Name: laser-capture microdissection rna-sequencing for spatial and temporal tissue-specific gene expression analysis in plants
Uploaded: 2020-08-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Australian Research Council Centre of Excellence in Plant Energy Biology (CE140100008) til JW. M.G.L ble støttet av en La Trobe University starter stipend. Vi takker La Trobe Genomics Platform for deres støtte i sekvensering og dataanalyse med høy gjennomstrømning. Vi takker førsteamanuensis Matthew Tucker for ekspertråd om å etablere LCM i laboratoriet vårt.

Siden det endelige produktet er RNA, må du være forsiktig med å unngå å forurense arbeidet med RNases. Bruk av hansker er et must. Bruk dietyl pyrkarbonat (DEPC) -behandlet vann, buffere, etc. Autoklavbuffere og bake glass før bruk.
1. Vev fiksering
<ol><li>Forbered fikseringsmiddel avhengig av arten og vevstypene; for byggfrø, bruk Farmer's fikseringsmiddel (75% etanol, 25% glacial eddiksyre (v / v)).</li>
	<li>Chill fikseringsmiddelet på is før høsting vev.</li>
	<li>Samle plante...

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Alevizos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+cancer+in+vivo+gene+expression+profiling+assisted+by+laser+capture+microdissection+and+microarray+analysis.">Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis.</a> Oncogene. 20 (43), 6196-6204 (2001).</li><li>Cong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+follicular+lymphoma:+description+and+analysis+by+laser+capture+microdissection.">In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection.</a> Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 99 (9), 3376-3382 (2002).</li><li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+protocol+for+xylem+tissues+of+woody+plants.">Laser capture microdissection protocol for xylem tissues of woody plants.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 1965 (2017).</li><li>Casson, S., Spencer, M., Walker, K., Lindsey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+for+the+analysis+of+gene+expression+during+embryogenesis+of+Arabidopsis.">Laser capture microdissection for the analysis of gene expression during embryogenesis of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 42 (1), 111-123 (2005).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LCM-seq+reveals+the+crucial+role+of+LsSOC1+in+heat-promoted+bolting+of+lettuce+(Lactuca+sativa+L.).">LCM-seq reveals the crucial role of LsSOC1 in heat-promoted bolting of lettuce (Lactuca sativa L.).</a> The Plant Journal. 95 (3), 516-528 (2018).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+atlas+of+rice+cell+types+uncovers+cellular,+functional+and+developmental+hierarchies.">A transcriptome atlas of rice cell types uncovers cellular, functional and developmental hierarchies.</a> Nature Genetics. 41 (2), 258-263 (2009).</li><li>Kivivirta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+laser+microdissection+(LMD)+followed+by+transcriptome+analysis+of+plant+reproductive+tissue+in+phylogenetically+distant+angiosperms.">A protocol for laser microdissection (LMD) followed by transcriptome analysis of plant reproductive tissue in phylogenetically distant angiosperms.</a> Plant Methods. 15 (1), 1-11 (2019).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+dynamics+of+the+maize+leaf+transcriptome.">The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome.</a> Nature Genetics. 42 (12), 1060-1067 (2010).</li><li>Liew, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+tissue-specific+regulation+of+transcriptomes+during+barley+(Hordeum+vulgare)+seed+germination.">Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination.</a> The Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).</li><li>Matas, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-and+cell-type+specific+transcriptome+profiling+of+expanding+tomato+fruit+provides+insights+into+metabolic+and+regulatory+specialization+and+cuticle+formation.">Tissue-and cell-type specific transcriptome profiling of expanding tomato fruit provides insights into metabolic and regulatory specialization and cuticle formation.</a> The Plant Cell. 23 (11), 3893-3910 (2011).</li><li>Sakai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser-assisted+microdissection+(LAM)+and+RNA-seq+allows+to+perform+a+comprehensive+transcriptomic+analysis+of+epidermal+cells+of+Arabidopsis+embryo.">Combining laser-assisted microdissection (LAM) and RNA-seq allows to perform a comprehensive transcriptomic analysis of epidermal cells of Arabidopsis embryo.</a> Plant Methods. 14 (1), 10 (2018).</li><li>Zhan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Sequencing+of+Laser-Capture+Microdissected+compartments+of+the+maize+kernel+identifies+regulatory+modules+associated+with+endosperm+cell+differentiation.">RNA Sequencing of Laser-Capture Microdissected compartments of the maize kernel identifies regulatory modules associated with endosperm cell differentiation.</a> The Plant Cell. 27 (3), 513-531 (2015).</li><li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines.">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).</li><li>Zeb, Q., Wang, C., Shafiq, S., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Cell Omics. , 101-135 (2019).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana.">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Protocols. 6 (1), 56 (2011).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Ducos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection:+A+powerful+tool+for+genomics+at+cell+level.">Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 5-27 (2018).</li><li>Nelson, T., Tausta, S. L., Gandotra, N., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+plant+tissue:+what+you+see+is+what+you+get.">Laser microdissection of plant tissue: what you see is what you get.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 57, 181-201 (2006).</li><li>Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Be+more+specific!+Laser-assisted+microdissection+of+plant+cells.">Be more specific! Laser-assisted microdissection of plant cells.</a> Trends in Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+obtaining+high+quality+RNA+from+paraffin+sections+of+plant+tissues+by+laser+microdissection.">A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection.</a> Journal of Plant Research. 123 (6), 807-813 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7 (1), 3 (2006).</li><li>Ferreira, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+mRNA+amplification+approach+for+RNAseq+from+limited+amount+of+RNA.">Linear mRNA amplification approach for RNAseq from limited amount of RNA.</a> Gene. 564 (2), 220-227 (2015).</li><li>Schneider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+T7+RNA+polymerase+based+in+vitro+linear+RNA+amplification+for+use+in+microarray+experiments.">Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments.</a> BMC Genomics. 5 (1), 29 (2004).</li><li>Shanker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+RNA+amplification+kits+for+RNA+sequencing+using+very+low+input+amounts+of+total+RNA.">Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), 4 (2015).</li><li>Bhattacherjee, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+fluorescently+labeled+embryonic+cranial+neural+crest+cells.">Laser capture microdissection of fluorescently labeled embryonic cranial neural crest cells.</a> Genesis. 39 (1), 58-64 (2004).</li><li>Cl&#233;ment-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenchymal+Cells+Contribute+to+Lignification+of+Tracheids+in+Developing+Xylem+of+Norway+Spruce.">Parenchymal Cells Contribute to Lignification of Tracheids in Developing Xylem of Norway Spruce.</a> Plant Physiology. 181 (4), 1552-1572 (2019).</li><li>Schad, M., Lipton, M. S., Giavalisco, P., Smith, R. D., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two-dimensional+electrophoresis+and+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+tissue-specific+protein+profiling+of+laser-microdissected+plant+samples.">Evaluation of two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for tissue-specific protein profiling of laser-microdissected plant samples.</a> Electrophoresis. 26 (14), 2729-2738 (2005).</li><li>Schad, M., Mungur, R., Fiehn, O., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+laser+microdissected+vascular+bundles+of+Arabidopsis+thaliana.">Metabolic profiling of laser microdissected vascular bundles of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 1 (1), 2 (2005).</li><li>Latrasse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+epigenetic+regulation+underlying+unisexual+flower+development+in+Cucumis+melo.">The quest for epigenetic regulation underlying unisexual flower development in Cucumis melo.</a> Epigenetics &amp; Chromatin. 10 (1), 22 (2017).</li><li>Turco, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+gene+expression+regulation+associated+with+vascularization+in+Sorghum+bicolor.">DNA methylation and gene expression regulation associated with vascularization in Sorghum bicolor.</a> The New Phytologist. 214 (3), 1213-1229 (2017).</li><li>Gomez, S. K., Harrison, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+and+its+application+to+analyze+gene+expression+in+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">Laser microdissection and its application to analyze gene expression in arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Pest Management Science: Formerly Pesticide Science. 65 (5), 504-511 (2009).</li><li>Roux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+analysis+of+plant+and+bacterial+gene+expression+in+symbiotic+root+nodules+using+laser-capture+microdissection+coupled+to+RNA+sequencing.">An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing.</a> The Plant Journal. 77 (6), 817-837 (2014).</li><li>Tang, W., Coughlan, S., Crane, E., Beatty, M., Duvick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+laser+microdissection+to+in+planta+gene+expression+profiling+of+the+maize+anthracnose+stalk+rot+fungus+Colletotrichum+graminicola.">The application of laser microdissection to in planta gene expression profiling of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (11), 1240-1250 (2006).</li></ol>

Mange vevsspesifikke genuttrykksstudier har vært begrenset av hånddeksjon av prøver, som er tidkrevende, arbeidsintensive, har høy risiko for forurensning og kan bare bruke prøver som en menneskelig operativ er tilstrekkelig dexterous å høste. LCM er en presis og kontaktfri teknikk for å samle celler fra faste vevsseksjoner ved hjelp av en mekanisk drevet laserstråle under mikroskopisk visualisering.
God prøveklargjøring er avgjørende for LCM. Prosessen er avhengig av riktig fikser...

Planteutvikling og vekst innebærer koordinert handling av transkripsjonelle regulatoriske nettverk i forskjellige celler som finnes i et komplekst cellulært miljø. For å forstå aktiviteten til disse regulatoriske nettverkene, krever vi kunnskap om romlig og timelig genuttrykk innenfor ulike celletyper på tvers av utviklingsstadier. Analyser av genuttrykk utføres imidlertid oftere i hele organer eller bulkvevsprøver på grunn av den tekniske utfordringen med å isolere og analysere et lite antall celler. Metoden vi beskriver her har tillatt å skaffe romlig og temporal vevsspesifikk transkripsjonsanalyse ved å koble LCM med RNA-seq.
LCM ble utviklet for to tiår siden av Emmert-Buck og kolleger1. Teknikken gjorde det mulig for forskere å nøyaktig isolere enkeltceller eller klynger av celler fra deres miljø ved hjelp av direkte mikroskopisk visualisering og manipulasjon med en smal strålelaser1. Siden da har metoden vært mye brukt i kreftbiologi og patologi2,3. Mange planteforskningsgrupper har også tilpasset LCM for bruk med ulike plantearter og ulike vevstyper4,5,6,7,8,9,10,11. Nylig har flere papirer også brukt LCM på eudicot og monocot frø for å studere embryo, endpermer og andre frøstrukturer under frøutvikling ogspiring 10,12,13. De fleste av de andre vanlige encellede isolasjonsmetodene som mikropipettering, cellesortering, magnetisk separasjon og mikrofluidiske plattformer er avhengige av enzymatisk fordøyelse eller mekanisk homogenisering for å dissosiere celler. Dette kan påvirke genuttrykket, og introdusere tekniske gjenstander som forvirrer datatolkning14,15. Disse metodene krever også tidligere kunnskap om markørgener for hver celletype for å relatere de dissosierte cellene til deres romlige plassering og sann celletype. En annen gruppe teknikker avhenger av affinitetsbasert isolering av subcellulære strukturer i stedet for hele celler, for eksempel INTAKT (Isolering av Nuclei merket i celletyper) og TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification)16,17. Affinitetsmerking og rensing av kjerner eller ribosomer er imidlertid teknisk utfordrende hos plantearter som ikke har veletablerte transformasjonsprotokoller. LCM utnytter rask vevfiksering for å bevare transkripsjonsnivåer og konvensjonell histologisk identifikasjon ved direkte visualisering av celler i normal vev / organkontekst, noe som gjør at diskrete celler kan isoleres på kort tid18,19.
Protokollen som presenteres her er en optimalisert metode for isolering av spesifikke celler eller celletyper fra vevsdelene av kornfrø, som kan brukes på de fleste cellene som kan histologisk identifiseres. LCM gir en kontaktfri metode for celleisolasjon, noe som reduserer forurensning og øker integriteten til gjenvunnet RNA. Videre illustrerer metoden kraften i LCM på store genom brede studier som starter med små mengder biologiske materialer. Vi beskriver også lineær forsterkning av RNA for å generere tilstrekkelig inndatamateriale for nedstrøms transkripsjon/transkripsjonsanalyser.
Det er ti hovedtrinn i denne LCM RNA-seq protokollen for romlig og temporal vev-spesifikke transkripsjoner, inkludert fiksering av vevsprøver, dehydrering, parafin infiltrasjon, innebygging, snitting, LCM, RNA ekstraksjon, RNA forsterkning, RNA kvantifisering og qRT-PCR og / eller RNA-seq (Figur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61517/61517fig01.jpg"> Figur 1: Flytskjema for LCM etterfulgt av RNA-seq eller qRT-PCR. LCM er en romlig presis og kontaktfri teknikk for å samle celler fra faste vevsseksjoner ved hjelp av en laserstråle under mikroskopisk visualisering. Prosessen starter med fiksering av vevsprøver, etterfulgt av dehydrering ved hjelp av en gradientserie av etanol og xylen, og avsluttet med parafininfiltrasjon. Prosessen kan være helautomatisk ved hjelp av en vevsprosessor. Når vevet er infiltrert med parafin, er det innebygd i en mugg med smeltet parafin ved hjelp av en innebyggingsstasjon. Snitting utføres ved hjelp av mikrotom satt til ønsket tykkelse. Lysbilder er forberedt og LCM utføres umiddelbart før RNA skal ekstraheres fra fangede celler. RNA-ekstraksjon etterfølges direkte av to runder med RNA-forsterkning før qRT-PCR og/eller RNA-seq. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61517/61517fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid 100 % ACS/R.</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td>
			<td>VWRC20104.323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdhesiveCap 200 opaque</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415190-9181-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear base moulds 8 X 10</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3803015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40718-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity RNA ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low&#173;profile disp.blades DB80LS</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14035843489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PEN</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415190-9041-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td>Ambion (ThermoFisher)</td>
			<td>AMB17515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>On-Column DNase I Digestion Set</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNASE70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation RNA-Seq System V2</td>
			<td>NuGen (Integrated Science)</td>
			<td>7102-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin (Surgipath Paraplast)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>ABI (ThermoFisher)</td>
			<td>KIT0214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Ambion (ThermoFisher)</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td>
			<td>VWRC28975.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Benchtop Tissue Processor</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Heated Paraffin Embedding Module</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>EG1150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Cold Plate</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets</td>
			<td>LAF Technologies Pty Ltd</td>
			<td>Safemate 1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fully Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>RM2265</td>
			<td>with PALMRobo v 4.6 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss PALM MicroBeam LCM system</td>
			<td>Zeiss miscroscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-capture microdissection rna-sequencing for spatial and temporal tissue-specific gene expression analysis in plants

Utviklingen av en kompleks flercellet organisme styres av forskjellige celletyper som har forskjellige transkripsjonsprofiler. For å identifisere transkripsjonelle regulatoriske nettverk som styrer utviklingsprosesser, er det nødvendig å måle de romlige og timelige genuttrykksprofilene til disse individuelle celletypene. Derfor er innsikt i spatio-temporal kontroll av genuttrykk avgjørende for å få forståelse for hvordan biologiske og utviklingsprosesser reguleres. Her beskriver vi en laserfangst mikrodisseksjonsmetode (LCM) for å isolere lite antall celler fra tre byggembryoorganer over et tidsforløpet under spiring etterfulgt av transkripsjonsprofilering. Metoden består av vevfiksering, vevsbehandling, parafininnbygging, snitting, LCM og RNA-ekstraksjon etterfulgt av sanntids PCR eller RNA-seq. Denne metoden har gjort oss i stand til å få romlige og timelige profiler av frø organ transkripsjoner fra varierende antall celler (titalls til hundrevis), noe som gir mye større vev-spesifisitet enn typiske bulk-vev analyser. Fra disse dataene var vi i stand til å definere og sammenligne transkripsjonelle regulatoriske nettverk samt forutsi kandidat regulatoriske transkripsjonsfaktorer for individuelle vev. Metoden skal gjelde for andre plantevev med minimal optimalisering.

Vi genererte romlige og temporale vevsspesifikke transkripsjoner fra byggfrø under spiring ved hjelp av LCM RNA-seq-protokollen10. Studien ble utført ved å bruke LCM RNA-seq til et lite antall celler fra tre embryoorganer (plumule, radikkelspiss, scutellum) hver 8 timer over et 48 h tidskurs under spiring (0-48 h, 7 tidspunkter) (Figur 2A, B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/fil...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants at JoVE.com

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

Presentert her er en protokoll for laser-fangst mikrodisseksjon (LCM) av plantevev. LCM er en mikroskopisk teknikk for å isolere områder av vev på en forurensningsfri måte. Prosedyren inkluderer vev fiksering, parafin innebygging, snitting, LCM og RNA ekstraksjon. RNA brukes i nedstrøms vevsspesifikke, tidsmessig løste analyser av transkripsjoner.

Laserfangst mikrodisseksjon RNA-sekvensering for romlig og temporal vevspesifikt genuttrykksanalyse i planter

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Denne protokollen bruker Laser-Capture Microdissection kombinert med RNA-sekvensering for å få romlige og temporale transkripsjoner fra bestemte celler i dyreplanter, ved hjelp av små mengder biologiske materialer. Den største fordelen med laserteknikk er at det letter direkte visualisering av celler innenfor normal vevssammenheng, slik at de diskrete cellene kan isoleres nøyaktig på en kontaktfri måte. Selv om denne protokollen er optimalisert for isolering av planteceller, kan den brukes på de fleste celler som kan identifiseres stologisk.God prøveforberedelse er kritisk. Derfor, en utfører denne teknikken for første gang, prop optimalisering av vev fiksering og innebygging er viktig før Laser-Capture Microdissection. Før du samler vevsprøven, må du forberede et fikseringsmiddel som passer til arten og vevstypen som skal høstes.For byggfrø, kutt frøprøvene i to før du senker prøvene i minst et 10 X volum iskaldt fikseringsmiddel. Bruk vakuuminfiltrasjon for å akselerere penetrasjonen av fikseringen. Vevet skal synke ved slutten av infiltrasjonen, og oppdater deretter fikseringen for en overnattingsinkubasjon og overfør prøvene til kassetter for vevsbehandling.Legg de vevsbelastede kassettene i metallkurven på en automatisk prosessor og fest metallkurven til holderen over kammer en. Sett programmet på kontrollpanelene på vevsprosessoren og trykk start for å starte det automatiske behandlingsprogrammet. Systemet vil dehydrere prøvene ved å dyppe kassettene i en gradientserie etanol i 90 minutter per konsentrasjon som angitt.Etter den siste etanolsenkingen vil systemet senke prøvene i xylengradienter i 90 minutter per løsning som angitt. Etterfulgt av 290 minutters nedsenking i smeltet parafin på 55 til 60 grader Celsius. Neste morgen fjerner du parafininfiltrerte kassetter fra vevsprosessoren og går videre til parafininnbyggingen.Neste morgen, bruk fine tang for å overføre prosessprøvene til passende størrelse former og legge smeltet parafin over hver prøve. For byggfrø, orienter prøvene i parafinen langsgående til skjæreretningen for å lette oppkjøpet av langsgående seksjoner. Plasser en ren kassett på formen og sørg for at hele kassetten er helt dekket med tilstrekkelig volum parafin for å feste prøven til kassetten.Plasser deretter formen på en kald plate i 10 til 20 minutter til parafinen er satt før du slipper blokken fra formen. For å forberede en PEN Membran Slides, senk lysbildene i RNS deaktiveringsløsning i tre sekunder etterfulgt av to korte vasker og DEPC behandlet vann. Kjør deretter lysbildene i en 370 grader Celsius inkubator for å fjerne eventuelle rester løsning og UV behandle lysbildene i en laminær strømningskabinett i 30 minutter for å forbedre deres parafin ikke hasselnøtter.For en prøve vevsseksjon plasserer parafinblokkene på den kalde platen og fyller vannbadet med DEPC behandlet vann, og varm deretter til 42 grader Celsius. Trim blokker til dybden av regionen av interesse og seksjon parafin blokker til en seks til 10 mikron tykkelse. En godt delt blokk vil danne et bånd på kanten av bladet.Bruk en fin pinsett for å forsiktig overføre bånd fra mikrotomen til vannbadet, vær forsiktig med at båndet ligger flatt på overflaten av vannet. For å samle seksjonene, holde en lysbilde i en 45 graders vinkel, bruk en oppadgående bevegelse for å løfte et bånd opp av vannet på lysbildet og bruke et lofritt vev for å forsiktig fjerne overflødig vann. Når alle seksjonene er samlet, vask lysbildene med 320 andre vasker i xylen etterfulgt av 230 sekunder vasker i 100% etanol og 230 andre vasker i 70% etanol.For å mikrodissect celler av interesse fra deparraffiniserte og tørre vev seksjoner, last lysbilder på de tre LCM mikroskop spor og laste samling tube inn i de tilgjengelige sporene. Flytt scenen for å finne området av prøven som må kuttes og kutte et tomt segment uten vev på membranlysbildet. For å optimalisere skjærehastigheten og kuttingen i lasertrykk katapulting energi og fokus.Bruk tegneverktøyene til å skissere interesseområdet i vevet og bruke de optimaliserte parametrene og Robo LPC-funksjonen til å katapultceller i klebehetslokkene. Velg flagg fra elementene listen for å bruke flaggverktøyet til å markere områder av interesse. Kontroller kontrollknappen for hetten for å inspisere klebehetten for å bekrefte at prøvene er tatt opp.Vanligvis kreves 10 til 15 seksjoner per hette for RNA-ekstraksjon. Umiddelbart etter at alle prøvene er anskaffet, går du umiddelbart videre til RNA-ekstraksjon for å unngå RNA-nedbrytning. Etter RNA ekstraksjon og RNA forsterkning bruke en automatisert elektroforese system, i henhold til produsentens instruksjoner for å kvantifisere og kvalifisere antisense RNA.I denne studien, LCM, RNA-sekvensering ble brukt på et lite antall celler fra tre embryoorganer, hver åttende time over en 48 timers tidskurs under spiring. Det er viktig å justere kutteparametrene riktig for å tillate at vevet av interesse skal kuttes nøyaktig og løsnes fra det omkringliggende vevet uten å brenne kanten av det valgte området. Ramification av den totale RNA før RNA forsterkning gjør det mulig å oppdage distinkte elektroforetiske bånd og fluorescerende topper på 18 og 28S ribosomale underenheter i RNA-prøver av god kvalitet.Vellykket syntetisert antisense RNA vil vise en unimodal symmetrisk størrelsesfordeling fra 100 til 1000 nukleotider med en topp rundt 300 nukleotider etter to runder med forsterkning. Flerdimensjonal skala plotting av gener uttrykt i de forskjellige vev over 48 timer med spiring, illustrerer en større likhet mellom prøver av et enkelt vev enn mellom prøver fra samme tidspunkt, men forskjellige vev. Antall differensialt uttrykte gener øker gradvis i løpet av spiring i hvert vev i forhold til null timers tidspunkt for vevet.I denne representative analysen ble 25% av plumule, 34% av radikkel og 41% av scutellum differensialt uttryktgener funnet å være utelukkende uttrykt i hvert vev. Det er viktig å justere skjæreparametrene riktig for en presis eksisjon og oppløsning av velgerområdet fra det omkringliggende vevet uten å brenne kanten av den valgte regionen. Med forbedrede kromatin- og proteinrensemetoder, og forbedre massespektrometriinstrumentet, kan LCM brukes til celletypespesifikke epigenomiske og proteomics-studier implantater.

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse av global RNA syntese på celle-nivå etter Hypoksi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...