀 블록을 차가운 접시에 놓고 DEPC 처리 된 물로 수조를 채운 다음 섭씨 42도까지 따뜻하게하십시오. 관심 영역의 깊이로 블록을 잘라 내고 파라핀 블록을 6~10미크로 절개한다. 잘 단면된 블록은 블레이드 가장자리에 리본을 형성합니다.미세 트위저를 사용하여 미세 한 트위저를 사용하여 미세 토메에서 수조로 리본을 부드럽게 옮기고 리본이 수면에 평평하게 놓여 있음을주의하십시오. 섹션을 수집하려면 슬라이드를 45도 각도로 잡고 위쪽으로 움직여 리본을 물 밖으로 밀어 내고 보풀이 없는 조직을 사용하여 여분의 물을 조심스럽게 제거합니다. 모든 구간을 모으면 자일렌에서 320초 세척한 후 100%에탄올로 230초 세척, 70%에탄올로 230초 세척합니다.탈파라피네이션 및 건식 조직 섹션에서 관심 있는 세포를 미세하게 하기 위해 3개의 LCM 현미경 슬롯에 슬라이드를 적재하고 수집 튜브를 사용 가능한 슬롯에 적재합니다. 단계를 이동하여 절단해야 하는 샘플 영역을 찾고 멤브레인 슬라이드에서 조직이 없는 빈 세그먼트를 잘라냅니다. 절삭 속도와 레이저 압력의 절단을 최적화하려면 에너지와 초점을 발사합니다.도면 도구를 사용하여 조직에 대한 관심 영역을 설명하고 최적화된 매개 변수와 Robo LPC 기능을 사용하여 세포를 접착제 캡으로 투석할 수 있습니다. 요소 목록에서 플래그를 선택하여 플래그 도구를 사용하여 관심 영역을 표시합니다. 캡 검사 버튼을 확인하여 접착제 캡을 검사하여 샘플이 캡처되었는지 확인합니다.일반적으로 RNA 추출에 필요한 캡 당 10~ 15개의 섹션이 필요합니다. 모든 샘플을 획득한 직후RNA 분해를 피하기 위해 RNA 추출로 즉시 진행합니다. RNA 추출 및 RNA 증폭 후 자동화된 전기 포고시스템을 사용하며, 제조업체의 지시에 따라 안티센스 RNA를 정량화하고 자격을 갖추게 된다.이 연구에서는, LCM, RNA-염기서열분석은 발아 도중 48시간 시간 과정을 통해 8시간마다 3개의 배아 기관에서 소수의 세포에 적용되었습니다. 관심 있는 조직이 선택한 영역의 가장자리를 태우지 않고 주변 조직에서 정밀하게 절단되고 빠질 수 있도록 절단 매개 변수를 올바르게 조정하는 것이 중요합니다. RNA 증폭 전에 총 RNA의 파급 효과는 양질의 RNA 샘플에서 18 및 28S 리보소말 하위 단위의 뚜렷한 전기 전구 대역 및 형광 피크의 검출을 허용합니다.성공적으로 합성된 안티센스 RNA는 2차례의 증폭 후 약 300개의 뉴클레오티드를 가진 100~1000개의 뉴클레오티드에서 단변 대칭 크기 분포를 나타낸다. 발아의 48 시간 이상 다른 조직에서 발현 된 유전자의 다차원 스케일 플롯, 같은 시간 시점에서 샘플 사이 보다 단일 조직의 샘플 사이 더 큰 유사성을 보여줍니다., 하지만 다른 조직. 분화 유전자의 수는 조직의 0 시간 지점에 비해 각 조직에서 발아의 과정을 통해 점진적으로 증가.이 대표적인 분석에서, 깃털의 25%, 방사형34%, 스커텔럼 의 41%가 각 조직 내에서 독점적으로 발현되는 것으로 나타났다. 선택한 영역의 가장자리를 태우지 않고 주변 조직에서 선택 영역의 정밀한 절제 및 탈취를 위해 절삭 파라미터를 올바르게 조정하는 것이 중요합니다. 개선된 크로마틴 및 단백질 정제 방법을 통해 질량 분광계 기구를 강화하여 LCM은 세포 유형별 특정 에피소드형 및 프로테오믹스 연구 임플란트에 사용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

포유 동물 조직의 레이저 캡처 Microdissection

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

연구

생물학

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

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우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 1 부

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

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우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 2 부

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 제 3

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...