Name: probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2020-07-30T13:30:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

وقد تم تطوير هذا البروتوكول من قبل س. ك. خلال بحثها ما بعد الدكتوراه في مختبر الدكتور كريستين جاكوبس فاغنر في معهد هوارد هيوز الطبي ومعهد العلوم الميكروبية في جامعة ييل. نشكر الدكتورة جاكوبس فاغنر وأعضاء مختبرها على مختلف المدخلات خلال تطوير الأسلوب ولورا تروير على القراءة النقدية للمخطوطة. س. ك. يعترف بالدعم من برنامج علماء سيرل؛ يعترف ك. ف. بدعم جائزة جيمس جيمس دارس بريبل للأبحاث من جامعة إلينوي.

<ol>
	<li>Bervoets, I., Charlier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity,+versatility+and+complexity+of+bacterial+gene+regulation+mechanisms:+opportunities+and+drawbacks+for+applications+in+synthetic+biology.">Diversity, versatility and complexity of bacterial gene regulation mechanisms: opportunities and drawbacks for applications in synthetic biology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 304-339 (2019).</li><li>Epshtein, V., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+RNA+polymerase+molecules+in+transcription+elongation.">Cooperation between RNA polymerase molecules in transcription elongation.</a> Science. 300 (5620), 801-805 (2003).</li><li>Vogel, U., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+chain+elongation+rate+in+Escherichia+coli+depends+on+the+growth+rate.">The RNA chain elongation rate in Escherichia coli depends on the growth rate.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 2807-2813 (1994).</li><li>Tennyson, C. N., Klamut, H. J., Worton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+dystrophin+gene+requires+16+hours+to+be+transcribed+and+is+cotranscriptionally+spliced.">The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is cotranscriptionally spliced.</a> Nature Genetics. 9, 184 (1995).</li><li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes.">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 16, 1128 (2009).</li><li>Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+RNA+Half-Life+Analysis+in+Escherichia+coli+Reveals+Positional+Patterns+of+Transcript+Degradation.">Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation.</a> Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).</li><li>Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. -. H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+decay+and+abundance+in+Escherichia+coli+at+single-gene+resolution+using+two-color+fluorescent+DNA+microarrays.">Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).</li><li>P&#233;rez-Ort&#237;n, J. E., Medina, D. A., Ch&#225;vez, S., Moreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+do+you+mean+by+transcription+rate.">What do you mean by transcription rate.</a> BioEssays. 35 (12), 1056-1062 (2013).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li><li>Kuchina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+single-cell+RNA+sequencing+by+split-pool+barcoding.">Microbial single-cell RNA sequencing by split-pool barcoding.</a> BioRxiv. , 869248 (2019).</li><li>Blattman, S. B., Jiang, W., Oikonomou, P., Tavazoie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotic+single-cell+RNA+sequencing+by+in+situ+combinatorial+indexing.">Prokaryotic single-cell RNA sequencing by in situ combinatorial indexing.</a> Nature Microbiology. , (2020).</li><li>Femino, A., Fay, F., Fogarty, K., Singer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Montero Llopis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+flow+of+genetic+information+in+bacteria.">Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria.</a> Nature. 466 (7302), 77-81 (2010).</li><li>So, L. -. h., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+properties+of+transcriptional+time+series+in+Escherichia+coli.">General properties of transcriptional time series in Escherichia coli.</a> Nature Genetics. 43 (6), 554-560 (2011).</li><li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells.">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li><li>Jones, D. L., Brewster, R. C., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+architecture+dictates+cell-to-cell+variability+in+gene+expression.">Promoter architecture dictates cell-to-cell variability in gene expression.</a> Science. 346 (6216), 1533-1536 (2014).</li><li>Iyer, S., Park, B. R., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantitative+measurement+of+transcriptional+kinetic+parameters+in+vivo.">Absolute quantitative measurement of transcriptional kinetic parameters in vivo.</a> Nucleic Acids Research. 44 (18), 142 (2016).</li><li>Kim, S., Beltran, B., Irnov, I., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Distance+Cooperative+and+Antagonistic+RNA+Polymerase+Dynamics+via+DNA+Supercoiling.">Long-Distance Cooperative and Antagonistic RNA Polymerase Dynamics via DNA Supercoiling.</a> Cell. 179 (1), 106-119 (2019).</li><li>Wang, M., Zhang, J., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+transcription+at+a+single+gene+copy+reveals+hidden+drivers+of+bacterial+individuality.">Measuring transcription at a single gene copy reveals hidden drivers of bacterial individuality.</a> Nature Microbiology. 4 (12), 2118-2127 (2019).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Labeling DNA (or RNA) for single-molecule FRET. 2012 (9), 1005-1008 (2012).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Ethanol Precipitation of DNA in Microcentrifuge Tubes. 2006 (1), 4456 (2006).</li><li>Skinner, S. O., Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization.">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li><li>Adesnik, M., Levinthal, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+and+degradation+of+lactose+operon+messenger+RNA+in+E.+coli.">The synthesis and degradation of lactose operon messenger RNA in E. coli.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 35, 451-459 (1970).</li><li>Campbell, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+for+rifampicin+inhibition+of+bacterial+RNA+polymerase.">Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase.</a> Cell. 104 (6), 901-912 (2001).</li><li>Raj, A., Tyagi, S., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 472, 365-386 (2010).</li><li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics.">High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Molecular Microbiology. 80 (3), 612-627 (2011).</li><li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oufti:+an+integrated+software+package+for+high-accuracy,+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis.">Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Molecular Microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).</li><li>Moffitt, J. R., Zhuang, X., Filonov, G. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).</li><li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+gene+expression+in+live+cells,+one+protein+molecule+at+a+time.">Probing gene expression in live cells, one protein molecule at a time.</a> Science. 311 (5767), 1600-1603 (2006).</li><li>Chen, H., Shiroguchi, K., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+study+of+mRNA+degradation+and+transcript+elongation+in+Escherichia+coli.">Genome-wide study of mRNA degradation and transcript elongation in Escherichia coli.</a> Molecular Systems Biology. 11 (1), 781 (2015).</li><li>Vogel, U., S&#248;rensen, M., Pedersen, S., Jensen, K. F., Kilstrup, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreasing+transcription+elongation+rate+in+Escherichia+Coli+exposed+to+amino+acid+starvation.">Decreasing transcription elongation rate in Escherichia Coli exposed to amino acid starvation.</a> Molecular Microbiology. 6 (15), 2191-2200 (1992).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+and+translation+contribute+to+gene+locus+relocation+to+the+nucleoid+periphery+in+E.+coli.">Transcription and translation contribute to gene locus relocation to the nucleoid periphery in E. coli.</a> Nature Communications. 10 (1), 5131 (2019).</li><li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast.">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li><li>Fontenete, S., Guimar&#227;es, N., Wengel, J., Azevedo, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+melting+temperatures+in+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+procedures+using+thermodynamic+models.">Prediction of melting temperatures in fluorescence in situ hybridization (FISH) procedures using thermodynamic models.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 36 (3), 566-577 (2016).</li><li>Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Zhang, J., Wang, M., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+gene+regulation+in+individual+cells+reveals+rapid+switching+between+promoter+states.">Measurement of gene regulation in individual cells reveals rapid switching between promoter states.</a> Science. 351 (6278), 1218-1222 (2016).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+shapes+the+turnover+of+a+bacterial+transcriptome.">Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome.</a> eLife. 5, 13065 (2016).</li><li>Fei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+in+vivo+target+search+kinetics+of+regulatory+noncoding+RNA.">Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA.</a> Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).</li></ol>

ويعلن أصحاب البلاغ أنهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.

هنا، قدمنا بروتوكول smFISH لقياس حركية مرنا في الإشريكية القولونية. في بروتوكولات smFISH المنشورة سابقا للبكتيريا23، تم الاحتفاظ بالخلايا في الأنابيب حتى نهاية البروتوكول ، وهذا هو حتى تكون جاهزة للتصوير. في حين أن له فوائد كثيرة، مثل الحد الأدنى من الربط غير المحدد من المسابير الفلورية على سطح الغطاء23، فمن الصعب اتباع هذه البروتوكولات عندما يكون هناك العديد من العينات من تجربة مسار زمني. أولاً، يحتاج حجم كبير نسبياً من الخلايا (>1 مل) إلى أخذ عينات منه وحتى حصاده قبل التثبيت. ثانياً، تحتاج عينات الخلايا إلى الطرد عدة مرات لتبادل الحلول والغسيل بعد خطوة التهجين. في بروتوكول لدينا، يتم خلط حجم صغير (< 1 مل) من الثقافة مباشرة مع حل تحديد في أنبوب 1.5-مل، مما يساعد على "تجميد" بسرعة حالة الخلية في لحظة أخذ العينات. أيضا، تبقى الخلايا تعلق على السطح طوال العملية، ويمكن تبادل حلول مختلفة بسرعة عن طريق التعرق السوائل مع نظام الترشيح فراغ وتطبيق حل قطرات في وقت واحد مع ماص متعدد القنوات. هذا الاختلاف يجعل لدينا بروتوكول مفيد للغاية عندما يكون هناك عدد كبير من العينات تحتاج إلى معالجة في وقت واحد. باستخدام بروتوكول لدينا، 12-48 عينات يمكن التعامل معها في وقت واحد، ويمكن الانتهاء من الإجراء كامل FISH في غضون ~ 8 ساعات، حول كمية مماثلة من الوقت اللازم للحصول على عينات قليلة(الشكل 2). على الرغم من أننا استخدمنا التعبير عن lacZ في الإشريكية القولونية كمثال، البروتوكول ينطبق على نطاق واسع على الجينات المختلفة والأنواع البكتيرية مع الاعتبارات التي نوقشت أدناه.
بالنسبة للجينات المختلفة ، فإن أول شيء يجب مراعاته هو تحقيقات smFISH. يمكن للمرء أن تصميم تحقيقات oligonucleotide التي بلاط مرنا من الفائدة (الشكل 1A)13. في هذا النهج التحقيق "التبليط"، كل مسبار هو ~ 20 قاعدة طويلة وتسمى مع الفلوروفور في 5 'أو 3' 10000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 هذه الاستراتيجية مريحة حيث لا توجد حاجة إلى التلاعب الجيني. وبدلاً من ذلك، يمكن إدراج تكرار تناظري من ~20 بت في الطنين، وهو غريب عن التسلسل الجيني (على سبيل المثال، مجموعة من تسلسل اللاكو في Caulobacter crescentus14)في المنطقة غير المترجمة لجين ذي أهمية، ويستخدم مسبار واحد مكمل لوحدة التكرار لتسمية نهج مرنا ("صفيف"؛ الشكل 1 ب). في كلتا الحالتين، تزين الفلوروفهورات المتعددة مرنا، مما يعطي إشارة الفلورانس المضخمة التي يمكن تمييزها بسهولة عن مسبار واحد غير محدد داخل خلية.
يعتمد اختيار نهج "التبليط" أو "الصفيف" على التحكم السلبي، وهي عينة يتم فيها اختبار الربط غير المحدد للمسبارات لأنها تفتقر إلى الRNA المستهدف. بالنسبة إلى تحقيقات التبليط (الشكل 1A) ، يمكن أن تكون سلالة متحولة بدون جينة ذات فائدة أو حالة ، والتي لا يتم فيها نسخ الجين (على سبيل المثال ، قمع lacZ)بمثابة تحكم سلبي لاختبار الربط غير محدد من المسابير. لsmFISH على أساس مجموعة (الشكل 1B) ، سلالة من نوع البرية تفتقر إلى مجموعة يمكن أن تكون بمثابة سيطرة سلبية لأنه لا يحتوي على مواقع ملزمة للتحقيقات.
قد تعتمد ظروف التهجين المثلى على تسلسلات التحقيق وحتى على اختيار الأصباغ الفلوروفور. نحن الأمثل شرط التهجين لمجموعات مسبار lacZ عن طريق الحفاظ على درجة حرارة التهجين عند 37 درجة مئوية واختبار تركيزات مختلفة من مجموعات التحقيق و formamide في حل التهجين. تميل التركيزات الأعلى من الفورماميد إلى تقليل كل من غير محدد ومحدد ملزم26,35. نوصي بتغيير التهجين وظروف الغسيل بشكل منهجي مع الحفاظ على وقت التهجين ودرجة الحرارة نفسها. كما يصبح الشرط أكثر صرامة، على حد سواء غير محددة والمحددة ملزمة انخفاض(الشكل 6). من المهم العثور على نقطة يبدأ فيها الربط غير المحدد في التسوية تحت عتبة مقبولة دون المساس بـ Binding المحدد. على سبيل المثال، استخدمنا مستوى الإشارة الذي تم الحصول عليه دون أي تحقيقات ("لا تحقيقات") كعتبة(الشكل 6).
ويقتصر أسلوب smFISH ذات اللونين الذي يصف منطقتين منفصلتين من الميرنا على الجينات الطويلة. لقياس معدل استطالة النسخ ، استفدنا من حقيقة أن lacZ طويل (3075 bp) ويمكن أن يسببه IPTG التعبير عنه. عندما يكون الجين قصيرًا ، من الصعب تصميم مجموعتين من مسبار التبليط (بالقرب من 5 'و3' ينتهي) وحل تأخير الوقت بين ظهور مناطق 5 'مقابل 3' مرنا. في هذه الحالة، يمكن للمرء أن عد mRNAs الوليدة في حالة ثابتة بواسطة smFISH وتحليل توزيعها مع نموذج التحليلية التي لديها معدل الاستطالة النسخ كمعلمة المناسب20. أيضا، عندما لا يكون الجين من الفائدة غير قابل للاختصاص، يمكن للمرء أن يعامل الخلايا مع ريفامبيسين في الوقت صفر وقياس التغير الزمني في 5 'و 3' مرنا المناطق الفرعية. ويمكن بعد ذلك التأخير من انخفاض إشارة مرنا 5 إلى أن من 3 'إشارة مرنا يمكن استخدامها لحساب معدل استطالة النسخ كما فعلت سابقا31.
وأخيراً، فإن بروتوكول smFISH متعدد الاستخدامات ويمكن دمجه مع مخططات وضع العلامات الأخرى. سابقا, تم تصور موضع الحمض النووي جنبا إلى جنب مع mRNAs من خلال الجمع بين سمك الحمض النووي مع أي من الحمض النووي FISH14 أو نظام الفلورسنت مراسل المشغل20. ويمكن تصور منتجات البروتين عن طريق أداء المناعةfluorescence جنبا إلى جنب مع سمك مرنا14,36. أيضا، يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع ثلاثية الأبعاد فائقة الدقةالمجهرية 37 لتصور mRNAs في جميع الأبعاد الثلاثة38،39.

تدفق المعلومات الوراثية من الحمض النووي إلى مرنا والبروتين هي واحدة من العمليات الخلوية الأساسية، التي تنظيم مهم للياقة الخلوية1. يتم تحديد عدد mRNAs في خلية بواسطة اثنين من العمليات الحيوية، النسخ، وتدهور مرنا. ومع ذلك، فإن كيفية تنظيم النسخ وتدهور مرنا في الزمان والمكان من خلية واحدة لا تزال غير مفهومة تماما، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى نقص الأساليب التجريبية لقياس حركيتها كميا في الجسم الحي.
يمكن لأساليب تستند إلى mRNAs الإجمالي المستخرجة من مجموعة من الخلايا ، مثل لطخة الشمالية ، RT - PCR ، تسلسل الحمض النووي الريبي ، وmicroarrays التعبير الجيني ، قياس الفرق النسبي في مستويات مرنا وقد استخدمت على نطاق واسع لتحليل معدل استطالة النسخ2،3،4،5 أو معدل تدهور الحمض النووي الريبي6،7. ومع ذلك ، فإنها لا توفر العدد المطلق من mRNAs في الخلية الواحدة ، وبالتالي ، فهي ليست مناسبة لالرقاب معدل بدء النسخ8. كذلك، لأن mRNAs يتم استخراجها من مجموعة من الخلايا، لا يمكن قياس التوزيع المكاني للmRNAs داخل خلية واحدة ومدى تغير أرقام نسخ مرنا بين الخلايا.
الجيل التالي من تسلسل الحمض النووي الريبي على الخلايا الفردية (scRNAseq) يمكن أن يحدد عدد mRNAs لكل خلية في مقياس الجينوم9. ومع ذلك، لا يزال من الصعب استخدام هذه التقنية لقياس حركية النسخ، وذلك بسبب التحديات مع إعداد العينة وارتفاع التكلفة. على وجه الخصوص، تطبيق scRNAseq على البكتيريا كان من الصعب من الناحية الفنية بسبب انخفاض وفرة مرنا10،11.
ويستند التألق أحادي الجزيء في التهجين الموقعي (smFISH) على تهجين المسابر ذات التسمية الفلورية وحيدة التي تقطعت بها السبل والتي تُكمل تسلسلاتها للمر ن ب. م. الهدف من الفائدة12،13. ويماثل مفهوم التهجين الخاص بالتسلسل المفهوم المستخدم في البقعة الشمالية أو RT-PCR، ولكن يتم التهجين في الموقع داخل خلايا ثابتة، للحفاظ على التعريب الأصلي للـ mRNAs. يتم تضخيم إشارة مرنا واحدة باستخدام العديد من المسابير، ~ 20 النيوكليوتيدات (nt) في الطول، والتهجين إلى أجزاء مختلفة من مرنا (الشكل 1A)13. في هذا النهج التحقيق "التبليط" ، وعدد من المسابير اللازمة للكشف عن مرنا واحدة يحدد حدا أقل على طول مرنا التي يمكن أن تكون مقايسة. بدلا من ذلك، قد يكون مرنا من الفائدة من تنصهر نسخ إلى مجموعة غير ترميز من تسلسل مشغل لاك جنبا إلى جنب، بحيث نسخ متعددة من مستوصف اللاكمو المسمى الفلورية التهجين إلى مرنا واحد(الشكل 1B)14.
وقد استخدمت smFISH لتحديد عدد mRNAs لكل خلية في حالة ثابتة (أي عندما يكون التوليف والاضمحلال في التوازن) وتحليل متوسط وتقلب mRNAs بين الخلايا البكتيرية15,16,17. في الآونة الأخيرة، وقد تم تطبيق smFISH لتحديد أرقام مرنا في حالة غير ثابتة، والحق بعد تحريض أو قمع التعبير الجيني في الإشريكية القولونية18،19،20. ثم استخدمت التغيرات الزمنية في أرقام نسخة مرنا المطلقة لحساب معدل بدء النسخ، واستطالته، وإنهائه، وكذلك معدل تدهور مرنا. لهذا التطبيق، يمكن أن تكون إجراءات SMFISH التقليدية مرهقة لأن هناك العديد من العينات، كل منها يمثل نقطة زمنية واحدة، التي تحتاج إلى الذهاب من خلال خطوات تبادل العازلة متعددة (أي، الطرد المركزي والغسيل). هنا، ونحن وصف بروتوكول smFISH، والتي يتم تبسيط خطوات معالجة العينة بشكل كبير من خلال وجود الخلايا الالتزام السطح من غطاء والسوائل عن طريق التعرق مع نظام الترشيح فراغ14،19. باستخدام التعبير عن lacZ في الإشريكية القولونية كمثال، يتم إثبات سير العمل الكامل(الشكل 2)،بما في ذلك تحليل الصور(الشكل 3)مما يؤدي إلى الحركية في الجسم الحي للنسخ (البدء، الاستطالة، وإنهاء) وتدهور الرنا، وتقلب من خلية إلى خلية في التعبير مرنا، وتعريب مرنا. نتوقع أن البروتوكول ينطبق على نطاق واسع على التحقيق في الحركية الجسم الحي وتوطين mRNAs الأخرى في أنواع البكتيريا المختلفة.

probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization

الفلور أحادي الجزيء في التهجين الموضعي (smFISH) يسمح بحساب العدد المطلق من mRNAs في الخلايا الفردية. هنا، ونحن وصف تطبيق smFISH لقياس معدلات النسخ وتدهور مرنا في Escherichia القولونية. كما يعتمد smFISH على خلايا ثابتة ، نقوم بأداء smFISH في نقاط زمنية متعددة خلال تجربة الوقت ، أي عندما تمر الخلايا بتغييرات متزامنة عند تحريض أو قمع التعبير الجيني. في كل نقطة زمنية، يتم تمييز المناطق الفرعية من مرناً بشكل طيفي إلى الاستطالة النسخي التحقيقي وإنهاء سابق لأوانه. كما تسمح نتيجة هذا البروتوكول بتحليل التعريب داخل الخلايا للـ mRNAs والتغاير في أرقام نسخ مرنا بين الخلايا. باستخدام هذا البروتوكول العديد من العينات (~ 50) يمكن معالجتها في غضون 8 ساعة ، مثل مقدار الوقت اللازم لبعض العينات. نناقش كيفية تطبيق هذا البروتوكول لدراسة حركية النسخ والتحلل لمختلف mRNAs في الخلايا البكتيرية.

Watch this Scientific Journal Video about Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

يصف هذا البروتوكول تطبيق الفلورو جزيء واحد في التهجين الموقعي (smFISH) لقياس حركية المير النووي في الجسم الحي من التوليف والتحلل.

فحص حركية الميرنا في المكان والزمان في الإشريكية القولونية باستخدام الفلورس أحادي الجزيء بلونين في التهجين الموقعي

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

ومن المعروف smFISH لقياس العدد المطلق كما موقع الخلية الفرعية من mRNAs. لدينا بروتوكول sMFISH اللون اثنين لديه القدرة المضافة لقياس حركية النسخ وتدهور مرنا. باستخدام هذه الطريقة، يمكن معالجة العديد من العينات في وقت واحد دون وقت إضافي أو جهد.على سبيل المثال، يمكن معالجة أربع تجارب دورة تدريبية زمنية تسفر عن 48 عينة للتصوير في ثماني ساعات. بروتوكولنا ينطبق على نطاق واسع على العديد من الجينات والأنواع البكتيرية. لإعداد زلات الغلاف والشرائح الزجاجية للتجربة.استخدام ملقط لوضع غطاء زلات والشرائح في جرة كوبلين التي تحتوي على 100٪ الإيثانول ووضع جرة في حمام المياه بالموجات فوق الصوتية تلبية لمدة 15 إلى 20 دقيقة. في نهاية sonication غسل الشرائح وغطاء زلات ثلاث إلى أربع مرات مع المياه النقية جدا قبل إعادة ملء جرة مع 70٪ الإيثانول وتكرار sonication. عندما يتم القيام به كل الخطوات sonication، وتجفيف زلات الغطاء والشرائح مع غاز النيتروجين.ضع الغطاء ينزلق في صندوق تلميح 1000 ميكرولتر ميكرولتر فارغ ووضع الشرائح في مربع شريحة نظيفة. ثم، بعد ثقوب صندوق تلميح ماصة استخدام علامة المياه لرسم الدوائر على زلات الغطاء وتطبيق 20 ميكرولتر قطرة 0.1٪ بولي ل يسين إلى كل من هذه الآبار. لإعداد تجربة دورة زمنية، أضف 750 ميكرولترات من ثقافة الإشريكية القولونية المتنامية بشكل كبير إلى أنبوب ثقافة 1.5 ملليلتر يحمل علامة الوقت صفر.وعلى الفور عكس الأنبوب. حث التعبير لاك Z مع 0.2 إلى واحد ملليمولار IPTG وبدء جهاز ضبط الوقت. بعد التحقق من جهاز ضبط الوقت، وجمع ثقافة الخلية في كل نقطة زمنية تجريبية متتالية كما أظهرت للتو.عند نقطة الوقت المناسبة أثناء التجربة، أضف خمسة ملليمولار ONPF إلى القارورة لقمع التعبير الزى اللاك ومواصلة أخذ عينات من الثقافات لتتبع تدهور الرنا. في نهاية الوقت من الحصول على عينة الدورة، احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة تليها حضانة على الجليد لمدة 30 دقيقة. في نهاية الطرد المركزي الحضانة العينات لإزالة المثبت واستخدام ماصة لإزالة فائقة.إعادة تعليق البكتيريا في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني DEPC وغسل الخلايا مرتين أكثر في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني DEPC الطازجة لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، إعادة تعليق الخلايا في 30 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني DEPC الطازجة. لـ(أيّد) الخلايا.أولا إضافة العينة من كل مرة نقطة إلى الآبار الدابيبية على واحد من الايثانول معقمة الزجاج غطاء زلات. وتسمح للخلايا أن تلتزم زلة الغطاء مع حضانة 10 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، إضافة 15 ميكرولترات من 70٪ الإيثانول إلى كل بئر.بعد أربع دقائق، يُشعّر الإيثانول من كل بئر حتى تكون الآبار جافة تماماً. بعد الغسيل إضافة 30 ميكرولترات من محلول ما قبل التهجين إلى كل بئر من الخلايا permeabilized، واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في فرن 37 درجة مئوية. استبدال حل ما قبل التهجين مع ما يقرب من 30 ميكرولترات من حل التهجين التحقيق في بئر.وتغطي الغرفة مع رقائق الألومنيوم لمدة ساعتين حضانة في الفرن 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة استخدام ماصة متعددة القنوات لشطف الآبار ثلاث إلى خمس مرات مع 30 ميكرولترات من محلول الغسيل في كل غسل جيد. بعد الغسيل الأخير، احتضان الخلايا لمدة 15 إلى 30 دقيقة في 37 درجة مئوية قبل غسل الآبار خمس مرات مع 30 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني DEPC الطازجة في الغسيل.بعد الغسيل الأخير، استلهمي كل السائل من زلة الغطاء. وإضافة أربعة microliters من برنامج تلفزيوني DEPC الطازجة إلى كل بئر. استخدام ملقط لوضع بعناية زلة الغطاء على شريحة الزجاج معقمة الإيثانول عينة الجانب أسفل، واستخدام صمغ الأسنان السيليكون لختم حواف زلة الغطاء.لتحديد موقع منطقة ذات أهمية حدد الوضع المباشر للتصوير على النقيض من المرحلة والمناورة في عصا التحكم في المرحلة لتغيير مجال الرؤية داخل بئر. تقع منطقة فيها كثافة الخلية الأمثل وضبط Z التركيز بحيث صور الخلية النقيض المرحلة في التركيز. ثم الحصول على صورة C خمسة مع التعرض أربع ثوان، وصورة C ثلاثة مع التعرض الثانية والثانية وصورة النقيض من المرحلة مع التعرض 0.2 ثانية لحوالي 10 مناطق مختلفة في البئر.بدلاً من ذلك، يمكن تشغيل عملية استحواذ على NDI يتم فيها الحصول على صور C5 و C three ومرحلة التباين في سلسلة. عندما تم تصوير كافة الآبار، افتح أداة تجزئة الخلايا المناسبة، وunlick المكدس. تحميل الصور على النقيض من المرحلة من الفائدة وتحديد إطارات مستقلة وانقر فوق حساب المرحلة لمحة صفر.لبدء عملية التقسيم التي سيتم خلالها تحديد الخلايا وحساب معالمها. قم بتحميل المعلمات المتوفرة في مجلد GitHub وانقر فوق كافة الإطارات. في نهاية معالجة حدد كفاف لتصور شبكة.المقبل، تحت علامة التبويب الكشف عن البقعة، إلغاء اغزل المكدس، والتحقق من الشبكات وانقر فرك لبدء تحديد بقعة وتحديد كم استنادا إلى اثنين من تركيب د غاوسي. حدد المجلد الذي يحتوي على الصور الفلورسنت وملف الشبكة الذي تم حسابه من إجراء الكشف عن الخلايا فقط، ثم قم بالإشارة إلى اسم الملف الذي سيتم حفظ نتائج الكشف عن البقعة إليه. ثم استخدم سير عمل تحليل الصور المتوفر على GitHub لتحليل الصور المفلورة.في هذا المجال الكامل للعرض يمكن ملاحظة حوالي 500 خلية الإشريكية القولونية بكثافة جيدة لتجزئة الخلايا. يجب أن تظل مورفولوجيا الخلايا في صور التباين المرحلة مماثلة لتلك الخلايا الحية لأغراض تجزئة. إذا كانت الخلايا أكثر من permeabilized، سوف تصبح مورفولوجيا غير مناسبة للتجزئة.توزيع كثافة بقعة الز مرنا لاك قبل التعريفي لا يتناسب بشكل جيد مع توزيع عادي أو بواسون بسبب وجود بقع مع كثافة عالية. عندما يتم حث التعبير عن Z لاك يزيد إشارة من خمسة رئيس لاك Z مرنا قبل ثلاثة رئيس لاك Z مرنا زيادة إشارة. إذا تم قمع التعبير عن ز لاك على حد سواء خمسة وثلاثة رئيس لاك Z مرنا إشارات انخفاض.للحصول على معدل استطالة النسخ ، فإن ارتفاع الإشارات الخمس وثلاثة إشارات رئيسية يتناسب مع الخطوط. بينما يتم الحصول على معدل تحلل مرنا عن طريق تركيب منطقة الاضمحلال مع وظيفة أسية. لأن سمكة جزيء واحد هو تقنية خلية واحدة، يمكن أيضا تحليل الخلية إلى الخلية variabilities في النسخ.وبالإضافة إلى ذلك، فإن تحليل التحلل من خمسة رئيس وثلاثة رئيس لاك Z مرنا يسمح لكثافة البوليمرات RNA على الجين Z لاك يمكن تحديدها كميا. كما يتم التعامل مع عينات من نقاط زمنية مختلفة في وقت واحد خلال هذا الإجراء. من المهم أن تبقى العينة منفصلة أثناء وجودهم في الأنابيب وعلى زلة الغطاء.باستخدام هذا جزيء واحد تقنية المجهر الخلية واحدة. يمكن للباحثين الآن استكشاف كيفية النسخ وتحرّر حركية التحلل مرنا ترتبط الأرقام المطلقة أو المواقع دون الخلوية من mRNAs.

Research

JoVE Journal

Biology

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

مضان في الموقع التهجين (FISH) البروتوكول في الحيوانات المنوية البشرية

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

جبل به الجامعة في الموقع تهجين ارتباط البيولوجيا الجزيئية والعضوي

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

قياس حركية النسخ مرنا في الخلايا الحية واحدة

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

الكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي بواسطة الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم<em&gt; في المختبر</em&gt; لتحديد المواقع وقفة بالحركة على طول مرنا

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

رسم خرائط الشبكات الوظيفية البكتيرية والممرات في<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المصفوفات الوراثية الاصطناعية

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

طريقة بسيطة لDNA الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين لسحق الكروموسومات

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

فوائد متعددة الأوجه من البروتين المشارك في التعبير<em&gt; الإشريكية القولونية</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...