Name: probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2020-07-30T13:30:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Denne protokol blev udviklet af S.K. under hendes postdoc forskning i Dr. Christine Jacobs-Wagners laboratorium på Howard Hughes Medical Institute og Microbial Sciences Institute på Yale University. Vi takker Dr. Jacobs-Wagner og hendes lab medlemmer for forskellige input i løbet af metoden udvikling og Laura Troyer for kritisk læsning af manuskriptet. S.K. anerkender støtte fra Searle Scholars-programmet; K.V. anerkender støtte fra James Scholar Preble Research Award fra University of Illinois.

<ol>
	<li>Bervoets, I., Charlier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity,+versatility+and+complexity+of+bacterial+gene+regulation+mechanisms:+opportunities+and+drawbacks+for+applications+in+synthetic+biology.">Diversity, versatility and complexity of bacterial gene regulation mechanisms: opportunities and drawbacks for applications in synthetic biology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 304-339 (2019).</li><li>Epshtein, V., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+RNA+polymerase+molecules+in+transcription+elongation.">Cooperation between RNA polymerase molecules in transcription elongation.</a> Science. 300 (5620), 801-805 (2003).</li><li>Vogel, U., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+chain+elongation+rate+in+Escherichia+coli+depends+on+the+growth+rate.">The RNA chain elongation rate in Escherichia coli depends on the growth rate.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 2807-2813 (1994).</li><li>Tennyson, C. N., Klamut, H. J., Worton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+dystrophin+gene+requires+16+hours+to+be+transcribed+and+is+cotranscriptionally+spliced.">The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is cotranscriptionally spliced.</a> Nature Genetics. 9, 184 (1995).</li><li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes.">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 16, 1128 (2009).</li><li>Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+RNA+Half-Life+Analysis+in+Escherichia+coli+Reveals+Positional+Patterns+of+Transcript+Degradation.">Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation.</a> Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).</li><li>Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. -. H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+decay+and+abundance+in+Escherichia+coli+at+single-gene+resolution+using+two-color+fluorescent+DNA+microarrays.">Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).</li><li>P&#233;rez-Ort&#237;n, J. E., Medina, D. A., Ch&#225;vez, S., Moreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+do+you+mean+by+transcription+rate.">What do you mean by transcription rate.</a> BioEssays. 35 (12), 1056-1062 (2013).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li><li>Kuchina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+single-cell+RNA+sequencing+by+split-pool+barcoding.">Microbial single-cell RNA sequencing by split-pool barcoding.</a> BioRxiv. , 869248 (2019).</li><li>Blattman, S. B., Jiang, W., Oikonomou, P., Tavazoie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotic+single-cell+RNA+sequencing+by+in+situ+combinatorial+indexing.">Prokaryotic single-cell RNA sequencing by in situ combinatorial indexing.</a> Nature Microbiology. , (2020).</li><li>Femino, A., Fay, F., Fogarty, K., Singer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Montero Llopis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+flow+of+genetic+information+in+bacteria.">Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria.</a> Nature. 466 (7302), 77-81 (2010).</li><li>So, L. -. h., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+properties+of+transcriptional+time+series+in+Escherichia+coli.">General properties of transcriptional time series in Escherichia coli.</a> Nature Genetics. 43 (6), 554-560 (2011).</li><li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells.">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li><li>Jones, D. L., Brewster, R. C., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+architecture+dictates+cell-to-cell+variability+in+gene+expression.">Promoter architecture dictates cell-to-cell variability in gene expression.</a> Science. 346 (6216), 1533-1536 (2014).</li><li>Iyer, S., Park, B. R., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantitative+measurement+of+transcriptional+kinetic+parameters+in+vivo.">Absolute quantitative measurement of transcriptional kinetic parameters in vivo.</a> Nucleic Acids Research. 44 (18), 142 (2016).</li><li>Kim, S., Beltran, B., Irnov, I., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Distance+Cooperative+and+Antagonistic+RNA+Polymerase+Dynamics+via+DNA+Supercoiling.">Long-Distance Cooperative and Antagonistic RNA Polymerase Dynamics via DNA Supercoiling.</a> Cell. 179 (1), 106-119 (2019).</li><li>Wang, M., Zhang, J., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+transcription+at+a+single+gene+copy+reveals+hidden+drivers+of+bacterial+individuality.">Measuring transcription at a single gene copy reveals hidden drivers of bacterial individuality.</a> Nature Microbiology. 4 (12), 2118-2127 (2019).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Labeling DNA (or RNA) for single-molecule FRET. 2012 (9), 1005-1008 (2012).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Ethanol Precipitation of DNA in Microcentrifuge Tubes. 2006 (1), 4456 (2006).</li><li>Skinner, S. O., Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization.">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li><li>Adesnik, M., Levinthal, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+and+degradation+of+lactose+operon+messenger+RNA+in+E.+coli.">The synthesis and degradation of lactose operon messenger RNA in E. coli.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 35, 451-459 (1970).</li><li>Campbell, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+for+rifampicin+inhibition+of+bacterial+RNA+polymerase.">Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase.</a> Cell. 104 (6), 901-912 (2001).</li><li>Raj, A., Tyagi, S., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 472, 365-386 (2010).</li><li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics.">High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Molecular Microbiology. 80 (3), 612-627 (2011).</li><li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oufti:+an+integrated+software+package+for+high-accuracy,+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis.">Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Molecular Microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).</li><li>Moffitt, J. R., Zhuang, X., Filonov, G. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).</li><li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+gene+expression+in+live+cells,+one+protein+molecule+at+a+time.">Probing gene expression in live cells, one protein molecule at a time.</a> Science. 311 (5767), 1600-1603 (2006).</li><li>Chen, H., Shiroguchi, K., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+study+of+mRNA+degradation+and+transcript+elongation+in+Escherichia+coli.">Genome-wide study of mRNA degradation and transcript elongation in Escherichia coli.</a> Molecular Systems Biology. 11 (1), 781 (2015).</li><li>Vogel, U., S&#248;rensen, M., Pedersen, S., Jensen, K. F., Kilstrup, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreasing+transcription+elongation+rate+in+Escherichia+Coli+exposed+to+amino+acid+starvation.">Decreasing transcription elongation rate in Escherichia Coli exposed to amino acid starvation.</a> Molecular Microbiology. 6 (15), 2191-2200 (1992).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+and+translation+contribute+to+gene+locus+relocation+to+the+nucleoid+periphery+in+E.+coli.">Transcription and translation contribute to gene locus relocation to the nucleoid periphery in E. coli.</a> Nature Communications. 10 (1), 5131 (2019).</li><li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast.">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li><li>Fontenete, S., Guimar&#227;es, N., Wengel, J., Azevedo, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+melting+temperatures+in+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+procedures+using+thermodynamic+models.">Prediction of melting temperatures in fluorescence in situ hybridization (FISH) procedures using thermodynamic models.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 36 (3), 566-577 (2016).</li><li>Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Zhang, J., Wang, M., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+gene+regulation+in+individual+cells+reveals+rapid+switching+between+promoter+states.">Measurement of gene regulation in individual cells reveals rapid switching between promoter states.</a> Science. 351 (6278), 1218-1222 (2016).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+shapes+the+turnover+of+a+bacterial+transcriptome.">Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome.</a> eLife. 5, 13065 (2016).</li><li>Fei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+in+vivo+target+search+kinetics+of+regulatory+noncoding+RNA.">Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA.</a> Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Her præsenterede vi en smFISH protokol til måling af mRNA kinetik i E. coli. I de tidligere offentliggjorte smFISH protokoller for bakterier23, celler blev holdt i rørene indtil slutningen af protokollen, det vil sige indtil de er klar til billeddannelse. Selv om det har mange fordele, såsom minimal uspecifikke binding af fluorescerende sonder på coverslip overflade23,er det vanskeligt at følge disse protokoller, når der er mange prøver fra en tid-kursus eksperiment. For det første skal der udtages prøver af en forholdsvis stor mængde celler (>1 ml) og endda høstes før fiksering. For det andet skal celleprøverne centrifugeres flere gange for at udveksle opløsninger og vaske efter hybridiseringstrinnet. I vores protokol blandes en lille mængde (<1 ml) af kultur direkte med en fastgørelsesløsning i et 1,5 ml rør, hvilket hjælper med hurtigt at "fryse" celletilstanden på prøvetagningstidspunktet. Cellerne forbliver også fastgjort til overfladen under hele proceduren, og forskellige løsninger kan hurtigt udskiftes ved at indsugning af væsker med et vakuumfiltreringssystem og anvende opløsningsfald på én gang med en multikanalpipette. Denne forskel gør vores protokol meget fordelagtig, når et stort antal prøver skal behandles på én gang. Ved hjælp af vores protokol, 12-48 prøver kan håndteres samtidigt, og hele FISH procedure kan afsluttes inden for ~ 8 timer, omkring en lignende mængde tid, der er nødvendig for et par prøver (Figur 2). Selv om vi brugte udtrykket lacZ i E. coli som et eksempel, protokollen er bredt anvendelig på forskellige gener og bakteriearter med overvejelser diskuteret nedenfor.
For forskellige gener, den første ting at overveje, er smFISH sonder. Man kan designe oligonucleotid sonder, flise mRNA af interesse (Figur 1A)13. I denne "flisebelægning" sonde tilgang, hver sonde er ~ 20 base lang og mærket med en fluorophore på 5 'eller 3' terminus. Denne strategi er praktisk, da ingen genetisk manipulation er nødvendig. Alternativt kan en tandem gentagelse af ~ 20 bp sekvens, fremmed for den genomiske sekvens (f.eks en vifte af lacO sekvens i Caulobacter crescentus14), indsættes i den uoversatte region af et gen af interesse og en enkelt sonde supplerer den gentagne enhed bruges til at mærke mRNA ("array" tilgang; Figur 1B). I begge tilfælde dekorerer flere fluorophores et mRNA, hvilket giver forstærket fluorescenssignal, der let kan skelnes fra en enkelt sonde, der er uspecifikke bundet inde i en celle.
Om der skal vælges "fliselægning" eller "array"-tilgange, afhænger af den negative kontrol, en prøve, hvor uspecifikke bindinger af sonder testes, fordi den mangler målet mRNA. For flisebelægningssonder (figur 1A) kan en mutant stamme uden genet af interesse eller en tilstand, hvor genet ikke transskriberes (f.eks. undertrykkelse af lacZ) tjene som en negativ kontrol til test af uspecifik binding af sonder. For array-baserede smFISH(Figur 1B), en wild-type stamme mangler array kan tjene som en negativ kontrol, fordi det ikke indeholder bindende steder for sonder.
Optimale hybridiseringsforhold kan afhænge af sondesekvenserne og endda valget af fluorophorefarvestoffer. Vi optimerede hybridiseringsbetingelsen for lacZ-sondesæt ved at holde hybridiseringstemperaturen på 37 °C og teste forskellige koncentrationer af sondesæt og formamid i hybridiseringsløsningen. Højere koncentrationer af formamid har tendens til at reducere både uspecifikke og specifikkebindinger 26,35. Vi anbefaler systematisk at ændre hybridiseringen og dens vaskeforhold, samtidig med at hybridiseringstid og temperatur bevares på samme måde. Efterhånden som betingelsen bliver strengere, falder både det uspecifikke og det specifikke bindende fald (figur 6). Det er vigtigt at finde et punkt, hvor den uspecifikke binding begynder at ramme under en acceptabel tærskel uden yderligere at gå på kompromis med den specifikke binding. For eksempel brugte vi det signalniveau, der blev opnået uden sonder ("ingen sonder") som en tærskel (figur 6).
Den tofarvede smFISH-metode, der mærker to separate regioner i et mRNA, er begrænset til lange gener. For at måle transskriptionshastigheden, benyttede vi os af det faktum, at lacZ er lang (3075 bp) og dens udtryk kan induceres af IPTG. Når et gen er kort, er det vanskeligt at designe to fliselæggende sondesæt (nær 5' og 3' ender) og løse tidsforsinkelsen mellem optrædener af 5' vs. 3' mRNA-områder. I dette tilfælde kan man tælle spirende mRNAs på steady state ved smFISH og analysere deres fordeling med en analytisk model, der har hastigheden af transskription forlængelse som en passende parameter20. Når et af interesse genet ikke er inducerende, kan man også behandle celler med rifampicin ved tid nul og måle den tidsmæssige ændring i 5' og 3' mRNA-underområder. Forsinkelsen fra faldet på 5' mRNA-signal til 3' mRNA-signalet kan derefter bruges til at beregne transskriptionshastigheden som tidligere31.
Endelig er smFISH-protokollen alsidig og kan kombineres med andre mærkningsordninger. Tidligere blev DNA locus visualiseret sammen med mRNA'er ved at kombinere mRNA FISH med enten DNA FISH14 eller fluorescerende reporter-operatør system20. Proteinprodukter kan visualiseres ved at udføre immunfluorescens sammen med mRNA FISH14,36. Det kan også kombineres med tre-dimensionelle super-opløsning mikroskopi37 til at visualisere mRNA'er i alle tredimensioner 38,39.

Strømmen af genetiske oplysninger fra DNA til mRNA og protein er en af de mest grundlæggende cellulære processer, hvis regulering er vigtig for cellulære fitness1. Antallet af mRNA'er i en celle bestemmes af to dynamiske processer, transskription og mRNA-nedbrydning. Men hvordan transskription og mRNA nedbrydning er reguleret i tid og rum af en enkelt celle forbliver ikke helt forstået, hovedsagelig på grund af manglen på eksperimentelle metoder til kvantitativt at måle deres kinetik in vivo.
Metoder baseret på total mRNA'er, der er udvundet fra en population af celler, såsom Northern blot, RT-PCR, RNA-sekvensering og genekspressionsmikroarrays, kan måle den relative forskel i mRNA-niveauer og er blevet anvendt i vid udstrækning til at analysere transskriptionshastigheden2,,3,,4,,5 eller hastigheden af mRNA-nedbrydning6,7. Men de giver ikke det absolutte antal mRNAs per celle, og dermed, de er ikke egnet til sondering af hastigheden af transskriptionindledning 8. Også, fordi mRNA'er er udvundet fra en population af celler, kan den rumlige fordeling af mRNA'er inden for en enkelt celle og variabiliteten af mRNA-kopinumre blandt cellerne ikke måles.
Næste generations RNA-sekvensering på individuelle celler (scRNAseq) kan kvantificere antallet af mRNA'er pr. celle i en genomisk skala9. Det er dog stadig vanskeligt at bruge denne teknik til at måle transskription kinetik, på grund af udfordringer med prøve forberedelse og høje omkostninger. Især har anvendelsen af scRNAseq på bakterier været teknisk vanskelig på grund af lav mRNA overflod10,11.
Enkeltmolekyle fluorescens in situ hybridisering (smFISH) er baseret på hybridisering af fluorescerende-mærkede enkeltstrengede sonder, hvis sekvenser supplerer målet mRNA af interesse12,13. Begrebet sekvens-specifik hybridisering svarer til den, der anvendes i Northern blot eller RT-PCR, men hybridisering sker in situ inden for faste celler, for at bevare den oprindelige lokalisering af mRNA'er. Signalet fra en enkelt mRNA forstærkes ved hjælp af mange sonder, ~ 20 nukleotider (nt) i længden, hybridisering til forskellige dele af et mRNA (Figur 1A)13. I denne "flisebelægning" sonde tilgang, antallet af sonder er nødvendige for at opdage en enkelt mRNA sætter en lavere grænse for længden af mRNA, der kan analyseres. Alternativt kan mRNA af interesse transskriptionelt smeltet til en ikke-kodning vifte af tandem Lac operatør sekvenser, således at flere kopier af en fluorescerende mærket lacO sonde hybridisere til en enkelt mRNA (Figur 1B)14.
smFISH er blevet brugt til at kvantificere antallet af mRNAs pr. celle i stabil tilstand (dvs. når syntese og henfald er i balance) og til at analysere middelværdi og variabilitet af mRNAs blandt bakterieceller15,16,17. For nylig er smFISH blevet anvendt til at kvantificere mRNA-numre i ikke-stabil tilstand, lige efter induktion eller undertrykkelse af genekspression i E. coli18,19,20. De tidsmæssige ændringer i de absolutte mRNA-kopinumre blev derefter brugt til at beregne hastigheden af transskriptionsiniering, forlængelse og afslutning samt hastigheden af mRNA-nedbrydning. Til denne ansøgning kan konventionelle smFISH-procedurer være besværlige, fordi der er mange prøver, der hver repræsenterer et tidspunkt, der skal gennemgå flere bufferudvekslingstrin (dvs. centrifugering og vask). Her beskriver vi en smFISH-protokol, hvor prøvehåndteringstrinnene forenkles dramatisk ved at få cellerne til at holde sig til overfladen af en dækslæd og ved at aspirere væsker med et vakuumfiltreringssystem14,19. Ved hjælp lacZ af lacZ-ekspressionen i E. coli som eksempel demonstreres den fulde arbejdsgang (Figur 2), herunder billedanalyse (Figur 3), der giver in vivo kinetik af transskription (indledning, forlængelse og afslutning) og mRNA-nedbrydning, celle-til-celle-variabilitet i mRNA-ekspression og mRNA-lokalisering. Vi forventer, at protokollen er bredt anvendelig til sonde in vivo kinetik og lokalisering af andre mRNAs i forskellige bakteriearter.

probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization

Single-molekyle fluorescens in situ hybridisering (smFISH) giver mulighed for at tælle det absolutte antal mRNA'er i de enkelte celler. Her beskriver vi en anvendelse af smFISH til at måle satserne for transskription og mRNA nedbrydning i Escherichia coli. Da smFISH er baseret på faste celler, udfører vi smFISH på flere tidspunkter i løbet af et tidsforløbseksperiment, dvs. På hvert tidspunkt skelnes subregioner af et mRNA spectrally til sondetransskriptionsforseelse og for tidlig afslutning. Resultatet af denne protokol giver også mulighed for at analysere intracellulær lokalisering af mRNAs og heterogenitet i mRNA-kopinumre blandt celler. Ved hjælp af denne protokol mange prøver (~ 50) kan behandles inden for 8 timer, ligesom den tid, der er nødvendig for blot et par prøver. Vi diskuterer, hvordan man anvender denne protokol til at studere transskription og nedbrydning kinetik af forskellige mRNAs i bakterieceller.

Watch this Scientific Journal Video about Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Denne protokol beskriver en anvendelse af enkelt-molekyle fluorescens in situ hybridisering (smFISH) til at måle in vivo kinetik af mRNA syntese og nedbrydning.

Sondering mRNA kinetik i rum og tid i Escherichia coli ved hjælp af to-color single-molecule fluorescens In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

smFISH er kendt for at måle det absolutte antal som sub cellular placering af mRNAs. Vores to farve sMFISH protokol har den ekstra evne til at måle kinetik af transskription og mRNA nedbrydning. Ved hjælp af denne metode kan mange prøver behandles samtidigt uden ekstra tid eller kræfter.For eksempel kan fire tidskursuseksperimenter, der giver 48 prøver, behandles til billedbehandling på otte timer. Vores protokol er bredt anvendelig for mange gener og bakteriearter. For at forberede dækselssedler og glasdias til eksperimentet.Brug anslag til at placere dække glider og dias i en Coplin krukke, der indeholder 100% ethanol og placere krukken i et vandbad ultralyd tage højde for 15 til 20 minutter. I slutningen af sonikeringen vaskes rutsjebanerne og dækslet glider tre til fire gange med ultra rent vand, før du fylder krukken op med 70% ethanol og gentager sonikeringen. Når alle sonikeringstrinene er udført, skal dækslet tørres og glider med nitrogengas.Læg dækslet i en tom 1000 mikroliterpipettespidsboks, og placer diasene i en ren slideboks. Derefter, efter hullerne i pipette spidsen boks bruge en hydrofobe markør til at tegne cirkler på dækslet glider og anvende en 20 mikroliter dråbe på 0,1% Poly l lysin til hver af disse brønde. For at oprette et tidskursuseksperiment skal du tilføje 750 mikroliter fra en 20 milliliter eksponentielt voksende E.coli-kultur til en 1,5 milliliterkulturrør markeret tids nul.Og straks vende røret. Inducer lac Z udtryk med 0,2 til en millimolar IPTG og start en timer. Efter at have kontrolleret timeren, indsamle cellekultur på hvert på hinanden følgende eksperimentelle tidspunkt som netop påvist.På det rette tidspunkt under forsøget tilsættes fem millimolar ONPF til kolben for at undertrykke lac Z-udtrykket og fortsætte med at udtage prøver af kulturerne for at spore mRNA-nedbrydningen. Ved afslutningen af prøveemnet ved kursets prøve inkuberes prøverne ved stuetemperatur i 15 minutter efterfulgt af inkubation på is i 30 minutter. Ved slutningen af inkubationen centrifuge prøverne til at fjerne fiksativ og bruge en pipette til at fjerne supernatant.Re-suspendere bakterier i en milliliter DEPC PBS og vaske cellerne to gange mere i en milliliter frisk DEPC PBS per vask. Efter den sidste vask skal cellerne igen suspenderes i 30 mikroliter af frisk DEPC PBS. Til permeabilisering af cellerne.Først tilsættes prøven fra hvert tidspunkt punkt til de enkelte hydrofobe brønde på en af ethanol steriliserede glas dække glider. Og lad cellerne holde sig til dækslet slip med en 10 til 30 minutters inkubation ved stuetemperatur. Ved slutningen af inkubationen tilsættes 15 mikroliter på 70% ethanol til hver brønd.Efter fire minutter, aspirere ethanol fra hver brønd, så brøndene er helt tørre. Efter vask tilføje 30 mikroliter af pre hybridisering løsning til hver brønd af permeabilized celler, og inkubere cellerne i 30 minutter i en 37 grader Celsius ovn. Udskift for hybridiseringsløsningen med ca. 30 mikroliter sondehybribiliseringsløsning pr. brønd.Og dække kammeret med aluminiumsfolie til en to timers inkubation i 37 grader Celsius ovn. Ved slutningen af inkubationen skal du bruge en multikanalpipette til at skylle brøndene tre til fem gange med 30 mikroliter vaskeopløsning pr. brønd pr. vask. Efter den sidste vask inkuberes cellerne i 15 til 30 minutter ved 37 grader Celsius, før brøndene vaskes fem gange med 30 mikroliter frisk DEPC PBS pr. vask.Efter den sidste vask aspirere al væsken fra dækslet. Og tilføje fire mikroliter af frisk DEPC PBS til hver brønd. Brug anslag til omhyggeligt at placere dækslet på en ethanol steriliseret glasdias prøve side ned, og brug silikone tandkød til at forsegle kanterne af dækslet slip.For at finde et område af interesse skal du vælge live form for fase kontrast billeddannelse og manøvrere scenen joystick at ændre synsfeltet i en brønd. Beliggende et område, hvor celletætheden er optimal, og juster Z-fokuset, så fasekontrastcellebillederne er i fokus. Derefter erhverve en C fem billede med en fire sekunders eksponering, en C tre billede med en to-sekunders eksponering og en fase kontrast billede med en 0,2 sekunder eksponering for ca 10 forskellige områder pr brønd.Alternativt kan der køres et NDI-opkøb, hvor C5,C tre og fasekontrastbilleder erhverves i serie. Når alle brøndene er afbildet, skal du åbne et passende cellesegmenteringsværktøj og fjerne klikstakken. Indlæs de af interessebilleder af fasekontrast, og vælg uafhængige rammer, og klik på beregningsfaseprofil som nul.For at starte segmenteringsprocessen, hvor cellerne vil blive identificeret, og deres konturer vil blive beregnet. Indlæs de parametre, der er angivet i Mappen GitHub, og klik på alle rammer. I slutningen af behandlingen skal du vælge kontur for at visualisere masken.Dernæst skal du fjerne markeringen i stakken under fanen spotdetektering, kontrollere masker og klikke på Gnid for at starte spotidentifikationen og kvantificeringen baseret på de to D Gaussiske tilpasninger. Vælg den mappe, der indeholder fluorescerende billeder og den maskefil, der netop er beregnet ud fra celleregistreringsproceduren, og angiv det filnavn, som resultaterne af spotregistreringen gemmes på. Brug derefter arbejdsgangen for billedanalyse på GitHub til at analysere fluorescensbillederne.I dette fulde synsfelt kan der observeres ca. 500 E.coli-celler med en god tæthed for cellesegmentering. Cellernes morfologi i fasekontrastbillederne bør forblive sammenlignelig med levende cellers til segmenteringsformål. Hvis cellerne er over permeabilized, deres morfologi vil blive uegnet til segmentering.Fordelingen af lac Z mRNA spotintensiteter før induktion passer ikke godt sammen med en normal eller Poisson-fordeling på grund af tilstedeværelsen af pletter med høje intensiteter. Når der induceres pression af lac Z, øges signalet fra fem prime lac Z mRNA, før det tre primære lac Z mRNA-signal øges. Hvis udtrykket af lac Z undertrykkes, mindskes både de fem og tre prime lac Z mRNA-signaler.For at opnå hastigheden af transskription forlængelse, stigningen af de fem og tre primære signaler er egnet med linjer. Mens hastigheden af mRNA nedbrydning opnås ved at montere henfaldsregionen med en eksponentiel funktion. Fordi enkelt molekyle fisk er en enkelt celle teknik, celle til celle varia evner i transskription kan også analyseres.Desuden gør analysen af kolokaleringen af fem prime og tre prime lac Z mRNA det muligt at kvantificere tætheden af RNA-polymeraserne på lac Z-genet. Som prøver fra forskellige tidspunkter håndteres samtidigt under denne procedure. Det er vigtigt at holde prøven adskilt, mens de er i rørene og på dækslet slip.Ved hjælp af denne enkelt molekyle enkelt celle mikroskopi teknik. Forskere kan nu undersøge, hvordan transskription og mRNA nedbrydning kinetik er relateret til de absolutte tal eller subcellulære placeringer af mRNA'er.

Research

JoVE Journal

Biology

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Påvisning af viralt RNA ved fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering af ribo Bundet Gryende polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; Til at identificere Translationelle Pause steder langs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Kortlægning Bakterielle Funktionelle Networks og spredningsveje i<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Hjælp Syntetiske Genetiske Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering og analyse af mRNA molekyler under anvendelse Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Enkle metode til fluorescens DNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering til mast kromosomer

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Den mangesidede Fordele ved Protein Co-ekspression i<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...