Name: laser-capture microdissection rna-sequencing for spatial and temporal tissue-specific gene expression analysis in plants
Uploaded: 2020-08-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el Centro de Excelencia en Biología de la Energía Vegetal del Consejo Australiano de Investigación (CE140100008) a JW. M.G.L fue apoyado por una beca inicial de la Universidad La Trobe. Agradecemos a La Trobe Genomics Platform por su apoyo en la secuenciación de alto rendimiento y análisis de datos. Agradecemos al Profesor Asociado Matthew Tucker por el asesoramiento experto sobre el establecimiento de LCM en nuestro laboratorio.

Como el producto final es ARN, tenga cuidado de evitar contaminar el trabajo con ARN. Usar guantes es imprescindible. Utilice agua tratada con pirocarbonato de dietil (DEPC), tampones, etc. Búferes de autoclave y cristalería de hornear antes de su uso.
1. Fijación de tejidos
<ol><li>Preparar fijador de elección dependiendo de la especie y los tipos de tejido; para la semilla de cebada, utilice el fijador del agricultor (75% etanol, 25% ácido acético glacial (v/v)).</li>
	<li>Enfríe el...

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Alevizos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+cancer+in+vivo+gene+expression+profiling+assisted+by+laser+capture+microdissection+and+microarray+analysis.">Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis.</a> Oncogene. 20 (43), 6196-6204 (2001).</li><li>Cong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+follicular+lymphoma:+description+and+analysis+by+laser+capture+microdissection.">In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection.</a> Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 99 (9), 3376-3382 (2002).</li><li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+protocol+for+xylem+tissues+of+woody+plants.">Laser capture microdissection protocol for xylem tissues of woody plants.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 1965 (2017).</li><li>Casson, S., Spencer, M., Walker, K., Lindsey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+for+the+analysis+of+gene+expression+during+embryogenesis+of+Arabidopsis.">Laser capture microdissection for the analysis of gene expression during embryogenesis of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 42 (1), 111-123 (2005).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LCM-seq+reveals+the+crucial+role+of+LsSOC1+in+heat-promoted+bolting+of+lettuce+(Lactuca+sativa+L.).">LCM-seq reveals the crucial role of LsSOC1 in heat-promoted bolting of lettuce (Lactuca sativa L.).</a> The Plant Journal. 95 (3), 516-528 (2018).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+atlas+of+rice+cell+types+uncovers+cellular,+functional+and+developmental+hierarchies.">A transcriptome atlas of rice cell types uncovers cellular, functional and developmental hierarchies.</a> Nature Genetics. 41 (2), 258-263 (2009).</li><li>Kivivirta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+laser+microdissection+(LMD)+followed+by+transcriptome+analysis+of+plant+reproductive+tissue+in+phylogenetically+distant+angiosperms.">A protocol for laser microdissection (LMD) followed by transcriptome analysis of plant reproductive tissue in phylogenetically distant angiosperms.</a> Plant Methods. 15 (1), 1-11 (2019).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+dynamics+of+the+maize+leaf+transcriptome.">The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome.</a> Nature Genetics. 42 (12), 1060-1067 (2010).</li><li>Liew, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+tissue-specific+regulation+of+transcriptomes+during+barley+(Hordeum+vulgare)+seed+germination.">Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination.</a> The Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).</li><li>Matas, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-and+cell-type+specific+transcriptome+profiling+of+expanding+tomato+fruit+provides+insights+into+metabolic+and+regulatory+specialization+and+cuticle+formation.">Tissue-and cell-type specific transcriptome profiling of expanding tomato fruit provides insights into metabolic and regulatory specialization and cuticle formation.</a> The Plant Cell. 23 (11), 3893-3910 (2011).</li><li>Sakai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser-assisted+microdissection+(LAM)+and+RNA-seq+allows+to+perform+a+comprehensive+transcriptomic+analysis+of+epidermal+cells+of+Arabidopsis+embryo.">Combining laser-assisted microdissection (LAM) and RNA-seq allows to perform a comprehensive transcriptomic analysis of epidermal cells of Arabidopsis embryo.</a> Plant Methods. 14 (1), 10 (2018).</li><li>Zhan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Sequencing+of+Laser-Capture+Microdissected+compartments+of+the+maize+kernel+identifies+regulatory+modules+associated+with+endosperm+cell+differentiation.">RNA Sequencing of Laser-Capture Microdissected compartments of the maize kernel identifies regulatory modules associated with endosperm cell differentiation.</a> The Plant Cell. 27 (3), 513-531 (2015).</li><li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines.">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).</li><li>Zeb, Q., Wang, C., Shafiq, S., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Cell Omics. , 101-135 (2019).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana.">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Protocols. 6 (1), 56 (2011).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Ducos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection:+A+powerful+tool+for+genomics+at+cell+level.">Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 5-27 (2018).</li><li>Nelson, T., Tausta, S. L., Gandotra, N., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+plant+tissue:+what+you+see+is+what+you+get.">Laser microdissection of plant tissue: what you see is what you get.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 57, 181-201 (2006).</li><li>Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Be+more+specific!+Laser-assisted+microdissection+of+plant+cells.">Be more specific! Laser-assisted microdissection of plant cells.</a> Trends in Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+obtaining+high+quality+RNA+from+paraffin+sections+of+plant+tissues+by+laser+microdissection.">A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection.</a> Journal of Plant Research. 123 (6), 807-813 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7 (1), 3 (2006).</li><li>Ferreira, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+mRNA+amplification+approach+for+RNAseq+from+limited+amount+of+RNA.">Linear mRNA amplification approach for RNAseq from limited amount of RNA.</a> Gene. 564 (2), 220-227 (2015).</li><li>Schneider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+T7+RNA+polymerase+based+in+vitro+linear+RNA+amplification+for+use+in+microarray+experiments.">Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments.</a> BMC Genomics. 5 (1), 29 (2004).</li><li>Shanker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+RNA+amplification+kits+for+RNA+sequencing+using+very+low+input+amounts+of+total+RNA.">Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), 4 (2015).</li><li>Bhattacherjee, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+fluorescently+labeled+embryonic+cranial+neural+crest+cells.">Laser capture microdissection of fluorescently labeled embryonic cranial neural crest cells.</a> Genesis. 39 (1), 58-64 (2004).</li><li>Cl&#233;ment-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenchymal+Cells+Contribute+to+Lignification+of+Tracheids+in+Developing+Xylem+of+Norway+Spruce.">Parenchymal Cells Contribute to Lignification of Tracheids in Developing Xylem of Norway Spruce.</a> Plant Physiology. 181 (4), 1552-1572 (2019).</li><li>Schad, M., Lipton, M. S., Giavalisco, P., Smith, R. D., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two-dimensional+electrophoresis+and+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+tissue-specific+protein+profiling+of+laser-microdissected+plant+samples.">Evaluation of two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for tissue-specific protein profiling of laser-microdissected plant samples.</a> Electrophoresis. 26 (14), 2729-2738 (2005).</li><li>Schad, M., Mungur, R., Fiehn, O., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+laser+microdissected+vascular+bundles+of+Arabidopsis+thaliana.">Metabolic profiling of laser microdissected vascular bundles of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 1 (1), 2 (2005).</li><li>Latrasse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+epigenetic+regulation+underlying+unisexual+flower+development+in+Cucumis+melo.">The quest for epigenetic regulation underlying unisexual flower development in Cucumis melo.</a> Epigenetics &amp; Chromatin. 10 (1), 22 (2017).</li><li>Turco, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+gene+expression+regulation+associated+with+vascularization+in+Sorghum+bicolor.">DNA methylation and gene expression regulation associated with vascularization in Sorghum bicolor.</a> The New Phytologist. 214 (3), 1213-1229 (2017).</li><li>Gomez, S. K., Harrison, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+and+its+application+to+analyze+gene+expression+in+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">Laser microdissection and its application to analyze gene expression in arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Pest Management Science: Formerly Pesticide Science. 65 (5), 504-511 (2009).</li><li>Roux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+analysis+of+plant+and+bacterial+gene+expression+in+symbiotic+root+nodules+using+laser-capture+microdissection+coupled+to+RNA+sequencing.">An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing.</a> The Plant Journal. 77 (6), 817-837 (2014).</li><li>Tang, W., Coughlan, S., Crane, E., Beatty, M., Duvick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+laser+microdissection+to+in+planta+gene+expression+profiling+of+the+maize+anthracnose+stalk+rot+fungus+Colletotrichum+graminicola.">The application of laser microdissection to in planta gene expression profiling of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (11), 1240-1250 (2006).</li></ol>

Muchos estudios de expresión génica específicos de los tejidos se han visto limitados por la disección manual de muestras, que consume mucho tiempo, requiere mucho trabajo, tiene un alto riesgo de contaminación y sólo puede utilizar muestras de que un agente humano es lo suficientemente hábil para cosechar. LCM es una técnica precisa y sin contacto para recoger células de secciones de tejido fijo utilizando un rayo láser operado mecánicamente bajo visualización microscópica.
Una b...

El desarrollo y crecimiento de las plantas implican la acción coordinada de las redes reguladoras transcripcionales dentro de diferentes células que existen en un entorno celular complejo. Para entender la actividad de estas redes reguladoras, requerimos el conocimiento de la expresión génica espacial y temporal dentro de diferentes tipos de células en todas las etapas del desarrollo. Sin embargo, los análisis de la expresión génica se llevan a cabo más comúnmente en órganos enteros o muestras de tejido a granel debido al desafío técnico de aislar y analizar un pequeño número de células. El método que describimos aquí ha permitido obtener análisis de transcriptomas espaciales y temporales específicos del tejido mediante el acoplamiento de LCM con RNA-seq.
LCM fue desarrollado hace dos décadas por Emmert-Buck y colegas1. La técnica permitió a los investigadores aislar con precisión células individuales o grupos de células de su entorno utilizando la visualización microscópica directa y la manipulación con un láser de haz estrecho1. Desde entonces el método ha sido ampliamente utilizado en la biología del cáncer y la patología2,3. Muchos grupos de investigación vegetal también han adaptado LCM para el uso con diferentes especies de plantas y diferentes tipos de tejidos4,,5,6,7,8,9,10,11. Recientemente, varios trabajos también han utilizado LCM sobre semillas eudicot y monocot para estudiar embriones, endospermas y otras estructuras de semillas durante el desarrollo de semillas y la germinación10,,12,,13. La mayoría de los otros métodos de aislamiento de una sola célula comúnmente utilizados, como micro-pipetting, clasificación celular, separación magnética y plataformas microfluídicas dependen de la digestión enzimática o homogeneización mecánica para disociar las células. Esto puede perturbar la expresión génica, introduciendo artefactos técnicos que confunda la interpretación de los datos14,15. Estos métodos también requieren el conocimiento previo de los genes marcadores para cada tipo de célula para relacionar las células disociadas con su ubicación espacial y el tipo de célula verdadero. Otro grupo de técnicas depende del aislamiento basado en afinidad de estructuras subcelulares en lugar de células enteras, por ejemplo INTACT (Aislamiento de núcleos etiquetados en tipos de celdas) y TRAP (Traducción de la purificación de afinidad ribosoma)16,17. Sin embargo, el etiquetado y la purificación de afinidad de núcleos o ribosomas son técnicamente desafiantes en especies vegetales que no tienen protocolos de transformación bien establecidos. LCM aprovecha la fijación rápida del tejido para preservar los niveles de transcripción y la identificación histológica convencional mediante la visualización directa de las células dentro de su contexto normal de tejido/órgano, lo que permite aislar las células discretas en un corto período de tiempo18,,19.
El protocolo presentado aquí es un método optimizado para el aislamiento de células o tipos celulares específicos de las secciones tisulares de las semillas de cereales, que se puede aplicar a la mayoría de las células que pueden ser identificadas histológicamente. LCM proporciona un método sin contacto de aislamiento celular, reduciendo en gran medida la contaminación y aumentando la integridad del ARN recuperado. Además, el método ilustra el poder de la MTC en estudios genómicos a gran escala a partir de pequeñas cantidades de materiales biológicos. También describimos la amplificación lineal del ARN para generar suficiente material de entrada para análisis de transcripción/transcriptoma posterior.
Hay diez pasos principales en este protocolo LCM RNA-seq para transcriptomas espaciales y temporales específicos de los tejidos, incluyendo la fijación de muestras de tejido, deshidratación, infiltración de parafina, incrustación, seccionamiento, LCM, extracción de ARN, amplificación de ARN, cuantificación de ARN y qRT-PCR y/o ARN-seq (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61517/61517fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama de flujo de LCM seguido de RNA-seq o qRT-PCR. LCM es una técnica espacialmente precisa y libre de contacto para recoger células de secciones de tejido fijo utilizando un rayo láser bajo visualización microscópica. El proceso comienza con la fijación de muestras de tejido, seguido de deshidratación utilizando una serie de gradientes de etanol y xileno, y terminado con infiltración de parafina. El proceso se puede automatizar completamente mediante el uso de un procesador de tejidos. Una vez que el tejido se infiltra con parafina, se incrusta en un molde con parafina fundida utilizando una estación de incrustación. El seccionamiento se lleva a cabo utilizando microtomos ajustados al espesor deseado. Se preparan las diapositivas y se realiza LCM inmediatamente antes de que el ARN se extraiga de las células capturadas. La extracción de ARN es seguida directamente por dos rondas de amplificación de ARN antes de qRT-PCR y/o ARN-seq. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61517/61517fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid 100 % ACS/R.</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td>
			<td>VWRC20104.323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdhesiveCap 200 opaque</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415190-9181-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear base moulds 8 X 10</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3803015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40718-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity RNA ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low&#173;profile disp.blades DB80LS</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14035843489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PEN</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415190-9041-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td>Ambion (ThermoFisher)</td>
			<td>AMB17515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>On-Column DNase I Digestion Set</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNASE70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation RNA-Seq System V2</td>
			<td>NuGen (Integrated Science)</td>
			<td>7102-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin (Surgipath Paraplast)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>ABI (ThermoFisher)</td>
			<td>KIT0214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Ambion (ThermoFisher)</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td>
			<td>VWRC28975.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Benchtop Tissue Processor</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Heated Paraffin Embedding Module</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>EG1150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Cold Plate</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets</td>
			<td>LAF Technologies Pty Ltd</td>
			<td>Safemate 1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fully Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>RM2265</td>
			<td>with PALMRobo v 4.6 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss PALM MicroBeam LCM system</td>
			<td>Zeiss miscroscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-capture microdissection rna-sequencing for spatial and temporal tissue-specific gene expression analysis in plants

El desarrollo de un organismo multicelular complejo se rige por tipos celulares distintos que tienen diferentes perfiles transcripcionales. Para identificar las redes reguladoras transcripcionales que rigen los procesos de desarrollo es necesario medir los perfiles de expresión génica espacial y temporal de estos tipos de células individuales. Por lo tanto, la comprensión del control espacio-temporal de la expresión génica es esencial para comprender cómo se regulan los procesos biológicos y de desarrollo. Aquí, describimos un método de microdisección de captura láser (LCM) para aislar un pequeño número de células de tres órganos embrionarios de cebada durante un curso de tiempo durante la germinación seguido de perfiles de transcripción. El método consiste en fijación de tejidos, procesamiento de tejidos, incrustación de parafina, seccionamiento, LCM y extracción de ARN seguido de PCR en tiempo real o ARN-seq. Este método nos ha permitido obtener perfiles espaciales y temporales de transcriptomas de órganos de semillas de diferentes números de células (decenas a cientos), proporcionando una especificidad tisular mucho mayor que los análisis típicos de tejido a granel. A partir de estos datos pudimos definir y comparar redes reguladoras transcripcionales, así como predecir los factores de transcripción regulatorias candidatos para tejidos individuales. El método debe ser aplicable a otros tejidos vegetales con una optimización mínima.

Generamos transcriptomas espaciales y temporales específicos de tejidos a partir de semillas de cebada durante la germinación utilizando nuestro protocolo LCM RNA-seq10. El estudio se llevó a cabo aplicando LCM ARN-seq a un pequeño número de células de tres órganos embrionarios (plumule, radicle tip, scutellum) cada 8 h durante un curso de tiempo de 48 horas durante la germinación (0-48 h, 7 puntos de tiempo) (Figura 2A,B).
<p class="jove_...

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Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

Aquí se presenta un protocolo para la microdisección de captura láser (LCM) de tejidos vegetales. LCM es una técnica microscópica para aislar áreas de tejido de una manera libre de contaminación. El procedimiento incluye fijación de tejido, incrustación de parafina, seccionamiento, LCM y extracción de ARN. El ARN se utiliza en el análisis de transcriptomas de transcriptomas específicos del tejido aguas abajo y resueltos temporalmente.

Secuenciación de ARN-Secuenciación de ARN-Captura láser para Análisis de Expresión Genética Espacial y Temporal Específica de Tejidos en Plantas

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Este protocolo utiliza la Microdisección de Captura Láser junto con la secuenciación de ARN para obtener transcriptomas espaciales y temporales de células específicas en plantas de interés, utilizando pequeñas cantidades de materiales biológicos. La principal ventaja de la técnica láser es que facilita la visualización directa de las células dentro del contexto normal del tejido, permitiendo que las células discretas se aíslen con precisión de manera libre de contacto. Aunque este protocolo está optimizado para el aislamiento de células vegetales, se puede aplicar a la mayoría de las células que se pueden identificar esteológicamente.Una buena preparación de la muestra es fundamental. Por lo tanto, uno realizando esta técnica por primera vez, la optimización de la utilería de la fijación del tejido y la incrustación es importante antes de la microdisección de captura láser. Antes de recoger la muestra de tejido, preparar un fijador adecuado a la especie y el tipo de tejido a cosechar.Para la semilla de cebada, corte las muestras de semillas por la mitad antes de sumergir las muestras en al menos un volumen de 10 X de fijador frío. Utilice la infiltración de vacío para acelerar la penetración del fijador. El tejido debe hundirse al final de la infiltración, luego refrescar el fijador para una incubación durante la noche y transferir las muestras a casetes para el procesamiento de tejidos.Coloque los cassettes cargados de tejido en la cesta metálica de un procesador automático y coloque la cesta metálica en su soporte por encima de la cámara uno. Ajuste el programa en los paneles de control del procesador de tejidos y pulse start para iniciar el programa de procesamiento automático. El sistema deshidratará las muestras sumergiendo los casetes en una serie de gradientes de etanol durante 90 minutos por concentración como se indica.Después de la última inmersión de etanol, el sistema sumergirá las muestras en gradientes de xileno durante 90 minutos por solución como se indica. Seguido de inmersiones de 290 minutos en parafina fundida a 55 a 60 grados centígrados. A la mañana siguiente, retire los casetes infiltrados de parafina del procesador de tejidos y proceda a la incrustación de parafina.A la mañana siguiente, utilice fórceps finos para transferir las muestras de proceso a moldes de tamaño adecuado y agregue parafina fundida sobre cada muestra. Para las semillas de cebada, oriente las muestras en la parafina longitudinalmente a la dirección de corte para facilitar la adquisición de secciones longitudinales. Coloque un cassette limpio en el molde y asegúrese de que todo el cassette esté completamente cubierto con un volumen suficiente de parafina para fijar la muestra al cassette.A continuación, coloque el molde en una placa fría durante 10 a 20 minutos hasta que la parafina se ajuste antes de liberar el bloque del molde. Para preparar una diapositiva de membrana PEN, sumerja los portaobjetos en la solución de desactivación de RNS durante tres segundos seguido de dos breves lavados y agua tratada con DEPC. A continuación, conduzca los portaobjetos en una incubadora de 370 grados Celsius para eliminar cualquier solución sobrante y uv tratar los portaobjetos en un armario de flujo laminar durante 30 minutos para mejorar su parafina no avellanas.Para una sección de tejido de muestra coloque los bloques de parafina en la placa fría y llene el baño de agua con el agua tratada con DEPC, luego caliente a 42 grados Celsius. Recortar bloques a la profundidad de la región de interés y secciones de los bloques de parafina a un espesor de seis a 10 micras. Un bloque bien seccionado formará una cinta en el borde de la hoja.Utilice una pinza fina para transferir suavemente cintas desde el microtomo al baño de agua, teniendo cuidado de que la cinta se coloque plana en la superficie del agua. Para recoger las secciones, sosteniendo un portaobjetos en un ángulo de 45 grados, utilice un movimiento hacia arriba para levantar una cinta fuera del agua sobre el portaobjetos y utilice un tejido libre de pelusas para eliminar cuidadosamente el exceso de agua. Una vez recogidas todas las secciones, lave los portaobjetos con lavados de 320 segundos en xileno seguidos de lavados de 230 segundos en 100% etanol y 230 segundos lavados en 70% etanol.Para microdiseccionar las células de interés de las secciones de tejido desparafinanizado y seco, cargue los portaobjetos en las tres ranuras del microscopio LCM y cargue el tubo de recogida en las ranuras disponibles. Mueva el escenario para localizar la región de la muestra que necesita ser cortada y cortar un segmento en blanco libre de tejido en la diapositiva de la membrana. Optimizar la velocidad de corte y el corte en la presión láser catapultando energía y enfoque.Utilice las herramientas de dibujo para esbozar el área de interés en el tejido y utilizar los parámetros optimizados y la función Robo LPC para catapultar las células en las tapas adhesivas. Seleccione la marca de la lista de elementos para utilizar la herramienta de indicador para marcar las regiones de interés. Compruebe el botón de comprobación de la tapa para inspeccionar la tapa adhesiva, para confirmar que las muestras han sido capturadas.Normalmente se requieren de 10 a 15 secciones por tapa para la extracción de ARN. Inmediatamente después de que todas las muestras hayan sido adquiridas, proceda inmediatamente a la extracción de ARN para evitar la degradación del ARN. Después de la extracción de ARN y amplificación de ARN utilizar un sistema automatizado de electroforesis, de acuerdo con las instrucciones del fabricante para cuantificar y calificar el ARN antisens sentido.En este estudio, LCM, la secuenciación de ARN se aplicó a un pequeño número de células de tres órganos embrionarios, cada ocho horas durante un curso de 48 horas durante la germinación. Es importante ajustar los parámetros de corte correctamente para permitir que el tejido de interés se corte y desaloje con precisión del tejido circundante sin quemar el borde del área seleccionada. La ramificación del ARN total antes de la amplificación del ARN permite la detección de bandas electroforéticas y picos fluorescentes distintos de las subunidades ribosomales 18 y 28S en muestras de ARN de buena calidad.El ARN antisrésense sintetizado con éxito exhibirá una distribución de tamaño simétrico unimodal de 100 a 1000 nucleótidos con un pico de alrededor de 300 nucleótidos después de dos rondas de amplificación. El trazado a escala multidimensional de genes expresados en los diferentes tejidos a lo largo de 48 horas de germinación, ilustra una mayor similitud entre las muestras de un solo tejido que entre las muestras del mismo punto de tiempo, pero diferentes tejidos. El número de genes expresados diferencialmente aumenta progresivamente en el transcurso de la germinación en cada tejido en relación con el punto de tiempo de hora cero del tejido.En este análisis representativo, se encontró que el 25% de la plolo, el 34% del radio y el 41% de los genes expresados diferencialmente en el escutellio se expresaban exclusivamente dentro de cada tejido. Es importante ajustar correctamente los parámetros de corte para una escisión precisa y el desalojamiento del área selectora del tejido circundante sin quemar el borde de la región seleccionada. Con métodos mejorados de purificación de cromatina y proteínas, y mejorar el instrumento de espectrometría de masas, LCM se puede utilizar para estudios epigenómicos y proteómicos específicos de tipo celular.

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Láser microdisección de captura de tejidos de mamíferos

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Investigación

Biología

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

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Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

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Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

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Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

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Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...