Name: laser-capture microdissection rna-sequencing for spatial and temporal tissue-specific gene expression analysis in plants
Uploaded: 2020-08-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Australian Research Council Centre of Excellence in Plant Energy Biology (CE140100008) till JW. M.G.L stöddes av ett la Trobe-universitet som började ge bidrag. Vi tackar La Trobe Genomics-plattformen för deras stöd inom sekvensering med hög genomströmning och dataanalys. Vi tackar docent Matthew Tucker för expertråd om att etablera LCM i vårt labb.

Eftersom slutprodukten är RNA, var noga med att undvika att förorena arbetet med RNases. Att bära handskar är ett måste. Använd diethyl pyrocarbonate (DEPC) -behandlat vatten, buffertar etc. Autoklav buffertar och baka glasvaror före användning.
1. Fixering av vävnad
<ol><li>Förbered fixativ av val beroende på art och vävnadstyper; för kornfrö, använd Farmer's fixative (75% etanol, 25% glacial ättiksyra (v/v)).</li>
	<li>Kyl fixativet på is innan du skördar vävnader.</li>
...

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Alevizos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+cancer+in+vivo+gene+expression+profiling+assisted+by+laser+capture+microdissection+and+microarray+analysis.">Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis.</a> Oncogene. 20 (43), 6196-6204 (2001).</li><li>Cong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+follicular+lymphoma:+description+and+analysis+by+laser+capture+microdissection.">In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection.</a> Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 99 (9), 3376-3382 (2002).</li><li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+protocol+for+xylem+tissues+of+woody+plants.">Laser capture microdissection protocol for xylem tissues of woody plants.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 1965 (2017).</li><li>Casson, S., Spencer, M., Walker, K., Lindsey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+for+the+analysis+of+gene+expression+during+embryogenesis+of+Arabidopsis.">Laser capture microdissection for the analysis of gene expression during embryogenesis of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 42 (1), 111-123 (2005).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LCM-seq+reveals+the+crucial+role+of+LsSOC1+in+heat-promoted+bolting+of+lettuce+(Lactuca+sativa+L.).">LCM-seq reveals the crucial role of LsSOC1 in heat-promoted bolting of lettuce (Lactuca sativa L.).</a> The Plant Journal. 95 (3), 516-528 (2018).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+atlas+of+rice+cell+types+uncovers+cellular,+functional+and+developmental+hierarchies.">A transcriptome atlas of rice cell types uncovers cellular, functional and developmental hierarchies.</a> Nature Genetics. 41 (2), 258-263 (2009).</li><li>Kivivirta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+laser+microdissection+(LMD)+followed+by+transcriptome+analysis+of+plant+reproductive+tissue+in+phylogenetically+distant+angiosperms.">A protocol for laser microdissection (LMD) followed by transcriptome analysis of plant reproductive tissue in phylogenetically distant angiosperms.</a> Plant Methods. 15 (1), 1-11 (2019).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+dynamics+of+the+maize+leaf+transcriptome.">The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome.</a> Nature Genetics. 42 (12), 1060-1067 (2010).</li><li>Liew, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+tissue-specific+regulation+of+transcriptomes+during+barley+(Hordeum+vulgare)+seed+germination.">Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination.</a> The Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).</li><li>Matas, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-and+cell-type+specific+transcriptome+profiling+of+expanding+tomato+fruit+provides+insights+into+metabolic+and+regulatory+specialization+and+cuticle+formation.">Tissue-and cell-type specific transcriptome profiling of expanding tomato fruit provides insights into metabolic and regulatory specialization and cuticle formation.</a> The Plant Cell. 23 (11), 3893-3910 (2011).</li><li>Sakai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser-assisted+microdissection+(LAM)+and+RNA-seq+allows+to+perform+a+comprehensive+transcriptomic+analysis+of+epidermal+cells+of+Arabidopsis+embryo.">Combining laser-assisted microdissection (LAM) and RNA-seq allows to perform a comprehensive transcriptomic analysis of epidermal cells of Arabidopsis embryo.</a> Plant Methods. 14 (1), 10 (2018).</li><li>Zhan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Sequencing+of+Laser-Capture+Microdissected+compartments+of+the+maize+kernel+identifies+regulatory+modules+associated+with+endosperm+cell+differentiation.">RNA Sequencing of Laser-Capture Microdissected compartments of the maize kernel identifies regulatory modules associated with endosperm cell differentiation.</a> The Plant Cell. 27 (3), 513-531 (2015).</li><li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines.">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).</li><li>Zeb, Q., Wang, C., Shafiq, S., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Cell Omics. , 101-135 (2019).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana.">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Protocols. 6 (1), 56 (2011).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282 (2014).</li><li>Bevilacqua, C., Ducos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection:+A+powerful+tool+for+genomics+at+cell+level.">Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 5-27 (2018).</li><li>Nelson, T., Tausta, S. L., Gandotra, N., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+plant+tissue:+what+you+see+is+what+you+get.">Laser microdissection of plant tissue: what you see is what you get.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 57, 181-201 (2006).</li><li>Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Be+more+specific!+Laser-assisted+microdissection+of+plant+cells.">Be more specific! Laser-assisted microdissection of plant cells.</a> Trends in Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+obtaining+high+quality+RNA+from+paraffin+sections+of+plant+tissues+by+laser+microdissection.">A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection.</a> Journal of Plant Research. 123 (6), 807-813 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7 (1), 3 (2006).</li><li>Ferreira, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+mRNA+amplification+approach+for+RNAseq+from+limited+amount+of+RNA.">Linear mRNA amplification approach for RNAseq from limited amount of RNA.</a> Gene. 564 (2), 220-227 (2015).</li><li>Schneider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+T7+RNA+polymerase+based+in+vitro+linear+RNA+amplification+for+use+in+microarray+experiments.">Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments.</a> BMC Genomics. 5 (1), 29 (2004).</li><li>Shanker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+RNA+amplification+kits+for+RNA+sequencing+using+very+low+input+amounts+of+total+RNA.">Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), 4 (2015).</li><li>Bhattacherjee, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+fluorescently+labeled+embryonic+cranial+neural+crest+cells.">Laser capture microdissection of fluorescently labeled embryonic cranial neural crest cells.</a> Genesis. 39 (1), 58-64 (2004).</li><li>Cl&#233;ment-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenchymal+Cells+Contribute+to+Lignification+of+Tracheids+in+Developing+Xylem+of+Norway+Spruce.">Parenchymal Cells Contribute to Lignification of Tracheids in Developing Xylem of Norway Spruce.</a> Plant Physiology. 181 (4), 1552-1572 (2019).</li><li>Schad, M., Lipton, M. S., Giavalisco, P., Smith, R. D., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two-dimensional+electrophoresis+and+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+tissue-specific+protein+profiling+of+laser-microdissected+plant+samples.">Evaluation of two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for tissue-specific protein profiling of laser-microdissected plant samples.</a> Electrophoresis. 26 (14), 2729-2738 (2005).</li><li>Schad, M., Mungur, R., Fiehn, O., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+laser+microdissected+vascular+bundles+of+Arabidopsis+thaliana.">Metabolic profiling of laser microdissected vascular bundles of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 1 (1), 2 (2005).</li><li>Latrasse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+epigenetic+regulation+underlying+unisexual+flower+development+in+Cucumis+melo.">The quest for epigenetic regulation underlying unisexual flower development in Cucumis melo.</a> Epigenetics &amp; Chromatin. 10 (1), 22 (2017).</li><li>Turco, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+gene+expression+regulation+associated+with+vascularization+in+Sorghum+bicolor.">DNA methylation and gene expression regulation associated with vascularization in Sorghum bicolor.</a> The New Phytologist. 214 (3), 1213-1229 (2017).</li><li>Gomez, S. K., Harrison, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+and+its+application+to+analyze+gene+expression+in+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">Laser microdissection and its application to analyze gene expression in arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Pest Management Science: Formerly Pesticide Science. 65 (5), 504-511 (2009).</li><li>Roux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+analysis+of+plant+and+bacterial+gene+expression+in+symbiotic+root+nodules+using+laser-capture+microdissection+coupled+to+RNA+sequencing.">An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing.</a> The Plant Journal. 77 (6), 817-837 (2014).</li><li>Tang, W., Coughlan, S., Crane, E., Beatty, M., Duvick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+laser+microdissection+to+in+planta+gene+expression+profiling+of+the+maize+anthracnose+stalk+rot+fungus+Colletotrichum+graminicola.">The application of laser microdissection to in planta gene expression profiling of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (11), 1240-1250 (2006).</li></ol>

Många vävnadsspecifika genuttryck studier har begränsats genom hand dissekering av prover, som är tidskrävande, arbetsintensiva, har en hög risk för kontaminering och kan bara utnyttja prover som en mänsklig operativ är tillräckligt fingerfärdig att skörda. LCM är en exakt och kontaktfri teknik för att samla in celler från fasta vävnadssektioner med hjälp av en mekaniskt manövrerad laserstråle under mikroskopisk visualisering.
Bra provpreparering är avgörande för LCM. Pro...

Växtutveckling och tillväxt innebär en samordnad åtgärd av transkriptionella regleringsnätverk inom olika celler som finns i en komplex cellulär miljö. För att förstå aktiviteten i dessa regleringsnätverk kräver vi kunskap om rumsliga och tidsmässiga genuttryck inom olika celltyper över utvecklingsstadier. Analyser av genuttryck utförs dock oftare i hela organ eller massvävnadsprover på grund av den tekniska utmaningen att isolera och analysera ett litet antal celler. Den metod vi beskriver här har tillåtit erhålla rumsliga och tidsmässiga vävnadsspecifika transkriptom analys genom koppling LCM med RNA-seq.
LCM utvecklades för två decennier sedan av Emmert-Buck och kollegor1. Tekniken gjorde det möjligt för forskare att exakt isolera enceller eller kluster av celler från sin omgivning med hjälp av direkt mikroskopisk visualisering och manipulation med en smal strållaser1. Sedan dess har metoden använts flitigt inom cancerbiologi och patologi2,3. Många växtforskningsgrupper har också anpassat LCM för användning med olika växtarter och olika vävnadstyper4,5,6,7,8,9,10,11. Nyligen har flera papper också använt LCM på eudikot och monocot frön att studera embryo, frövita och andra strukturer utsäde under utsäde utveckling och grobarhet10,12,13. De flesta av de andra vanligt förekommande encelliga isoleringsmetoderna som mikro-pipettering, cellsortering, magnetisk separation och mikrofluidiska plattformar är beroende av den enzymatiska matsmältningen eller mekanisk homogenisering för att dissociate celler. Detta kan genomsyra genuttryck, införa tekniska artefakter som förvirrar datatolkning14,15. Dessa metoder kräver också tidigare kunskaper om markörgener för varje celltyp för att relatera de dissocierade cellerna till deras rumsliga placering och sanna cell-typ. Ytterligare en grupp tekniker beror på affinitetsbaserad isolering av subcellulära strukturer istället för hela celler, till exempel INTAKT (Isolering av kärnor Taggade i celltyper) och TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification)16,17. Affinitetsmärkning och rening av atomkärnor eller ribosomer är dock tekniskt utmanande hos växtarter som inte har väletablerade transformationsprotokoll. LCM drar fördel av snabb vävnad fixering för att bevara transkription nivåer och konventionella histologiska identifiering genom direkt visualisering av celler inom deras normala vävnad / organ sammanhang, som gör att diskreta celler isoleras på kort tid18,19.
Det protokoll som presenteras här är en optimerad metod för isolering av specifika celler eller celltyper från vävnadssektionerna i spannmålsfrön, som kan appliceras på de flesta av de celler som kan histologiskt identifieras. LCM ger en kontaktfri metod för cellisolering, kraftigt minska kontaminering och öka integriteten av återvunnet RNA. Vidare illustrerar metoden LCM:s kraft på storskaliga genomsvida studier som börjar med små mängder biologiska material. Vi beskriver också linjär förstärkning av RNA för att generera tillräckligt med inmatningsmaterial för nedströms avskrift/transkriptomanalyser.
Det finns tio huvudsteg i detta LCM RNA-seq-protokoll för rumsliga och tidsmässiga vävnadsspecifika transkriptomer, inklusive fixering av vävnadsprover, uttorkning, paraffinininfiltration, inbäddning, snittning, LCM, RNA-extraktion, RNA-amplifiering, RNA-kvantifiering och qRT-PCR och/eller RNA-seq (Figur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61517/61517fig01.jpg"> Bild 1: Flödesschema av LCM följt av RNA-seq eller qRT-PCR. LCM är en rumsligt exakt och kontaktfri teknik för att samla in celler från fasta vävnadssektioner med hjälp av en laserstråle under mikroskopisk visualisering. Processen börjar med fixering av vävnadsprover, följt av uttorkning med hjälp av en gradient serie av etanol och xylen, och slutade med paraffin infiltration. Processen kan automatiseras helt genom att använda en vävnadsprocessor. När vävnaden är infiltrerad med paraffin, är det inbäddat i en form med smält paraffin med hjälp av en inbäddningsstation. Snittning utförs med hjälp av mikrotom inställd på önskad tjocklek. Diabilder bereds och LCM genomförs omedelbart innan RNA ska extraheras från fångade celler. RNA-extraktion följs direkt av två omgångar av RNA-amplifiering före qRT-PCR och/eller RNA-seq. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61517/61517fig01large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid 100 % ACS/R.</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td>
			<td>VWRC20104.323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdhesiveCap 200 opaque</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415190-9181-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear base moulds 8 X 10</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3803015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40718-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity RNA ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low&#173;profile disp.blades DB80LS</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14035843489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PEN</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415190-9041-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td>Ambion (ThermoFisher)</td>
			<td>AMB17515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>On-Column DNase I Digestion Set</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNASE70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation RNA-Seq System V2</td>
			<td>NuGen (Integrated Science)</td>
			<td>7102-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin (Surgipath Paraplast)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>ABI (ThermoFisher)</td>
			<td>KIT0214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Ambion (ThermoFisher)</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td>
			<td>VWRC28975.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Benchtop Tissue Processor</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Heated Paraffin Embedding Module</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>EG1150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Cold Plate</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>EG1150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets</td>
			<td>LAF Technologies Pty Ltd</td>
			<td>Safemate 1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fully Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>RM2265</td>
			<td>with PALMRobo v 4.6 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss PALM MicroBeam LCM system</td>
			<td>Zeiss miscroscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>TapeStation 2200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-capture microdissection rna-sequencing for spatial and temporal tissue-specific gene expression analysis in plants

Utvecklingen av en komplex flercellig organism styrs av distinkta celltyper som har olika transkriptionella profiler. För att identifiera transkriptionella regleringsnätverk som styr utvecklingsprocesser är det nödvändigt att mäta dessa enskilda celltypers rumsliga och tidsmässiga genuttrycksprofiler. Därför är insikt i den spatio-temporala kontrollen av genuttryck avgörande för att få förståelse för hur biologiska och utvecklingsmässiga processer regleras. Här beskriver vi en laser-capture microdissection (LCM) metod för att isolera litet antal celler från tre korn embryo organ under en tid-kurs under grobarhet följt av avskrift profilering. Metoden består av vävnadsfixering, vävnadsbearbetning, paraffininbäddning, snittning, LCM- och RNA-extraktion följt av realtids-PCR eller RNA-seq. Denna metod har gjort det möjligt för oss att få rumsliga och tidsmässiga profiler av utsäde organ transkriptomer från varierande antal celler (tiotals till hundratals), vilket ger mycket större vävnad-specificitet än typiska bulk-vävnad analyser. Från dessa data kunde vi definiera och jämföra transkriptionella regulatoriska nätverk samt förutsäga kandidatreglerande transkriptionsfaktorer för enskilda vävnader. Metoden bör vara tillämplig på andra växtvävnader med minimal optimering.

Vi genererade rumsliga och temporala vävnadsspecifika transkriptomer från kornfrön under grobarhet med hjälp av vårt LCM RNA-seq-protokoll10. Studien genomfördes genom att tillämpa LCM RNA-seq på litet antal celler från tre embryoorgan (plumule, radiklespets, scutellum) var 8 h över en 48 h tidskurs under grobarhet (0-48 h, 7 tidspunkter) (Figur 2A,B).
<img alt="Figure 2" class="xf...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants at JoVE.com

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

Presenteras här är ett protokoll för laser-capture microdissection (LCM) av växtvävnader. LCM är en mikroskopisk teknik för att isolera områden av vävnad på ett kontaminationsfritt sätt. Förfarandet omfattar vävnad fixering, paraffin inbäddning, snittning, LCM och RNA extraktion. RNA används i den nedströms vävnadsspecifika, tidsmässigt löst analys av transkriptomer.

Laser-Capture Microdissection RNA-sekvensering för rumsliga och temporala vävnadsspecifika genuttryck analys i växter

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Detta protokoll använder Laser-Capture Microdissection tillsammans med RNA-Sekvensering för att erhålla spatiala och tidsmässiga transkriptomer från specifika celler i anläggningar av intressen, med hjälp av små mängder biologiska material. Den största fördelen med laserteknik är att den underlättar direkt visualisering av celler inom normal vävnadskontext, vilket gör att de diskreta cellerna exakt kan isoleras på ett kontaktfritt sätt. Även om detta protokoll är optimerat för isolering av växtceller, kan det tillämpas på de flesta celler som kan vara stologiskt identifierade.Bra provpreparering är kritiskt. Därför är en som utför denna teknik för första gången, prop optimering av vävnaden fixering och inbäddningen viktigt innan Laser-Capture Microdissection. Före insamling av vävnadsprovet, bered ett fixativt som är lämpligt för den art och vävnadstyp som skall skördas.För kornfrö, skär fröproverna i hälften innan du dränker proverna i minst en 10 X-volym iskallt fixativ. Använd vakuuminfiltration för att påskynda penetrationen av fixativet. Vävnaden bör sjunka i slutet av infiltrationen, sedan uppdatera fixative för en övernattning inkubation och överföra proverna till kassetter för vävnad bearbetning.Placera vävnaden lastade kassetter i metallkorgen på en automatisk processor och fäst metallkorgen på sin hållare ovanför kammare ett. Ställ in programmet på styrpanelerna i vävnadsprocessorn och tryck på start för att påbörja det automatiska bearbetningsprogrammet. Systemet kommer att torka ut proverna genom att doppa kassetterna i en gradient serie etanol i 90 minuter per koncentration enligt angivan.Efter den sista etanolbadningen kommer systemet att dränka proverna i xylengradienter i 90 minuter per lösning enligt angivelse. Följt av 290 minuters nedsänkning i smält paraffin vid 55 till 60 grader Celsius. Nästa morgon, ta bort paraffin infiltrerade kassetter från vävnad processorn och fortsätt till paraffin inbäddning.Nästa morgon, använd fina tövädrar för att överföra processen prover till lämpligt storlek formar och tillsätt smält paraffin över varje prov. För kornfrön, orientera proverna i paraffinet longitudinellt till skärriktningen för att underlätta anskaffningen av längsgående sektioner. Placera en ren kassett på formen och se till att hela kassetten är helt täckt med en tillräcklig volym paraffin för att säkra provet på kassetten.Placera sedan formen på en kall tallrik i 10 till 20 minuter tills paraffin är inställd innan du släpper blocket från formen. För att förbereda en PEN Membran Diabilder, dränka diabilderna i RNS avaktiverande lösning i tre sekunder följt av två korta tvättar och DEPC behandlat vatten. Sedan köra bilderna i en 370 grader Celsius inkubator för att ta bort överblivna lösning och UV behandla diabilder i en laminär flöde skåp i 30 minuter för att förbättra deras paraffin inte hasselnötter.För ett prov vävnadssektionering placera paraffinblocken på kallplattan och fyll vattenbadet med DEPC-behandlat vatten, värm sedan till 42 grader Celsius. Trimma block till djupet av regionen av intresse och avsnitt paraffin block till en sex till 10 mikron tjocklek. En väl sektionerad block kommer att bilda ett band vid kanten av bladet.Använd en fin pincett för att försiktigt överföra band från mikrotomen till vattenbadet, var noga med att bandet lägger sig platt på vattenytan. För att samla upp sektionerna, hålla en bild i 45 graders vinkel, använd en uppåtgående rörelse för att lyfta ett band ur vattnet på bilden och använda en ludd fri vävnad för att försiktigt ta bort överflödigt vatten. När alla sektioner har samlats in, tvätta objektglasen med 320 andra tvättar i xylen följt av 230 sekunder tvättar i 100%etanol och 230 andra tvättar i 70%etanol.Till microdissect celler av intresse från deparraffinerade och torra vävnad sektioner, ladda diabilder på de tre LCM mikroskop slitsar och ladda samlingsröret i de tillgängliga slitsar. Flytta scenen för att lokalisera den region av provet som måste skäras och skär ett tomt segment fritt från vävnad på membranet slide. För att optimera skärhastigheten och skärningen i lasertryckskatapulting energi och fokus.Använd ritverktygen för att skissera området av intresse i vävnaden och använd de optimerade parametrarna och Robo LPC-funktionen för att katapultcellerna in i de självhäftande locken. Välj flagga från elementlistan om du vill använda flaggverktyget för att markera de områden som är av intresse. Kontrollera knappen för kontroll av lock för att inspektera den självhäftande locket, för att bekräfta att proverna har fångats.Typiskt 10 till 15 sektioner per lock krävs för RNA-extraktion. Omedelbart efter att alla prover har förvärvats, fortsätt omedelbart till RNA-extraktion för att undvika RNA-nedbrytning. Efter RNA-utvinning och RNA-amplifiering använd ett automatiserat elektroforessystem, enligt tillverkarens instruktioner för att kvantifiera och kvalificera antisense RNA.I denna studie, LCM, RNA-sekvensering tillämpades på ett litet antal celler från tre embryo organ, var åtta timmar under en 48 timmars tid kurs under grobarhet. Det är viktigt att justera skärparametrarna korrekt så att vävnaden av intresse att skäras och lossna från den omgivande vävnaden utan att bränna kanten av det valda området. Förgreningen av det totala RNA före RNA-amplifiering gör det möjligt att upptäcka distinkta elektroforetiska band och fluorescerande toppar på 18 och 28S ribosomala underenheter i RNA-prover av god kvalitet.Framgångsrikt syntetiseras antisense RNA kommer att uppvisa en unimodal symmetrisk storlek distribution från 100 till 1000 nukleotider med en topp runt 300 nukleotider efter två omgångar av förstärkning. Flerdimensionell skala plottning av gener uttryckt i de olika vävnaderna över 48 timmar av grobarhet, illustrerar en större likhet mellan prover av en enda vävnad än mellan prover från samma tidpunkt punkt, men olika vävnader. Antalet differentiellt uttryckta gener ökar successivt under loppet av grobarhet i varje vävnad i förhållande till noll timme tidspunkten för vävnaden.I denna representativa analys, 25%av plumule, 34%av radicle och 41%av scutellum differentially uttryckt gener befanns vara uteslutande uttryckt inom varje vävnad. Det är viktigt att korrekt justera skärparametrarna för en exakt excision och dislodging av väljarområdet från den omgivande vävnaden utan att bränna kanten av den valda regionen. Med förbättrade kromatin och protein rening metoder, och förbättra masspektrometri instrument, LCM kan användas för celltyp specifika epigenomiska och proteomik studier implantat.

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser Capture Microdissection av däggdjur

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infektion &amp; Temporal analys av Virus Gene Expression: Del 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infektion &amp; Temporal analys av Virus Gene Expression: Del 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infektion &amp; Temporal analys av Virus Gene Expression: Del 3

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Använda Gene Pulser MXcell elektroporation System till transfektera primärceller med hög verkningsgrad

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Hjälp av ett automatiserat celltalsräknare att förenkla Studier Gene Expression: siRNA Knockdown av IL-4 beroende genuttryck i Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Beredning av Active T. castaneum Telomeras

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analys av global RNA syntes vid den inre cellnivå efter Hypoxi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...