Name: laser-capture microdissection rna-sequencing for spatial and temporal tissue-specific gene expression analysis in plants
Uploaded: 2020-08-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants at JoVE.com

Эта работа была поддержана Австралийский научно-исследовательский совет Центр передового опыта в области биологии энергии растений (CE140100008) в JW. M.G.L была поддержана стартовым грантом Университета Ла Троб. Мы благодарим платформу La Trobe Genomics platform за поддержку в последовательности с высокой пропускной способностью и анализе данных. Мы благодарим доцента Мэтью Такера за экспертные советы по созданию LCM в нашей лаборатории.

Поскольку конечный продукт РНК, заботиться, чтобы избежать загрязнения работы с RNases. Ношение перчаток является обязательным. Используйте дитил пирокарбонат (DEPC) - обработанную воду, буферы и т.д. Буферы автоклава и выпекать стеклянную посуду перед использованием.
1. Фиксац?...

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Alevizos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+cancer+in+vivo+gene+expression+profiling+assisted+by+laser+capture+microdissection+and+microarray+analysis.">Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis.</a> Oncogene. 20 (43), 6196-6204 (2001).</li><li>Cong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+follicular+lymphoma:+description+and+analysis+by+laser+capture+microdissection.">In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection.</a> Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 99 (9), 3376-3382 (2002).</li><li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+protocol+for+xylem+tissues+of+woody+plants.">Laser capture microdissection protocol for xylem tissues of woody plants.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 1965 (2017).</li><li>Casson, S., Spencer, M., Walker, K., Lindsey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+for+the+analysis+of+gene+expression+during+embryogenesis+of+Arabidopsis.">Laser capture microdissection for the analysis of gene expression during embryogenesis of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 42 (1), 111-123 (2005).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LCM-seq+reveals+the+crucial+role+of+LsSOC1+in+heat-promoted+bolting+of+lettuce+(Lactuca+sativa+L.).">LCM-seq reveals the crucial role of LsSOC1 in heat-promoted bolting of lettuce (Lactuca sativa L.).</a> The Plant Journal. 95 (3), 516-528 (2018).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+atlas+of+rice+cell+types+uncovers+cellular,+functional+and+developmental+hierarchies.">A transcriptome atlas of rice cell types uncovers cellular, functional and developmental hierarchies.</a> Nature Genetics. 41 (2), 258-263 (2009).</li><li>Kivivirta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+laser+microdissection+(LMD)+followed+by+transcriptome+analysis+of+plant+reproductive+tissue+in+phylogenetically+distant+angiosperms.">A protocol for laser microdissection (LMD) followed by transcriptome analysis of plant reproductive tissue in phylogenetically distant angiosperms.</a> Plant Methods. 15 (1), 1-11 (2019).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+dynamics+of+the+maize+leaf+transcriptome.">The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome.</a> Nature Genetics. 42 (12), 1060-1067 (2010).</li><li>Liew, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+tissue-specific+regulation+of+transcriptomes+during+barley+(Hordeum+vulgare)+seed+germination.">Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination.</a> The Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).</li><li>Matas, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-and+cell-type+specific+transcriptome+profiling+of+expanding+tomato+fruit+provides+insights+into+metabolic+and+regulatory+specialization+and+cuticle+formation.">Tissue-and cell-type specific transcriptome profiling of expanding tomato fruit provides insights into metabolic and regulatory specialization and cuticle formation.</a> The Plant Cell. 23 (11), 3893-3910 (2011).</li><li>Sakai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser-assisted+microdissection+(LAM)+and+RNA-seq+allows+to+perform+a+comprehensive+transcriptomic+analysis+of+epidermal+cells+of+Arabidopsis+embryo.">Combining laser-assisted microdissection (LAM) and RNA-seq allows to perform a comprehensive transcriptomic analysis of epidermal cells of Arabidopsis embryo.</a> Plant Methods. 14 (1), 10 (2018).</li><li>Zhan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Sequencing+of+Laser-Capture+Microdissected+compartments+of+the+maize+kernel+identifies+regulatory+modules+associated+with+endosperm+cell+differentiation.">RNA Sequencing of Laser-Capture Microdissected compartments of the maize kernel identifies regulatory modules associated with endosperm cell differentiation.</a> The Plant Cell. 27 (3), 513-531 (2015).</li><li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines.">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).</li><li>Zeb, Q., Wang, C., Shafiq, S., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Cell Omics. , 101-135 (2019).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana.">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Protocols. 6 (1), 56 (2011).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Ducos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection:+A+powerful+tool+for+genomics+at+cell+level.">Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 5-27 (2018).</li><li>Nelson, T., Tausta, S. L., Gandotra, N., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+plant+tissue:+what+you+see+is+what+you+get.">Laser microdissection of plant tissue: what you see is what you get.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 57, 181-201 (2006).</li><li>Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Be+more+specific!+Laser-assisted+microdissection+of+plant+cells.">Be more specific! Laser-assisted microdissection of plant cells.</a> Trends in Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+obtaining+high+quality+RNA+from+paraffin+sections+of+plant+tissues+by+laser+microdissection.">A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection.</a> Journal of Plant Research. 123 (6), 807-813 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7 (1), 3 (2006).</li><li>Ferreira, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+mRNA+amplification+approach+for+RNAseq+from+limited+amount+of+RNA.">Linear mRNA amplification approach for RNAseq from limited amount of RNA.</a> Gene. 564 (2), 220-227 (2015).</li><li>Schneider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+T7+RNA+polymerase+based+in+vitro+linear+RNA+amplification+for+use+in+microarray+experiments.">Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments.</a> BMC Genomics. 5 (1), 29 (2004).</li><li>Shanker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+RNA+amplification+kits+for+RNA+sequencing+using+very+low+input+amounts+of+total+RNA.">Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), 4 (2015).</li><li>Bhattacherjee, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+fluorescently+labeled+embryonic+cranial+neural+crest+cells.">Laser capture microdissection of fluorescently labeled embryonic cranial neural crest cells.</a> Genesis. 39 (1), 58-64 (2004).</li><li>Cl&#233;ment-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenchymal+Cells+Contribute+to+Lignification+of+Tracheids+in+Developing+Xylem+of+Norway+Spruce.">Parenchymal Cells Contribute to Lignification of Tracheids in Developing Xylem of Norway Spruce.</a> Plant Physiology. 181 (4), 1552-1572 (2019).</li><li>Schad, M., Lipton, M. S., Giavalisco, P., Smith, R. D., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two-dimensional+electrophoresis+and+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+tissue-specific+protein+profiling+of+laser-microdissected+plant+samples.">Evaluation of two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for tissue-specific protein profiling of laser-microdissected plant samples.</a> Electrophoresis. 26 (14), 2729-2738 (2005).</li><li>Schad, M., Mungur, R., Fiehn, O., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+laser+microdissected+vascular+bundles+of+Arabidopsis+thaliana.">Metabolic profiling of laser microdissected vascular bundles of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 1 (1), 2 (2005).</li><li>Latrasse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+epigenetic+regulation+underlying+unisexual+flower+development+in+Cucumis+melo.">The quest for epigenetic regulation underlying unisexual flower development in Cucumis melo.</a> Epigenetics &amp; Chromatin. 10 (1), 22 (2017).</li><li>Turco, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+gene+expression+regulation+associated+with+vascularization+in+Sorghum+bicolor.">DNA methylation and gene expression regulation associated with vascularization in Sorghum bicolor.</a> The New Phytologist. 214 (3), 1213-1229 (2017).</li><li>Gomez, S. K., Harrison, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+and+its+application+to+analyze+gene+expression+in+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">Laser microdissection and its application to analyze gene expression in arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Pest Management Science: Formerly Pesticide Science. 65 (5), 504-511 (2009).</li><li>Roux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+analysis+of+plant+and+bacterial+gene+expression+in+symbiotic+root+nodules+using+laser-capture+microdissection+coupled+to+RNA+sequencing.">An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing.</a> The Plant Journal. 77 (6), 817-837 (2014).</li><li>Tang, W., Coughlan, S., Crane, E., Beatty, M., Duvick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+laser+microdissection+to+in+planta+gene+expression+profiling+of+the+maize+anthracnose+stalk+rot+fungus+Colletotrichum+graminicola.">The application of laser microdissection to in planta gene expression profiling of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (11), 1240-1250 (2006).</li></ol>

Многие исследования экспрессии генов, специфичные для тканей, были ограничены вскрытием образцов вручную, что является трудоемким, трудоемким, имеет высокий риск заражения и может использовать только образцы, которые оперативник человека достаточно ловкий, чтобы собрать урожай. LCM яв?...

Развитие и рост растений связаны с скоординированным действием транскрипционных регуляторных сетей в различных клетках, которые существуют в сложной клеточной среде. Чтобы понять активность этих регулятивных сетей, нам необходимы знания пространственной и временной экспрессии генов в различных типах клеток на разных стадиях развития. Однако анализ экспрессии генов чаще проводится в образцах целых органов или навалочных тканей из-за технической проблемы изоляции и анализа небольшого количества клеток. Метод, который мы описываем здесь, позволил получить анализ транскриптома пространственной и височной ткани путем соединения LCM с РНК-сек.
LCM был разработан два десятилетия назад Эммерт-Бак и его коллеги1. Техника позволила исследователям точно изолировать однокамеры или кластеры клеток из окружающей среды с помощью прямой микроскопической визуализации и манипуляции с помощью узкого лучалазера 1. С тех пор метод широко используется в биологии рака и патологии2,3. Многие исследовательские группы растений также адаптировали LCM для использования с различными видамирастений и различными типами тканей 4,,5,,6,,7,,8,,9,,10,,11. В последнее время несколько работ также использовали LCM на eudicot и семена монокота для изучения эмбрионов, эндоспермов и других структур семян во время развития семяни прорастания 10,12,13. Большинство других широко используемых одноклеточных методов изоляции, таких как микро-пипеттинг, сортировка клеток, магнитное разделение и микрофлюидные платформы, зависят от энзиматического пищеварения или механической гомогенизации для диссоциации клеток. Это может возмутить экспрессию генов, вводя технические артефакты, которые путаютинтерпретацию данных 14,,15. Эти методы также требуют, чтобы предыдущие знания маркерных генов для каждого типа клеток соотносить диссоциированные клетки с их пространственным расположением и истинным типом клеток. Дальнейшая группа методов зависит от сродства на основе изоляции подклеточных структур, а не целые клетки, например INTACT (Изоляция ядер, отмеченных в типах клеток) и TRAP (Перевод Рибосома Аффинити Очистка)16,17. Тем не менее, сродство маркировки и очистки ядер или рибосом являются технически сложными в видов растений, которые не имеют устоявшихся протоколов трансформации. LCM использует быструю фиксацию тканей для сохранения уровней транскрипции и обычной гистологической идентификации путем прямой визуализации клеток в пределах их нормальной ткани / органа контексте, что позволяет дискретных клеток, которые будут изолированы в течение короткогопериода времени 18,19.
Протокол, представленный здесь, представляет 100-й метод изоляции конкретных клеток или типов клеток от тканевых секций семян зерновых, которые могут быть применены к большинству клеток, которые могут быть гисто логически идентифицированы. LCM предоставляет бесконтактный метод изоляции клеток, значительно снижая загрязнение и повышая целостность восстановленной РНК. Кроме того, метод иллюстрирует силу LCM на крупномасштабных исследованиях генома, начиная с небольших количеств биологических материалов. Мы также описываем линейное усиление РНК для генерации достаточного входного материала для анализа стенограммы/транскриптома ниже по течению.
Есть десять основных шагов в этом LCM РНК-сек протокол для пространственной и височной ткани конкретных транскриптомов, в том числе фиксации образцов тканей, обезвоживание, парафин инфильтрации, встраивания, секционирования, LCM, РНК экстракции, РНК усиления, РНК количественной оценки и qRT-PCR и / или РНК-сек (Рисунок 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61517/61517fig01.jpg"> Рисунок 1: Flowchart LCM следуют РНК-сек или qRT-PCR. LCM является пространственно точным и бесконтактной техникой для сбора клеток из фиксированных секций тканей с помощью лазерного луча под микроскопической визуализацией. Процесс начинается с фиксации образцов тканей, а затем обезвоживания с использованием градиента серии этанола и ксилена, и закончил с парафином инфильтрации. Процесс может быть полностью автоматизирован с помощью процессора ткани. После того, как ткань проникли с парафином, он встроен в форму с расплавленным парафином с помощью встраивания станции. Раздел осуществляется с использованием микротома, установленного до нужной толщины. Слайды готовятся и LCM проводится непосредственно перед РНК должна быть извлечена из захваченных клеток. Добыча РНК сопровождается непосредственно двумя раундами усиления РНК до qRT-PCR и/или РНК-сек. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61517/61517fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid 100 % ACS/R.</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td>
			<td>VWRC20104.323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdhesiveCap 200 opaque</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415190-9181-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear base moulds 8 X 10</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3803015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40718-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity RNA ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low&#173;profile disp.blades DB80LS</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14035843489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PEN</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415190-9041-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td>Ambion (ThermoFisher)</td>
			<td>AMB17515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>On-Column DNase I Digestion Set</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNASE70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation RNA-Seq System V2</td>
			<td>NuGen (Integrated Science)</td>
			<td>7102-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin (Surgipath Paraplast)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>ABI (ThermoFisher)</td>
			<td>KIT0214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Ambion (ThermoFisher)</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td>
			<td>VWRC28975.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Benchtop Tissue Processor</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Heated Paraffin Embedding Module</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>EG1150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Cold Plate</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets</td>
			<td>LAF Technologies Pty Ltd</td>
			<td>Safemate 1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fully Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>RM2265</td>
			<td>with PALMRobo v 4.6 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss PALM MicroBeam LCM system</td>
			<td>Zeiss miscroscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-capture microdissection rna-sequencing for spatial and temporal tissue-specific gene expression analysis in plants

Развитие сложного многоклеточного организма регулируется отдельными типами клеток, которые имеют различные транскрипционные профили. Для выявления транскрипционных регуляторных сетей, регулирующих процессы развития, необходимо измерить пространственные и временные профили экспрессии генов этих отдельных типов клеток. Таким образом, понимание пространственно-временного контроля экспрессии генов имеет важное значение для получения понимания того, как регулируются биологические процессы и процессы развития. Здесь мы описываем метод микродиссекции лазерного захвата (LCM), чтобы изолировать небольшое количество клеток из трех органов эмбриона ячменя в течение времени во время прорастания с последующим профилированием стенограммы. Метод состоит из фиксации тканей, обработки тканей, встраивания парафина, секций, LCM и извлечения РНК с последующим ПЦР или РНК-сек в режиме реального времени. Этот метод позволил нам получить пространственные и временные профили транскрипций органов семян из различных количеств клеток (десятки и сотни), обеспечивая гораздо большую специфичность тканей, чем типичные анализы навалочных тканей. На основе этих данных мы смогли определить и сравнить транскрипционные регуляторные сети, а также предсказать факторы транскрипции кандидатов для отдельных тканей. Метод должен применяться к другим тканям растений с минимальной оптимизацией.

Мы создали пространственные и временные ткани конкретных транскриптомов из семян ячменя во время прорастания с помощью нашего LCM РНК-сек протокол10. Исследование было проведено путем применения LCM РНК-сек на небольшое количество клеток из трех органов эмбриона (слив, кончи?...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants at JoVE.com

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

Здесь представлен протокол для лазерного захвата микродиссекции (LCM) тканей растений. LCM является микроскопическим методом для изоляции областей ткани в без загрязнения образом. Процедура включает фиксацию тканей, встраивание парафина, секциоирование, LCM и экстракцию РНК. РНК используется в ниже по течению ткани конкретных, временно решенный анализ транскриптомов.

Лазер-Захват Микродиссеция РНК-секвенирования для пространственной и временной ткани-специфический анализ экспрессии генов в растениях

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Этот протокол использует лазерно-захват Microdissection в сочетании с РНК-sequencing для получения пространственных и временных транскриптомов из конкретных клеток в растениях интересов, используя небольшое количество биологических материалов. Основным преимуществом лазерной техники является то, что она облегчает прямую визуализацию клеток в рамках нормальной ткани, позволяя дискретным клеткам быть точно изолированными в бесконтактной манере. Хотя этот протокол оптимизирован для изоляции клеток растений, он может быть применен к большинству клеток, которые могут быть сто логически определены.Хорошая подготовка образца имеет решающее значение. Таким образом, один выполнения этой техники в первый раз, опора оптимизации фиксации тканей и встраивания имеет важное значение до лазерного захвата microdissection. Перед сбором образца ткани подготовьте фиксатор, соответствующий видам и типу тканей, которые будут собраны.Для семян ячменя, разрезать образцы семян пополам, прежде чем погрузить образцы, по крайней мере 10 X объем ледяной фиксатор. Используйте вакуумную инфильтрацию для ускорения проникновения фиксатора. Ткань должна утонуть к концу инфильтрации, затем обновить фиксатор для ночной инкубации и передать образцы в кассеты для обработки тканей.Поместите загруженные ткани кассеты в металлическую корзину автоматического процессора и прикрепите металлическую корзину к ее держателю над камерой. Установите программу на панели управления процессора ткани и нажмите начать программу автоматической обработки. Система будет обезвоживать образцы, окунув кассеты в градиентную серию этанола в течение 90 минут на концентрацию, как указано.После последнего погружения этанола, система будет погружать образцы в градиенты ксилена в течение 90 минут на раствор, как указано. Затем 290 минут погружения в расплавленный парафин при 55 до 60 градусов по Цельсию. На следующее утро, удалить парафин проникли кассеты из ткани процессора и приступить к парафин встраивания.На следующее утро, использовать тонкие типсы для передачи образцов процесса в соответствующим размером формы и добавить расплавленный парафин над каждым образцом. Для семян ячменя, ориентировать образцы в парафин продольно в направлении резки для облегчения приобретения продольных секций. Поместите чистую кассету на форму и убедитесь, что вся кассета полностью покрыта достаточным объемом парафина, чтобы обеспечить образец кассеты.Затем поместите плесень на холодную тарелку в течение 10 до 20 минут, пока парафин установлен перед выпуском блока из формы. Чтобы подготовить СЛАЙДЫ PEN Membrane, погрузим слайды в раствор ДЛЯ деактивации RNS в течение трех секунд, а затем два кратких моет и DEPC обработанной водой. Затем диск слайды в 370 градусов по Цельсию инкубатор, чтобы удалить остатки раствора и УФ лечения слайдов в шкафу ламинарного потока в течение 30 минут, чтобы повысить их парафин не фундук.Для сечения образцов тканей поместите парафиновые блоки на холодную тарелку и заполните водяную баню водой, обработанной DEPC, затем прогремите до 42 градусов по Цельсию. Обрезка блоков на глубину области интереса и раздел парафин блоков до шести до 10 микрон толщиной. Хорошо секционый блок сформирует ленту на краю лезвия.Используйте тонкий пинцет, чтобы аккуратно перенести ленты из микротома на водяную баню, заботясь о том, чтобы лента лежит на поверхности воды. Чтобы собрать секции, держа слайд под углом 45 градусов, используйте движение вверх, чтобы поднять ленту из воды на горку и использовать ткань, свободную от ворса, чтобы тщательно удалить избыток воды. Когда все разделы были собраны, мыть слайды с 320 секунд моет в ксилена следуют 230 секунд моет в 100% этанола и 230 секунд моет в 70% этанола.Для микроразделить клетки, представляющие интерес из депаррафинизированных и сухих секций тканей, загрузите слайды на трех слотах LCM микроскопа и загрузите трубку сбора в доступные слоты. Переместите этап, чтобы найти область образца, который должен быть сокращен и вырезать пустой сегмент, свободный от ткани на мембранной слайде. Для оптимизации скорости резки и резки в лазерном давлении катапульты энергии и фокуса.Используйте инструменты для рисования, чтобы наметить область интереса к ткани и использовать оптимизированные параметры и функцию Robo LPC для катапульты клеток в клеевые колпачки. Выберите флаг из списка элементов, чтобы использовать инструмент флага для разметки областей, представляющих интерес. Проверьте кнопку проверки крышки, чтобы проверить клей крышку, чтобы подтвердить, что образцы были захвачены.Обычно для извлечения РНК требуется от 10 до 15 секций на крышку. Сразу же после того, как все образцы были приобретены, немедленно приступить к добыче РНК, чтобы избежать деградации РНК. После извлечения РНК и усиления РНК используйте автоматизированную систему электрофореза, в соответствии с инструкциями производителя для количественной оценки и квалификации антисенсе РНК.В этом исследовании, LCM, РНК-секвенирование было применено к небольшому числу клеток из трех органов эмбриона, каждые восемь часов в течение 48-часового времени курса во время прорастания. Важно правильно настроить параметры резки, чтобы ткань, интересная, была точно вырезана и выбита из окружающей ткани без сжигания края выбранной области. Последствия общей РНК до усиления РНК позволяют обнаруживать различные электрофоретические полосы и флуоресцентные пики 18 и 28S рибосомных подразделений в образцах РНК хорошего качества.Успешно синтезированная антисенсовая РНК будет работать unimodal симметричного распределения размеров от 100 до 1000 нуклеотидов с пиком около 300 нуклеотидов после двух раундов усиления. Многомерное построение генов, выраженных в различных тканях в течение 48 часов прорастания, иллюстрирует большее сходство между образцами одной ткани, чем между образцами из одной и той же точки времени, но разными тканями. Количество дифференциально выраженных генов постепенно увеличивается в течение прорастания в каждой ткани относительно нулевой часовой точки времени ткани.В этом репрезентативном анализе было установлено, что 25% plumule, 34% радикула и 41% скутеллума дифференциально выраженных генов выражаются исключительно в каждой ткани. Важно правильно настроить параметры резки для точного иссечения и вытеснения области селектора из окружающей ткани без сжигания края выбранной области. С улучшенными методами хроматина и очищения белка, и повышения масс-спектрометрии инструмент, LCM может быть использован для клеточного типа конкретных эпигеномных и протеомических исследований имплантатов.

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Лазерная Захват микродиссекция ткани млекопитающих

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Подготовка первичных гемопоэтических клеточных культур из костного мозга мышей для Электропорация

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 3

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Использование генной Pulser MXcell Электропорация системы для трансфекции первичных элементов с высоким КПД

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Использование автоматизированных счетчиков сотовый для упрощения исследования экспрессии генов: миРНК Нокдаун ИЛ-4 зависимости экспрессии генов в клетках Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

В пробирке восстановление активность Т. castaneum Теломераза

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Анализ глобальной РНК синтеза на уровне одной клетки следующем Гипоксия

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...