Name: leveraging turbidity and thromboelastography for complementary clot characterization
Uploaded: 2020-06-04T15:00:00
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1. Herstellung von Phosphatpuffer-Saline (PBS)
HINWEIS: PBS wurde während dieser gesamten Studie verwendet, da die beschriebenen Tests keine Zugabe von Kalzium erforderten. Es ist wichtig zu beachten, dass bei der Zugabe von Kalzium, oft verwendet, um zitrierte Blutprodukte re-calcify, PBS sollte vermieden werden, da Kalzium bekannt ist, in Phosphatpuffern zu fällen.
<ol><li>Machen Sie einen 0,01 M, pH 7,4 PBS Puffer durch Mischen von 137 mM Natriumchlorid, 1,8 mM Kaliumphosphat monobasic,...

<ol>
	<li>Beckman, M. G., Hooper, W. C., Critchley, S. E., Ortel, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venous+Thromboembolism.+A+Public+Health+Concern.">Venous Thromboembolism. A Public Health Concern.</a> American Journal of Preventive Medicine. 38, 495-501 (2010).</li><li>Goldhaber, S. Z., Bounameaux, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+embolism+and+deep+vein+thrombosis.">Pulmonary embolism and deep vein thrombosis.</a> The Lancet. 379 (9828), 1835-1846 (2012).</li><li>Weisel, J. W., Litvinov, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clot+formation+under+diverse+clotting+conditions:+Comparing+turbidimetry+and+thromboelastography.">Fibrin clot formation under diverse clotting conditions: Comparing turbidimetry and thromboelastography.</a> Thrombosis Research. 187, 48-55 (2020).</li></ol>

Dieses Protokoll veranschaulicht die Verwendung von zwei unterschiedlichen Gerinnselcharakterisierungswerkzeugen, die ein vereinfachtes Fibrinogen-Thrombin-Gerinnselmodell mit kommerziell erhältlichen Komponenten testen. Sowohl TEG- als auch Trübungstests sind einfach durchzuführen. Sie bieten nicht nur Endpunktgerinnseluntersuchungen wie Max-Gerinnselbildung (TurbMax und TEGMax)und Gerinnselbildungszeiten (TurbTime und TEGTime)an, sondern bewerten auch den dynamischen Gerin...

Thrombose ist die pathologische Bildung eines Blutgerinnsels im Körper, das die Durchblutung blockiert, was weltweit zu hoher Morbidität und Sterblichkeit führt. Es gibt 1 bis 2 Fälle von venöser Thromboembolie und 2 bis 3 Fälle von Thrombose-induzierten Gefäßerkrankungen pro 1000 Personen jährlich1,2. Hier wird eine Methode vorgestellt, bei der die Thromboelastographie (TEG) und die Trübung zur Überwachung der Gerinnselbildung unter verschiedenen Gerinnungsbedingungen genutzt werden. Fibrin(ogen) ist das primäre Protein, das für die Gerinnselbildung im Körper verantwortlich ist. In den letzten Schritten der Gerinnungskakadade werden Fibrinopeptide aus Fibrinogen durch Thrombin, das die Polymerisation von unlöslichen Fibrinmonomeren initiiert, während das Gerinnsel3,4entwickelt. Um die Gerinnselbildung bei pathologischer Thrombose zu verstehen, ist es notwendig, die Fibrinbildung unter verschiedenen Gerinnungsbedingungen zu charakterisieren. Mehrere Gerinnsel-Monitoring-Assays wurden verwendet, um die Bildung von Fibrin-Gerinnsel in vitro zu untersuchen. Prothrombinzeit (PT/INR) und aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) sind zwei häufige klinische Assays, die die Integrität eines bestimmten Gerinnungswegs messen. Sie verwenden jedoch die Zeit als einzige Variable, die keinen Hinweis auf physikalische Gerinnseleigenschaftengibt 5. Die Elektronenmikroskopie ermöglicht die Visualisierung der Mikrostruktur eines vollständig geformten Fibringer, liefert aber keine Informationen über den Gerinnselbildungsprozess selbst6. Unter allen Assays bieten Trübungstests und TEG die Möglichkeit, Gerinnseleigenschaften im Laufe der Zeit dynamisch zu verfolgen. Diese Techniken ermöglichen das Maß umfassender Gerinnungsprofile und bieten somit einen gewissen Nutzen gegenüber anderen Fibrin-Gerinnselcharakterisierungswerkzeugen.
Insbesondere Trübungsassays (oder Gerinnseltrübung) werden aufgrund ihrer vereinfachten Umsetzung und der breiten Zugänglichkeit von Spektrometern in Forschungslaboratorien häufig für Forschungs- und klinische Anwendungen eingesetzt. Dieser Test ermöglicht eine dynamische Messung der Lichtdurchlässigkeit durch ein sich bildendes Gerinnsel, indem einzelne sich wiederholende Messwerte bei einer definierten Wellenlänge (am häufigsten bei einer Wellenlänge im Bereich von 350 – 700 nm)7durchgeführt werden. Die Temperatur in der Lesekammer kann ebenfalls eingestellt werden. Wenn sich Fibrin-Gel bildet, wird die Menge an Licht, die durch das Proteinnetzwerk fließt, reduziert, was zu einer Erhöhung der Absorption im Laufe der Zeit führt. In ähnlicher Weise nimmt die Absorption ab, wenn das Gerinnselnetz abnimmt. Trübungsassays können leicht mit einem Multi-Well-Plattenformat multiplexiert werden, um probenlange Sprossenabsiebungen in 96- und 384-Well-Platten zu ermöglichen. Mehrere Gerinnseleigenschaften können aus einer Trübungsverfolgungskurve (Absorption im Zeitmessung) abgeleitet werden, die Folgendes umfasst: maximale Trübung, Zeit bis maximaler Trübung, Zeit bis zum Gerinnselbeginn und Gerinnselbildungsrate (Vmax). Ein Fibrinfaser-Massen-Längen-Verhältnis kann auch aus rohen Trübungsdaten abgeleitet werden, um die Fibrinfaserdicke8,,9,10zu schätzen.
TEG wird in erster Linie im klinischen Umfeld zur Beurteilung der Hämostase und Gerinnsellyse von Patienten eingesetzt. Es wird auch häufig in chirurgischen Anwendungen verwendet, um festzustellen, wann anti-fibrinolytische Medikamente oder hämostatische Blutprodukte verabreicht werden sollten11,12. Die Gerinnselbildung erfolgt in einem TEG-Becher, wobei alle Gerinnungskomponenten vor Beginn des Testes dem Becher hinzugefügt werden. Der Becher, mit sich entwickelnden Gerinnsel, dreht sich physisch gegen einen Stift, der in seine Mitte eingeführt wird und ein elektromechanischer Torsionssensor misst die zunehmende viskoelastische Festigkeit des Gerinnsels. Dieser Test wird in der Regel bei einer physiologischen Temperatur von 37 °C durchgeführt; Die Temperatur kann jedoch manuell am Gerät eingestellt werden. Maximale Amplitude (MA), Reaktionsgeschwindigkeit (R), Kinetikzeit (K), Winkel (Winkel) und Zeit bis zur maximalen Amplitude (TMA) werden von der TEG-Software aus der dynamischen TEG-Ablaufverfolgung extrahiert. Diese Werte werden in der Regel mit klinischen Normalbereichen verglichen, um den Gerinnungszustand eines Patienten zu bewerten. Obwohl TEG nicht gerade ein Viskometer ist, da es die Gerinnselstärke in Millimetereinheiten misst, liefert es wichtige viskoelastische Gerinnseldaten und fungiert als wertvolles klinisches Entscheidungsinstrument für Ärzte, um sich für die Verabreichung bestimmter Blutprodukte und die Anpassung der therapeutischen Dosierung zu entscheiden13. Wenn sowohl TEG- als auch Trübungs-Assays zusammen verwendet werden, bieten sie ergänzende Informationen zur Gerinnselcharakterisierung, da die Gerinnselstärke und die Kinetik leicht aus TEG extrahiert werden können und die Fibrinfaserdicke durch optische Trübungsmessungen erreicht werden kann.
Da Fibrin ein kritischer Bestandteil eines Blutgerinnsels ist, kann die Fibringer-Charakterisierung unter verschiedenen Gerinnselbildungsbedingungen wertvolle Einblicke in die Art und Weise liefern, wie eine bestimmte Variable zum Gerinnselbildungsprozess und den ultimativen Gerinnseleigenschaften beiträgt. Dies zu verstehen, kann Eine Anleitung für die Thrombosediagnose und die Entwicklung von Therapeutika bieten. Um eine repräsentativere Fibringergercharakterisierung zu erhalten, kann Plasma ersetzt werden, um die Gerinnselbildung zu überwachen, da es in vivo Gerinnungsbedingungen näher aussieht als ein vereinfachtes Fibrinogen/Thrombin-Modellsystem. Aufgrund der komplizierten Natur der Gerinnungskaskade erhöht die Gerinnselbildung mit Plasma jedoch die Komplexität, was es schwieriger macht, die Auswirkungen einzelner Faktoren zu isolieren. Die Verwendung eines vereinfachten Fibrinogen-Thrombin-Modells verhindert die Notwendigkeit, die gesamte Gerinnungskaskade zu initiieren, was eine Isolierung des endgültigen Fibrinbildungsschritts ermöglicht. Durch die Einbeziehung von zwei großen Fibrin-Formungskomponenten (Fibrinogen und Thrombin) schafft dieses Setup eine hochkontrollierte Gerinnselbildung. Es ist auch wichtig zu beachten, dass, während das vereinfachte Gerinnselmodell hier verwendet wird, dieses Protokoll auch verwendet werden kann, um komplexere Gerinnsel zu charakterisieren, indem zusätzliche Gerinnungsfaktoren einschließen. In dieser Studie werden die Fibringercharakterisierung mit Trübung und TEG durch unterschiedliche Fibrinogen- und Thrombinkonzentrationen, Ionenstärke, pH-Wert und Gesamtproteinkonzentration in der Gerinnungslösung durchgeführt, um verschiedene In-vivo-Gerinnungsbedingungen nachzuahmen14. Einzelheiten zu diesen Änderungen des Protokolls wurden in Abschnitt 5 aufgenommen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3635</td>
			<td>Non-treated acrylic copolymer, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from human serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td>&#8805;96%, lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arium Mini Plus Ultrapure Water System</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>NA</td>
			<td>DI water source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>&#8805;96%, lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear)</td>
			<td>Haemonetics</td>
			<td>REF 6211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen, Bovine Plasma</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>341573</td>
			<td>contains more than 95% clottable protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>341578</td>
			<td>Contains &#8805; 95% clottable proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td>&#8805;99.5% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>&#8805;98% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SevenEasy pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>S20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71378</td>
			<td>&#8805;99.5% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71636</td>
			<td>&#8805;99.5% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system</td>
			<td>Haemonetics</td>
			<td>07-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin, Bovine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>605157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin, Human Plasma, High Activity</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>605195</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

leveraging turbidity and thromboelastography for complementary clot characterization

Thrombose ist weltweit eine der Haupttodesursachen. Fibrin(ogen) ist das Protein, das in erster Linie für die Gerinnselbildung oder Thrombose verantwortlich ist. Daher ist die Charakterisierung der Fibringeringerbildung vorteilhaft für die Untersuchung der Thrombose. Trübungs- und Thromboelastographie (TEG) sind beide weit verbreitete In-vitro-Assays zur Überwachung der Gerinnselbildung. Trübungsmittel misst dynamisch die Lichtdurchlässigkeit durch eine Fibrin-Gerinnselstruktur über ein Spektrometer und wird häufig in Forschungslabors eingesetzt. TEG ist eine spezialisierte viskoelastische Technik, die die Blutgerinnselstärke direkt misst und vor allem in klinischen Umgebungen zur Beurteilung der Hämostase der Patienten eingesetzt wird. Mit Hilfe dieser beiden Werkzeuge beschreibt diese Studie eine Methode zur Charakterisierung eines In-vitro-Fibringermitensels mit einem vereinfachten Fibrinogen/Thrombin-Gerinnselmodell. Die Datentrends beider Techniken wurden unter verschiedenen Gerinnungsbedingungen verglichen. Menschliche und Rinder Fibrin-Gerinnsel wurden nebeneinander in dieser Studie gebildet, da Rinder gerinnungsfaktoren werden oft als Ersatz für menschliche Gerinnungsfaktoren in klinischen und Forschungsumgebungen verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass TEG- und Trübungsbahn-Gerinnselbildung über zwei unterschiedliche Methoden und bei gleichzeitiger Nutzung komplementäre Gerinnselfestigkeit und Faserstrukturinformationen über verschiedene Gerinnungsbedingungen hinweg liefern.

Die in Abbildung 1 gezeigten Experimente sind repräsentative Trübungskurven, die Kurven von menschlichen und rindern Fibringer in verschiedenen Fibrinogenkonzentrationen verfolgen. Repräsentative TEG-Tracing-Kurven für die Fibringerbildung bei unterschiedlichen Fibrinogenspiegeln sind in Abbildung 2dargestellt. Beide Tracing-Kurven zeigen, dass nach einer Verzögerungsphase nach der Gerinnseleinweihung die Trübung oder die Gerinnselamplitude im Laufe der Ze...

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Leveraging Turbidity and Thromboelastography for Complementary Clot Characterization

Fibrin ist verantwortlich für die Gerinnselbildung während der Hämostase und Thrombose. Trübungsassays und Thromboelastograhy (TEG) können als synergistische Werkzeuge eingesetzt werden, die eine komplementäre Bewertung eines Gerinnsels ermöglichen. Diese beiden Techniken zusammen können mehr Einblick in die Art und Weise geben, wie Gerinnungsbedingungen die Bildung von Fibringer beeinflussen.

Nutzung von Trübung und Thromboelastographie zur komplementären Clot-Charakterisierung

Thrombosis is a leading cause of death worldwide. Fibrin(ogen) is the protein primarily responsible for clot formation or&#160;thrombosis. Therefore, ...

Thromboelastographie und Trübungsassays sind zwei einfache und unverwechselbare Methoden zur Gerinnselcharakterisierung. Diese Techniken bieten zusammen ein umfassenderes Verständnis dafür, wie sich Gerinnungsvariablen auf Gerinnselfunktionen auswirken. Beide Assays bieten nicht nur Endpunktgerinnselanalyse, sondern ziehen auch Fibrin-Gerinnselbildung im Laufe der Zeit an, im Gegensatz zu vielen anderen Gerinnselcharakterisierungswerkzeugen Diese Techniken können helfen, eine physiologisch relevante synthetische Gerinnselplattform zu entwickeln, die eine zuverlässige Diagnose des fibrinolytischen Zustands von Thrombosepatienten liefern kann, um die Trübung von Gerinnkörpern im Laufe der Zeit zu überwachen, jedes kommerziell erhältliche Spektrometer zu verwenden, das einen Absorptionsbereich von 350 bis 700 Nanometern aufweist.Schalten Sie das Spektrometer ein und öffnen Sie die entsprechende Analysesoftware. Wählen Sie dann Platte eins und öffnen Sie die Registerkarte Platteneinstellungen. Klicken Sie auf ABS und kinetisch, um eine dynamische Absorption im Laufe der Zeit zu überwachen.Wählen Sie 550 Nanometer in der Wellenlängen-Registerkarte, wechseln Sie dann zur Timing-Registerkarte und passen Sie die Gesamtlaufzeit auf 60 Minuten mit einem Intervall von 30 Sekunden an, wählen Sie die Sehenswürdigkeiten aus, indem Sie sie hervorheben. Pipette 140 Mikroliter PBS in einen Brunnen einer UV-transparenten 96-Wellplatte. Dann fügen Sie 10 Mikroliter Thrombin und mischen, sofort initiieren Gerinnung durch Zugabe von 50 Mikroliter Fibrinogen in den Brunnen und Pipette auf und ab fünf Mal mit nur dem ersten Stopp der Pipette unter Derobz zu vermeiden, blasen zu vermeiden.Legen Sie die Platte in den Plattenhalter und klicken Sie in der Software lesen, um die Trübung zu starten. Wenn der Lesewert die Trübungsdaten abgerufen und eine Trübungsverfolgungskurve erhalten, indem die Absorptionsmittel im Laufe der Zeit dargestellt werden, leiten Sie die maximale Trübung ab, indem Sie den maximalen Absorptionswert der Kurve über die Zeit nehmen, und berechnen Dann 90 % maximale Trübung, indem Sie die maximale Trübung mit 0,9 multiplizieren. Leiten Sie die Zeit bis zur maximalen Trübung ab, indem Sie die Zeit von der Gerinnselinitierung bis zu 90% maximaler Trübung berechnen.Schalten Sie die Thromboelastographie oder den TEG-Analysator ein, und warten Sie, bis sich die Temperatur bei 37 Grad Celsius stabilisiert, öffnen Sie dann die TEG-Software und erstellen Sie einen Experimentnamen unter dem Abschnitt ID. Klicken Sie auf die Registerkarte TEG, und folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm, um einen eTest-Test für alle Kanäle durchzuführen. Legen Sie dann den Hebel wieder in die Ladeposition, sobald alle Prüfungen abgeschlossen sind.Klicken Sie auf der Informationsseite auf Fertigstellen, und geben Sie Beispielinformationen für Kanäle ein, die verwendet werden. Legen Sie einen eindeutigen unbeschichteten TEG-Becher in den entsprechenden Kanal. Schieben Sie den Träger nach oben und drücken Sie den Becherboden fünfmal, um den Stift an der Torsionsstange zu fixieren, dann senken Sie den Träger und drücken Sie den Becher nach unten in die Basis, bis er klickt.Pipette 20 Mikroliter Thrombin-Lösung in den TEG-Becher, dann initiieren Gerinnung durch Zugabe von 340 Mikroliter Fibrinogen in die Tasse, um eine 360 Mikroliter Gerinnungslösung zu erhalten. Mischen Sie den Inhalt der Tasse, indem Sie fünfmal nach oben und unten pfeifen. Schieben Sie den becherbeladenen Träger nach oben bewegen Sie den Hebel in die Leseposition und klicken Sie in der Software auf Start, um den TEG-Lesung zu initiieren.Sobald der Messwert abgeschlossen ist, rufen Sie die Parameter ab, und erhalten Sie eine TEG-Ablaufverfolgungskurve, indem Sie die Amplitude im Zeitverlauf zeichnen. Wählen Sie MA als maximale Amplitude, die auf Gerinnseldehnung und TMA als Zeit bis zur maximalen Amplitude von der Software hinweist. Repräsentative Trübung und eine TEG-Tracing-Kurven von menschlichen und rindern Fibrin-Gerinnseln in verschiedenen Fibrinogen-Spiegeln werden hier gezeigt.Die Tracing-Kurven zeigen, dass nach einer Verzögerungsphase nach der Gerinnseleinweihung die Trübung oder die Gerinnselamplitude im Laufe der Zeit zunimmt und sich am Ende der Gerinnselbildung abbiegt. Maximale Trübung und maximale Trübung sind die beiden Parameter, die von Trübung abgeleitet werden, während maximale Amplitude und Zeit bis zur maximalen Amplitude von TEG abgeleitet werden. Bei einem höheren Fibrinogengehalt in der Gerinnungslösung erhöhen sich alle vier Werte.Maximale Trübung ist ein optisches Maß für die Gerinnselstruktur, das auf fibrin faserdicke und Fibrin-Netzwerkdichte hinweist. Während die maximale Amplitude ein mechanisches Maß ist, das die absolute Gerinnselbelastung widerspiegelt, bieten die beiden Werte zusammen einen ergänzenden Einblick in die Gerinnsel-Mikrostrukturen. Dieses Verfahren zeigt ein vereinfachtes Gerinnungsmodell, um Variablen zu untersuchen, die hauptsächlich die Fibrinpolymerisation betreffen.Dieses Modell kann durch Einbeziehung zusätzlicher Gerinnungsfaktoren angepasst werden, um andere Parameter zu untersuchen. Das Gerinnungsmodell kann leicht mit klinischen Plasmaproben modifiziert werden, um die Gerinnselbildung und Desillusionierung in Gegenwart von Antithrombotika zu überwachen. Die Ergebnisse könnten das therapeutische Management bei Patienten leiten.

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