Name: leveraging turbidity and thromboelastography for complementary clot characterization
Uploaded: 2020-06-04T15:00:00
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1. 인산염 완충식염식염수(PBS) 제제
참고: PBS는 칼슘의 첨가를 요구하지 않았던 기술된 분석으로 이 연구 전반에 걸쳐 사용되었습니다. 칼슘을 첨가할 때, 종종 석회화 성혈액 제품을 재석량에 사용하는 경우, 칼슘이 인산염 완충액에 침전되는 것으로 알려져 있기 때문에 PBS를 피해야 합니다.
<ol><li>0.01M, pH 7.4 PBS 완충제를 137m 염화나트륨, 1.8mm 칼륨 인산염 모노베이직, 10mMM 나...

<ol>
	<li>Beckman, M. G., Hooper, W. C., Critchley, S. E., Ortel, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venous+Thromboembolism.+A+Public+Health+Concern.">Venous Thromboembolism. A Public Health Concern.</a> American Journal of Preventive Medicine. 38, 495-501 (2010).</li><li>Goldhaber, S. Z., Bounameaux, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+embolism+and+deep+vein+thrombosis.">Pulmonary embolism and deep vein thrombosis.</a> The Lancet. 379 (9828), 1835-1846 (2012).</li><li>Weisel, J. W., Litvinov, R. 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이 프로토콜은 시판되는 부품을 사용하여 간소화된 피브리노겐/트롬빈 응고 모델을 테스트하는 두 개의 서로 다른 응고 특성화 도구의 활용을 보여줍니다. TEG와 탁도 세약 모두 수행하기 쉽습니다. 최대 응고 형성(TurbMax 및 TEGMax)및 응고 형성 시간(TurbTime 및 TEGTime)과같은 엔드 포인트 응고 검사를 제공할 뿐만 아니라 동적 응고 형성 공정을 평가합니다. 이로 인해 T...

혈전증은 전 세계적으로 높은 이환율과 사망률로 이어지는 혈액 순환을 차단하는 신체의 혈전의 병리학적 형성입니다. 정맥 혈전 색전증의 1-2 케이스 및 1000명 당 혈전증 유도 혈관 질환의 2 ~3 의 경우 매년1,,2가있습니다. 여기에 제시된 혈전 성형술(TEG) 및 탁도를 활용하여 다양한 응고 조건하에서 응고 형성을 모니터링하는 방법이 있다. 피브린 (ogen)은 신체의 혈전 형성을 담당하는 1 차 단백질입니다. 응고 폭포의 마지막 단계에서, 혈전이 진행됨에 따라 불용성 피브린 단량제의 중합화를 시화하는 혈전에 의해 피브리노펩티드는 피브리노겐으로부터 갈라지며3,,4. 병리학 적 혈전증의 혈전 형성을 이해하려면 다양한 응고 상황에서 피브린 형성을 특성화해야합니다. 여러 응고 모니터링 실험체는 시험관내에서 피브린 응고 형성을 연구하기 위해 활용되었습니다. 프로트롬빈 시간 (PT/INR) 및 활성화 된 부분 혈소 세포 세포 세포 (aPTT)는 특정 응고 경로의 무결성을 측정하는 두 가지 일반적인 임상 적 소이다. 그러나 시간을 물리적 응고 속성5의표시를 제공하지 않는 유일한 변수로 사용합니다. 전자 현미경 검사는 완전히 형성된 피브린 응고의 미세 구조의 시각화를 허용하지만 응고 형성 공정 자체에 대한 정보를 제공하지않습니다 6. 모든 애세 중, 탁도 에세이 및 TEG는 시간이 지남에 따라 동적으로 응고 특성을 추적 할 수있는 기능을 제공합니다. 이러한 기술은 포괄적인 응고 프로파일을 측정할 수 있으므로 다른 피브린 응고 특성화 도구에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다.
특히, 탁도 분석(또는 응고 석탁법)은 단순한 구현과 연구 실험실에서 분광기의 광범위한 접근성으로 인해 연구 및 임상 응용에 널리 사용됩니다. 이 분석법은 정의된 파장에서 개별 반복 판독값을 취하여 성형 응고를 통해 광 투과감을 역동적으로 측정할 수 있게 한다(가장 일반적으로 350 ~700nm 범위의 파장에서)7. 판독 챔버의 온도도 조절될 수 있다. 피브린 젤이 형성됨에 따라 단백질 네트워크를 통과하는 빛의 양이 감소되어 시간이 지남에 따라 흡수도가 증가합니다. 마찬가지로 응고 네트워크가 저하되면 흡광도가 줄어듭니다. 탁도 검사는 멀티플럭스화할 수 있으며 멀티플렉션을 사용하여 멀티플렉션하여 96-384웰 플레이트 모두에서 높은 처리량 샘플 스크리닝을 할 수 있습니다. 여러 응고 특성은 최대 탁도, 최대 탁도시간, 응고 개시 시간 및 응고 형성 속도(Vmax)를 포함하는 탁도 추적 곡선(시간 측정에 따른 흡광도)에서 파생될 수 있습니다. 피브린 섬유 질량/길이 비율은 또한 피브린 섬유 두께8,,9,,10을추정하기 위해 원시 탁도 데이터로부터 도출될 수 있다.
TEG는 주로 환자의 혈전 및 혈전 용해를 평가하기 위해 임상 환경에서 활용됩니다. 또한 일반적으로 항 섬유성 용해성 약물 또는 혈전성 혈액 제품이11,,12를투여해야 하는지 결정하기 위해 외과 응용 분야에서 일반적으로 사용된다. 혈전 형성은 분석이 시작되기 전에 컵에 추가되는 모든 응고 성분과 TEG 컵 내부에서 발생합니다. 진화하는 응고를 가진 컵은 중앙에 삽입되는 핀을 물리적으로 회전시키고 전기 기계 적 비틀림 센서는 응고의 증가점탄성 강도를 측정합니다. 이 분석은 전형적으로 37°C의 생리학적 온도에서 수행됩니다. 그러나 기기에서 온도를 수동으로 조정할 수 있습니다. 최대 진폭(MA), 반응 속도(R), 운동 시간(K), α-angle(Angle), 및 최대 진폭(TMA)까지의 시간은 동적 TEG 추적으로부터 TEG 소프트웨어에 의해 추출된다. 이 값은 전형적으로 환자의 응고 상태를 평가하기 위하여 임상 정상 범위와 비교됩니다. TEG는 정확하게 비스코머는 아니지만 밀리미터 단위로 응고 강도를 측정하기 때문에 의사가 특정 혈액 제품을 투여하고 치료 투여13을조정하기로 결정하는 귀중한 임상 의사 결정 도구로 중요한 점탄성 응고 데이터 및 기능을 제공합니다. TEG와 탁도 분석이 모두 함께 활용될 때, 응고 강도와 운동학이 TEG에서 쉽게 추출되고 피브린 섬유 두께가 광학 탁도 측정에 의해 접근할 수 있기 때문에 보완형 응고 특성화 정보를 제공합니다.
피브린은 혈전의 중요한 구성 요소이기 때문에 다양한 응고 형성 조건 하에서 피브린 응고 특성화는 특정 변수가 혈전 형성 과정 및 궁극적 인 응고 특성에 기여하는 방법에 대한 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이를 이해하면 혈전증 진단 및 치료 개발을 위한 지침을 제공할 수 있습니다. 보다 대표적인 피브린 응고 특성화를 얻기 위해 플라즈마는 단순화된 피브리노겐/트롬빈 모델 시스템보다 생체 내 응고 조건과 유사하므로 혈전 형성을 모니터링하기 위해 대체될 수 있다. 그러나 응고 폭포의 복잡한 특성으로 인해 플라즈마를 사용하는 응고 형성이 복잡성을 추가하여 개별 요인의 영향을 격리하기가 더 어려워집니다. 단순화 된 피브리노겐 / 트롬빈 모델을 사용하면 최종 피브린 형성 단계를 격리 할 수있는 전체 응고 캐스케이드를 시작할 필요가 없습니다. 2개의 중요한 피브린 형성 성분 (fibrinogen 및 혈전증)을 포함시킴으로써, 이 설치는 고도로 통제된 응고 형성 조건을 만듭니다. 또한 단순화된 응고 모델을 여기에서 사용하는 동안 이 프로토콜을 활용하여 추가 응고 계자를 포함시켜 보다 복잡한 혈전을 특성화할 수도 있습니다. 본 연구에서는, 피브린 응고 특성화는 다양한 피브리노겐 및 트롬빈 농도, 이온 강도, pH 및 응고 용액에서 의 총 단백질 농도에 의해 수행되어 생체 내 응고 상황에서 다른모방한다(14). 프로토콜에 대한 이러한 변형에 대한 세부 사항은 섹션 5에 포함되어 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3635</td>
			<td>Non-treated acrylic copolymer, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from human serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td>&#8805;96%, lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arium Mini Plus Ultrapure Water System</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>NA</td>
			<td>DI water source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>&#8805;96%, lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear)</td>
			<td>Haemonetics</td>
			<td>REF 6211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen, Bovine Plasma</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>341573</td>
			<td>contains more than 95% clottable protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>341578</td>
			<td>Contains &#8805; 95% clottable proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td>&#8805;99.5% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>&#8805;98% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SevenEasy pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>S20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71378</td>
			<td>&#8805;99.5% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71636</td>
			<td>&#8805;99.5% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system</td>
			<td>Haemonetics</td>
			<td>07-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin, Bovine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>605157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin, Human Plasma, High Activity</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>605195</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

leveraging turbidity and thromboelastography for complementary clot characterization

혈전증은 전 세계적으로 주요 사망 원인입니다. 피브린(ogen)은 혈전 형성 또는 혈전증을 주로 담당하는 단백질입니다. 따라서, 피브린 응고 형성을 특성화하는 것은 혈전증의 연구에 유익하다. 탁도 및 혈전 세포법(TEG)은 모두 혈전 형성을 모니터링하기 위한 시험관 내 실험에서 널리 활용된다. 탁도는 분광계를 통해 피브린 응고 구조를 통해 광 투과를 동적으로 측정하며 종종 연구 실험실에서 사용됩니다. TEG는 혈전 강도를 직접 측정하고 주로 환자의 hemostasis를 평가하기 위해 임상 설정에서 활용되는 전문 점탄성 기술입니다. 이 두 가지 도구의 도움으로, 이 연구는 단순화 된 피브리노겐 / 트롬빈 응고 모델을 사용하여 체외 피브린 응고를 특성화하는 방법을 설명합니다. 두 기술의 데이터 추세는 다양한 응고 조건에서 비교되었습니다. 인간과 소 피브린 혈전은 소 응고 요인이 종종 임상 및 연구 설정에 있는 인간 응고 요인에 대용품으로 이용되기 때문에 이 연구에서 나란히 형성되었습니다. 결과는 TEG와 탁도트랙 응고형성이 두 가지 방법을 통해, 함께 활용될 때 다양한 응고 조건에 걸쳐 보완적인 응고 강도와 섬유 구조 정보를 제공한다는 것을 보여줍니다.

도 1에 나타난 실험은 서로 다른 피브리노겐 수준에서 인간과 소 피브린 혈전의 대표적인 탁도 추적 곡선이다. 상이한 피브리노겐 수준에서 피브린 응고 형성을 위한 대표적인 TEG 추적 곡선이 도 2에도시된다. 두 추적 곡선 모두 응고 개시 후 지연 기간 이후에 응고 편도 또는 응고 진폭이 혈전 형성의 끝에 시간과 레벨이 증가한다는 것을 보여줍니다. ?...

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Leveraging Turbidity and Thromboelastography for Complementary Clot Characterization

피브린은 혈전증과 혈전증 중 응고 형성에 책임이 있습니다. 탁도 검사 및 혈전(TEG)은 응고의 보완적인 평가를 제공하는 시너지 도구로 활용할 수 있다. 이 두 가지 기술은 응고 조건이 피브린 응고 형성에 미치는 영향에 대한 더 많은 통찰력을 줄 수 있습니다.

보완 응고 특성화를 위한 탁도 및 혈전 성형술 활용

Thrombosis is a leading cause of death worldwide. Fibrin(ogen) is the protein primarily responsible for clot formation or&#160;thrombosis. Therefore, ...

혈전 성형술 과 탁도 학적 인 검사는 응고 특성화를위한 두 가지 간단하고 독특한 방법입니다. 이러한 기술은 응고 변수가 응고 기능에 미치는 영향에 대한 보다 포괄적인 이해를 제공합니다. 이 분석술 모두 엔드포인트 응고 분석을 제공할 뿐만 아니라 시간이 지남에 따라 피브린 응고 형성을 유치할 뿐만 아니라, 다른 많은 혈전 특성화 도구와 달리 이러한 기술은 혈전증 환자의 혈전 경직 상태를 신뢰할 수 있는 진단을 제공할 수 있는 생리학적관련 합성 응고 플랫폼을 개발하는 데 도움이 될 수 있으며, 시간이 지남에 따라 응고 편도를 모니터링하여 70나노계를 흡수하는 시판가능한 분광계를 사용한다.분광기를 켜고 해당 분석 소프트웨어를 엽니다. 그런 다음 플레이트 하나를 선택하고 플레이트 설정 탭을 엽니다. ABS와 운동을 클릭하여 시간이 지남에 따라 동적 흡광도를 모니터링합니다.파장 탭에서 550나노미터를 선택한 다음 타이밍 탭으로 전환하여 총 런타임을 30초 간격으로 60분으로 조정하여 강조 표시하여 관심 있는 우물을 선택합니다. 파이펫 140 마이크로리터의 PBS는 UV 투명 96 웰 플레이트의 한 웰에 넣습니다. 그런 다음 10 마이크로 리터의 혈소판과 혼합을 추가하고, 즉시 거품을 만드는 것을 피하기 위해 주의파이펫의 첫 번째 정지를 사용하여 5 번 및 아래 피브리노겐의 50 마이크로 리터를 추가하여 응고를 시작합니다.플레이트 홀더에 접시를 놓고 소프트웨어에서 읽기를 클릭하여 탁도 판독을 시작합니다. 판독이 완료되면 탁도 데이터를 검색하고 시간이 지남에 따라 흡수제의 변화를 플로팅하여 탁도 추적 곡선을 얻고, 시간이 지남에 따라 곡선의 최대 흡광도 값을 취하여 최대 탁도를 도출한 다음 최대 탁도를 0.9로 곱하여 90%최대 탁도를 계산합니다. 응고 개시에서 90%의 최대 탁도까지의 시간을 계산하여 최대 탁도까지 시간을 유도합니다.혈전 성형술 또는 TEG 분석기를 켜고 온도가 섭씨 37도에서 안정될 때까지 기다린 다음 TEG 소프트웨어를 열고 ID 섹션 아래에 실험 이름을 만듭니다. TEG 탭을 클릭하고 화면 프롬프트를 따라 모든 채널에 대한 eTest 테스트를 수행합니다. 그런 다음 모든 검사가 완료되면 레버를 로드 위치에 다시 배치합니다.정보 페이지와 사용 될 채널에 대한 입력 샘플 정보를 클릭합니다. 해당 채널에 코팅되지 않은 명확한 TEG 컵을 배치합니다. 캐리어를 위로 밀어 내고 컵 하단을 5번 눌러 핀을 비틀림 막대에 고정한 다음 캐리어를 낮추고 컵을 클릭할 때까지 베이스로 아래쪽으로 누릅니다.파이펫 20 마이크로리터의 혈소판 용액을 TEG 컵에 넣은 다음 360 마이크로리터 응고 용액을 얻기 위해 340 마이크로리터의 피브리노겐을 컵에 추가하여 응고를 시작합니다. 컵의 내용물들을 5번 위아래로 피펫팅하여 섞는다. 컵로드 된 캐리어를 밀어 읽기 위치로 레버를 이동하고 TEG 판독을 시작하기 위해 소프트웨어에서 시작을 클릭합니다.판독값이 완료되면 매개 변수를 검색하고 시간이 지남에 따라 진폭을 플로팅하여 TEG 추적 곡선을 얻습니다. 최대 진폭으로 MA를 선택, 이는 소프트웨어에서 최대 진폭에 시간으로 응고 변형 및 TMA를 나타내는. 다른 피브리노겐 수준에서 인간과 소 피브린 혈전의 대표적인 탁도 및 TEG 추적 곡선이 여기에 표시됩니다.추적 곡선은 응고 개시 후 지연 기간 이후에 응고 편도 또는 응고 진폭이 혈전 형성의 끝에 시간과 레벨이 증가한다는 것을 보여줍니다. 최대 탁도 및 최대 탁도에 대한 시간은 탁도에서 파생된 두 매개 변수이며 최대 진폭및 최대 진폭까지의 시간은 TEG에서 파생됩니다. 응고 용액에서 더 높은 수준의 피브리노겐에서 네 가지 값이 모두 증가합니다.최대 탁도는 혈전 구조의 광학 척도로, 이는 피브린 섬유 두께와 피브린 네트워크 밀도를 나타냅니다. 최대 진폭은 절대 응고 균주를 반영하는 기계적 측정이지만, 두 값을 함께 취하면 응고 마이크로 구조에 대한 무료 통찰력을 제공합니다. 이 절차는 주로 피브린 중합화에 영향을 미치는 변수를 검사하기 위해 단순화 된 응고 모델을 보여줍니다.이 모델은 다른 매개 변수를 연구하기 위해 추가 응고 요인을 포함시켜 사용자 정의 할 수 있습니다. 응고 모델은 항혈전 약물이 있는 경우 혈전 형성 및 환멸을 모니터링하기 위해 임상 플라즈마 샘플을 사용하여 쉽게 변형될 수 있다. 결과는 환자에 있는 치료 관리를 지도할 수 있었습니다.

Research

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