Name: laser-capture microdissection rna-sequencing for spatial and temporal tissue-specific gene expression analysis in plants
Uploaded: 2020-08-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Australian Research Council Centre of Excellence in Plant Energy Biology (CE140100008) para jw. M.G.L foi apoiado por uma bolsa inicial da Universidade La Trobe. Agradecemos à Plataforma de Genômica La Trobe por seu apoio em sequenciamento de alta produtividade e análise de dados. Agradecemos ao Professor Associado Matthew Tucker por conselhos especializados sobre a criação de LCM em nosso laboratório.

Como o produto final é RNA, tome cuidado para evitar contaminar o trabalho com RNases. Usar luvas é imperdível. Use pirocarbonato dietil (DEPC) -água tratada, tampões, etc. Tampões de autoclave e assar vidros antes de usar.
1. Fixação de tecidos
<ol><li>Preparar fixação de escolha dependendo das espécies e tipos de tecidos; para sementes de cevada, use o fixador do Farmer (75% de etanol, 25% ácido acético glacial (v/v)).</li>
	<li>Esfrie o fixador no gelo antes de colher tecidos...

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Alevizos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+cancer+in+vivo+gene+expression+profiling+assisted+by+laser+capture+microdissection+and+microarray+analysis.">Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis.</a> Oncogene. 20 (43), 6196-6204 (2001).</li><li>Cong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+follicular+lymphoma:+description+and+analysis+by+laser+capture+microdissection.">In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection.</a> Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 99 (9), 3376-3382 (2002).</li><li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+protocol+for+xylem+tissues+of+woody+plants.">Laser capture microdissection protocol for xylem tissues of woody plants.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 1965 (2017).</li><li>Casson, S., Spencer, M., Walker, K., Lindsey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+for+the+analysis+of+gene+expression+during+embryogenesis+of+Arabidopsis.">Laser capture microdissection for the analysis of gene expression during embryogenesis of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 42 (1), 111-123 (2005).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LCM-seq+reveals+the+crucial+role+of+LsSOC1+in+heat-promoted+bolting+of+lettuce+(Lactuca+sativa+L.).">LCM-seq reveals the crucial role of LsSOC1 in heat-promoted bolting of lettuce (Lactuca sativa L.).</a> The Plant Journal. 95 (3), 516-528 (2018).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+atlas+of+rice+cell+types+uncovers+cellular,+functional+and+developmental+hierarchies.">A transcriptome atlas of rice cell types uncovers cellular, functional and developmental hierarchies.</a> Nature Genetics. 41 (2), 258-263 (2009).</li><li>Kivivirta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+laser+microdissection+(LMD)+followed+by+transcriptome+analysis+of+plant+reproductive+tissue+in+phylogenetically+distant+angiosperms.">A protocol for laser microdissection (LMD) followed by transcriptome analysis of plant reproductive tissue in phylogenetically distant angiosperms.</a> Plant Methods. 15 (1), 1-11 (2019).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+dynamics+of+the+maize+leaf+transcriptome.">The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome.</a> Nature Genetics. 42 (12), 1060-1067 (2010).</li><li>Liew, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+tissue-specific+regulation+of+transcriptomes+during+barley+(Hordeum+vulgare)+seed+germination.">Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination.</a> The Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).</li><li>Matas, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-and+cell-type+specific+transcriptome+profiling+of+expanding+tomato+fruit+provides+insights+into+metabolic+and+regulatory+specialization+and+cuticle+formation.">Tissue-and cell-type specific transcriptome profiling of expanding tomato fruit provides insights into metabolic and regulatory specialization and cuticle formation.</a> The Plant Cell. 23 (11), 3893-3910 (2011).</li><li>Sakai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser-assisted+microdissection+(LAM)+and+RNA-seq+allows+to+perform+a+comprehensive+transcriptomic+analysis+of+epidermal+cells+of+Arabidopsis+embryo.">Combining laser-assisted microdissection (LAM) and RNA-seq allows to perform a comprehensive transcriptomic analysis of epidermal cells of Arabidopsis embryo.</a> Plant Methods. 14 (1), 10 (2018).</li><li>Zhan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Sequencing+of+Laser-Capture+Microdissected+compartments+of+the+maize+kernel+identifies+regulatory+modules+associated+with+endosperm+cell+differentiation.">RNA Sequencing of Laser-Capture Microdissected compartments of the maize kernel identifies regulatory modules associated with endosperm cell differentiation.</a> The Plant Cell. 27 (3), 513-531 (2015).</li><li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines.">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).</li><li>Zeb, Q., Wang, C., Shafiq, S., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Cell Omics. , 101-135 (2019).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana.">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Protocols. 6 (1), 56 (2011).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Ducos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection:+A+powerful+tool+for+genomics+at+cell+level.">Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 5-27 (2018).</li><li>Nelson, T., Tausta, S. L., Gandotra, N., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+plant+tissue:+what+you+see+is+what+you+get.">Laser microdissection of plant tissue: what you see is what you get.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 57, 181-201 (2006).</li><li>Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Be+more+specific!+Laser-assisted+microdissection+of+plant+cells.">Be more specific! Laser-assisted microdissection of plant cells.</a> Trends in Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+obtaining+high+quality+RNA+from+paraffin+sections+of+plant+tissues+by+laser+microdissection.">A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection.</a> Journal of Plant Research. 123 (6), 807-813 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7 (1), 3 (2006).</li><li>Ferreira, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+mRNA+amplification+approach+for+RNAseq+from+limited+amount+of+RNA.">Linear mRNA amplification approach for RNAseq from limited amount of RNA.</a> Gene. 564 (2), 220-227 (2015).</li><li>Schneider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+T7+RNA+polymerase+based+in+vitro+linear+RNA+amplification+for+use+in+microarray+experiments.">Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments.</a> BMC Genomics. 5 (1), 29 (2004).</li><li>Shanker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+RNA+amplification+kits+for+RNA+sequencing+using+very+low+input+amounts+of+total+RNA.">Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), 4 (2015).</li><li>Bhattacherjee, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+fluorescently+labeled+embryonic+cranial+neural+crest+cells.">Laser capture microdissection of fluorescently labeled embryonic cranial neural crest cells.</a> Genesis. 39 (1), 58-64 (2004).</li><li>Cl&#233;ment-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenchymal+Cells+Contribute+to+Lignification+of+Tracheids+in+Developing+Xylem+of+Norway+Spruce.">Parenchymal Cells Contribute to Lignification of Tracheids in Developing Xylem of Norway Spruce.</a> Plant Physiology. 181 (4), 1552-1572 (2019).</li><li>Schad, M., Lipton, M. S., Giavalisco, P., Smith, R. D., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two-dimensional+electrophoresis+and+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+tissue-specific+protein+profiling+of+laser-microdissected+plant+samples.">Evaluation of two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for tissue-specific protein profiling of laser-microdissected plant samples.</a> Electrophoresis. 26 (14), 2729-2738 (2005).</li><li>Schad, M., Mungur, R., Fiehn, O., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+laser+microdissected+vascular+bundles+of+Arabidopsis+thaliana.">Metabolic profiling of laser microdissected vascular bundles of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 1 (1), 2 (2005).</li><li>Latrasse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+epigenetic+regulation+underlying+unisexual+flower+development+in+Cucumis+melo.">The quest for epigenetic regulation underlying unisexual flower development in Cucumis melo.</a> Epigenetics &amp; Chromatin. 10 (1), 22 (2017).</li><li>Turco, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+gene+expression+regulation+associated+with+vascularization+in+Sorghum+bicolor.">DNA methylation and gene expression regulation associated with vascularization in Sorghum bicolor.</a> The New Phytologist. 214 (3), 1213-1229 (2017).</li><li>Gomez, S. K., Harrison, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+and+its+application+to+analyze+gene+expression+in+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">Laser microdissection and its application to analyze gene expression in arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Pest Management Science: Formerly Pesticide Science. 65 (5), 504-511 (2009).</li><li>Roux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+analysis+of+plant+and+bacterial+gene+expression+in+symbiotic+root+nodules+using+laser-capture+microdissection+coupled+to+RNA+sequencing.">An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing.</a> The Plant Journal. 77 (6), 817-837 (2014).</li><li>Tang, W., Coughlan, S., Crane, E., Beatty, M., Duvick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+laser+microdissection+to+in+planta+gene+expression+profiling+of+the+maize+anthracnose+stalk+rot+fungus+Colletotrichum+graminicola.">The application of laser microdissection to in planta gene expression profiling of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (11), 1240-1250 (2006).</li></ol>

Muitos estudos de expressão genética específicos do tecido têm sido limitados pela dissecação manual de amostras, que é demorado, trabalhoso, tem um alto risco de contaminação e só pode utilizar amostras que um agente humano é suficientemente hábil para colher. LCM é uma técnica precisa e livre de contatos para coletar células de seções de tecido fixo usando um raio laser operado mecanicamente sob visualização microscópica.
Uma boa preparação amostral é fundamental para ...

O desenvolvimento e o crescimento das plantas envolvem a ação coordenada de redes reguladoras transcricionais dentro de diferentes células que existem em um ambiente celular complexo. Para entender a atividade dessas redes regulatórias, exigimos o conhecimento da expressão genética espacial e temporal dentro de diferentes tipos de células em estágios de desenvolvimento. No entanto, as análises da expressão genética são mais comumente conduzidas em órgãos inteiros ou amostras de tecido a granel devido ao desafio técnico de isolar e analisar um pequeno número de células. O método que descrevemos aqui permitiu a obtenção de análises de transcriptome espacial e temporal específicas do tecido, acoplando LCM com RNA-seq.
O LCM foi desenvolvido há duas décadas pela Emmert-Buck e pelos colegas1. A técnica permitiu aos pesquisadores isolar precisamente células únicas ou aglomerados de células de seu ambiente usando visualização e manipulação microscópica direta com um laser de feixe estreito1. Desde então, o método tem sido amplamente utilizado em biologia do câncer e patologia2,3. Muitos grupos de pesquisa vegetal também adaptaram LCM para uso com diferentes espécies de plantas e diferentes tipos de tecidos4,,5,,6,,7,8,,9,,10,,11. Recentemente, vários artigos também utilizaram LCM em sementes de eudicot e monocot para estudar embriões, endospermos e outras estruturas de sementes durante o desenvolvimento de sementes e germinação10,,12,,13. A maioria dos outros métodos de isolamento unicelular comumente usados, como micro-pipetação, classificação celular, separação magnética e plataformas microfluidas dependem da digestão enzimática ou homogeneização mecânica para dissociar células. Isso pode perturbar a expressão genética, introduzindo artefatos técnicos que confundem a interpretação dos dados14,15. Esses métodos também requerem conhecimento prévio de genes marcadores para cada tipo de célula para relacionar as células dissociadas à sua localização espacial e ao verdadeiro tipo celular. Um outro grupo de técnicas depende do isolamento baseado em afinidade de estruturas subcelulares em vez de células inteiras, como INTACT (Isolamento de Núcleos Marcados em Tipos de Células) e TRAP (Traduzindo Purificação de Afinidade Ribossome)16,17. No entanto, a rotulagem e purificação de núcleos ou ribossomos são tecnicamente desafiadoras em espécies vegetais que não possuem protocolos de transformação bem estabelecidos. O LCM aproveita a fixação rápida do tecido para preservar os níveis de transcrição e a identificação histológica convencional por visualização direta das células dentro de seu contexto normal de tecido/órgão, o que permite que células discretas sejam isoladas em um curto período de tempo18,19.
O protocolo aqui apresentado é um método otimizado para o isolamento de células específicas ou tipos celulares das seções teciduais das sementes de cereais, que podem ser aplicadas à maioria das células que podem ser histologicamente identificadas. O LCM fornece um método livre de contatos de isolamento celular, reduzindo consideravelmente a contaminação e aumentando a integridade do RNA recuperado. Além disso, o método ilustra o poder do LCM em estudos de grande escala de genomas, começando com pequenas quantidades de materiais biológicos. Também descrevemos a amplificação linear do RNA para gerar material de entrada suficiente para análises de transcrição/transcriptome a jusante.
Existem dez etapas principais neste protocolo LCM RNA-seq para transcriçãos espaciais e temporais específicas do tecido, incluindo fixação de amostras de tecido, desidratação, infiltração de parafina, incorporação, secção, LCM, extração de RNA, amplificação de RNA, quantificação de RNA e qRT-PCR e/ou RNA-seq(Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61517/61517fig01.jpg"> Figura 1: Fluxograma de LCM seguido por RNA-seq ou qRT-PCR. LCM é uma técnica espacialmente precisa e livre de contatos para coletar células de seções de tecido fixo usando um raio laser sob visualização microscópica. O processo começa com fixação de amostras de tecido, seguido de desidratação usando uma série gradiente de etanol e xileno, e finalizado com infiltração de parafina. O processo pode ser totalmente automatizado usando um processador de tecido. Uma vez que o tecido é infiltrado com parafina, ele é incorporado em um molde com parafina derretida usando uma estação de incorporação. A secção é realizada utilizando-se microtoma definido para a espessura desejada. Slides são preparados e LCM conduzido imediatamente antes do RNA deve ser extraído das células capturadas. A extração de RNA é seguida diretamente por duas rodadas de amplificação de RNA antes do qRT-PCR e/ou RNA-seq. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61517/61517fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid 100 % ACS/R.</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td>
			<td>VWRC20104.323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdhesiveCap 200 opaque</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415190-9181-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear base moulds 8 X 10</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3803015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40718-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity RNA ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low&#173;profile disp.blades DB80LS</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14035843489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PEN</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415190-9041-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td>Ambion (ThermoFisher)</td>
			<td>AMB17515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>On-Column DNase I Digestion Set</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNASE70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation RNA-Seq System V2</td>
			<td>NuGen (Integrated Science)</td>
			<td>7102-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin (Surgipath Paraplast)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>ABI (ThermoFisher)</td>
			<td>KIT0214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Ambion (ThermoFisher)</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td>
			<td>VWRC28975.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Benchtop Tissue Processor</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Heated Paraffin Embedding Module</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>EG1150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Cold Plate</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets</td>
			<td>LAF Technologies Pty Ltd</td>
			<td>Safemate 1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fully Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>RM2265</td>
			<td>with PALMRobo v 4.6 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss PALM MicroBeam LCM system</td>
			<td>Zeiss miscroscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-capture microdissection rna-sequencing for spatial and temporal tissue-specific gene expression analysis in plants

O desenvolvimento de um complexo organismo multicelular é regido por tipos de células distintas que têm diferentes perfis transcricionais. Para identificar redes regulatórias transcricionais que regem os processos de desenvolvimento é necessário medir os perfis de expressão genética espacial e temporal desses tipos de células individuais. Portanto, a visão sobre o controle espóvio-temporal da expressão genética é essencial para obter a compreensão de como os processos biológicos e de desenvolvimento são regulados. Aqui, descrevemos um método de microdissecção de captura a laser (LCM) para isolar um pequeno número de células de três órgãos de embrião de cevada durante um curso de tempo durante a germinação seguido de perfil de transcrição. O método consiste em fixação tecidual, processamento de tecidos, incorporação de parafina, secção, LCM e extração de RNA seguido de PCR em tempo real ou RNA-seq. Este método nos permitiu obter perfis espaciais e temporais de transcritos de órgãos de sementes de diferentes números de células (dezenas a centenas), fornecendo uma especificidade tecidual muito maior do que as análises típicas de tecido a granel. A partir desses dados, conseguimos definir e comparar redes regulatórias transcricionais, bem como prever fatores de transcrição regulatória de candidatos para tecidos individuais. O método deve ser aplicável a outros tecidos vegetais com otimização mínima.

Geramos transcrições espaciais e temporais específicas de tecidoes a partir de sementes de cevada durante a germinação usando nosso protocolo LCM RNA-seq10. O estudo foi realizado aplicando LCM RNA-seq a um pequeno número de células de três órgãos embrionários (plumule, ponta de radículo, scutellum) a cada 8 h durante um curso de tempo de 48h durante a germinação (0-48 h, 7 pontos de tempo)(Figura 2A,B).
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Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

Apresentado aqui é um protocolo para microdisseção de captura a laser (LCM) de tecidos vegetais. LCM é uma técnica microscópica para isolar áreas de tecido de forma livre de contaminação. O procedimento inclui fixação tecidual, incorporação de parafina, secção, LCM e extração de RNA. O RNA é usado na análise temporalmente resolvida do tecido a jusante dos transcriptomes.

Microdissection laser RNA-Sequenciamento para Análise de Expressão Genética Espacial e Temporal-Específica do Tecido em Plantas

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Este protocolo utiliza microdisseção de captura a laser juntamente com RNA-Sequenciamento para obter transcrições espaciais e temporais de células específicas em plantas de interesses, utilizando pequenas quantidades de materiais biológicos. A principal vantagem da técnica de laser é que facilita a visualização direta das células dentro do contexto normal do tecido, permitindo que as células discretas sejam precisamente isoladas de forma livre de contato. Embora este protocolo seja otimizado para o isolamento das células vegetais, ele pode ser aplicado à maioria das células que podem ser identificadas estologicamente.Uma boa preparação para a amostra é fundamental. Portanto, uma realização desta técnica pela primeira vez, a otimização do suporte da fixação do tecido e a incorporação é importante antes da Microdisseção de Captura a Laser. Antes de coletar a amostra de tecido, prepare um fixador adequado à espécie e ao tipo de tecido a ser colhido.Para a semente de cevada, corte as amostras de sementes ao meio antes de submergir as amostras em pelo menos um volume de 10 X de fixação gelada. Use infiltração a vácuo para acelerar a penetração do fixador. O tecido deve afundar até o final da infiltração, em seguida, refrescar o fixador para uma incubação durante a noite e transferir as amostras em para processamento de tecidos.Coloque as fitas carregadas de tecido na cesta metálica de um processador automático e coloque a cesta de metal ao seu suporte acima da primeira câmara. Defina o programa nos painéis de controle do processador de tecido e pressione comece a iniciar o programa de processamento automático. O sistema desidratará as amostras mergulhando as fitas em uma série gradiente de etanol por 90 minutos por concentração, conforme indicado.Após a última imersão do etanol, o sistema submergirá as amostras em gradientes de xileno por 90 minutos por solução, conforme indicado. Seguido por imersões de 290 minutos em parafina derretida a 55 a 60 graus Celsius. Na manhã seguinte, remova as fitas infiltradas da parafina do processador de tecido e prossiga para a incorporação da parafina.Na manhã seguinte, use fórceps finos para transferir as amostras do processo em moldes de tamanho adequado e adicionar parafina derretida sobre cada amostra. Para sementes de cevada, oriente as amostras na parafina longitudinalmente à direção de corte para facilitar a aquisição de seções longitudinais. Coloque um limpo sobre o molde e certifique-se de que todo o esteja totalmente coberto com um volume suficiente de parafina para fixar a amostra no.Em seguida, coloque o molde em uma placa fria por 10 a 20 minutos até que a parafina esteja definida antes de soltar o bloco do molde. Para preparar uma lâmina de membrana PEN, submergir os slides na solução desativação RNS por três segundos seguidos por duas lavagens breves e água tratada DEPC. Em seguida, dirija os slides em uma incubadora de 370 graus Celsius para remover qualquer solução restante e UV tratar os slides em um gabinete de fluxo laminar por 30 minutos para melhorar sua parafina não avelãs.Para uma seção de tecido amostral, coloque os blocos de parafina na placa fria e encha o banho de água com a água tratada DO DEPC, depois aqueça até 42 graus Celsius. Corte blocos até a profundidade da região de interesse e separe os blocos de parafina a uma espessura de seis a 10 mícrons. Um bloco bem seccionado formará uma fita na borda da lâmina.Use uma pinça fina para transferir suavemente fitas do microtome para o banho de água, tomando cuidado para que a fita fique plana sobre a superfície da água. Para coletar as seções, segurando um slide em um ângulo de 45 graus, use um movimento ascendente para levantar uma fita da água para fora da lâmina e use um tecido livre de fiapos para remover cuidadosamente o excesso de água. Quando todas as seções tiverem sido coletadas, lave os slides com 320 segundos de lavagem em xileno seguido de 230 segundos em 100% etanol e 230 segundos em 70% de etanol.Para microdissectar células de interesse das seções de tecido desparrafinado e seco, carregue lâminas nos três slots de microscópio LCM e tubo de coleta de carga nos slots disponíveis. Mova o estágio para localizar a região da amostra que precisa ser cortada e cortar um segmento em branco livre de tecido na lâmina da membrana. Para otimizar a velocidade de corte e o corte na pressão a laser catapultando energia e foco.Use as ferramentas de desenho para delinear a área de interesse no tecido e usar os parâmetros otimizados e a função Robo LPC para catapultar células para as tampas adesivas. Selecione a bandeira da lista de elementos para usar a ferramenta de sinalização para marcar as regiões de interesse. Verifique o botão de verificação da tampa para inspecionar a tampa adesiva, para confirmar se as amostras foram capturadas.Normalmente são necessárias 10 a 15 seções por tampa para extração de RNA. Imediatamente após a aquisição de todas as amostras, proceda imediatamente à extração de RNA para evitar a degradação do RNA. Após a extração de RNA e a amplificação do RNA, use um sistema automatizado de eletroforese, de acordo com as instruções do fabricante para quantificar e qualificar o RNA antissense.Neste estudo, LCM, o sequenciamento de RNA foi aplicado a um pequeno número de células de três órgãos embriões, a cada oito horas durante um curso de tempo de 48 horas durante a germinação. É importante ajustar corretamente os parâmetros de corte para permitir que o tecido de interesse seja precisamente cortado e desalojado do tecido circundante sem queimar a borda da área selecionada. A ramificação do RNA total antes da amplificação do RNA permite a detecção de bandas eletroforéticas distintas e picos fluorescentes de subunidades ribossômicas de 18 e 28S em amostras de RNA de boa qualidade.O RNA antissense sintetizado com sucesso exibirá uma distribuição de tamanho simétrico unimodal de 100 a 1000 nucleotídeos com um pico em torno de 300 nucleotídeos após duas rodadas de amplificação. A plotagem em escala multidimensional de genes expressos nos diferentes tecidos ao longo de 48 horas de germinação, ilustra uma maior semelhança entre amostras de um único tecido do que entre amostras do mesmo ponto de tempo, mas tecidos diferentes. O número de genes expressos diferencialmente aumenta progressivamente ao longo da germinação em cada tecido em relação ao ponto de tempo de zero hora do tecido.Nesta análise representativa, 25% da plumule, 34% de radículo e 41% dos genes expressos diferencialmente foram expressos exclusivamente dentro de cada tecido. É importante ajustar corretamente os parâmetros de corte para uma excisão precisa e desalojadeira da área seletora do tecido circundante sem queimar a borda da região selecionada. Com métodos aprimorados de cromatina e purificação de proteínas, e o aprimoramento do instrumento de espectrometria de massa, o LCM pode ser usado para implantes de estudos epigenômicos e proteômicos específicos do tipo celular.

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser Microdissecção Captura de tecidos de mamíferos

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Biologia

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

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Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Infecção pelo Vírus Vaccinia e Análise Temporal da Expressão Gênica de Vírus: Parte 1

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Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

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Infecção pelo Vírus Vaccinia e Análise Temporal da Expressão Gênica de Vírus: Parte 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Infecção pelo Vírus Vaccinia e Análise Temporal da Expressão Gênica de Vírus: Parte 3

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

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