Name: probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2020-07-30T13:30:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Dit protocol werd ontwikkeld door S.K. tijdens haar postdoctoraal onderzoek in dr. Christine Jacobs-Wagner's laboratorium aan het Howard Hughes Medical Institute en het Microbial Sciences Institute aan de Yale University. Wij danken Dr Jacobs-Wagner en haar lableden voor verschillende input tijdens de methodeontwikkeling en Laura Troyer voor het kritisch lezen van het manuscript. S.K. erkent steun van het Searle Scholars Program; K.V. erkent de steun van James Scholar Preble Research Award van de Universiteit van Illinois.

<ol>
	<li>Bervoets, I., Charlier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity,+versatility+and+complexity+of+bacterial+gene+regulation+mechanisms:+opportunities+and+drawbacks+for+applications+in+synthetic+biology.">Diversity, versatility and complexity of bacterial gene regulation mechanisms: opportunities and drawbacks for applications in synthetic biology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 304-339 (2019).</li><li>Epshtein, V., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+RNA+polymerase+molecules+in+transcription+elongation.">Cooperation between RNA polymerase molecules in transcription elongation.</a> Science. 300 (5620), 801-805 (2003).</li><li>Vogel, U., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+chain+elongation+rate+in+Escherichia+coli+depends+on+the+growth+rate.">The RNA chain elongation rate in Escherichia coli depends on the growth rate.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 2807-2813 (1994).</li><li>Tennyson, C. N., Klamut, H. J., Worton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+dystrophin+gene+requires+16+hours+to+be+transcribed+and+is+cotranscriptionally+spliced.">The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is cotranscriptionally spliced.</a> Nature Genetics. 9, 184 (1995).</li><li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes.">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 16, 1128 (2009).</li><li>Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+RNA+Half-Life+Analysis+in+Escherichia+coli+Reveals+Positional+Patterns+of+Transcript+Degradation.">Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation.</a> Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).</li><li>Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. -. H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+decay+and+abundance+in+Escherichia+coli+at+single-gene+resolution+using+two-color+fluorescent+DNA+microarrays.">Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).</li><li>P&#233;rez-Ort&#237;n, J. E., Medina, D. A., Ch&#225;vez, S., Moreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+do+you+mean+by+transcription+rate.">What do you mean by transcription rate.</a> BioEssays. 35 (12), 1056-1062 (2013).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li><li>Kuchina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+single-cell+RNA+sequencing+by+split-pool+barcoding.">Microbial single-cell RNA sequencing by split-pool barcoding.</a> BioRxiv. , 869248 (2019).</li><li>Blattman, S. B., Jiang, W., Oikonomou, P., Tavazoie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotic+single-cell+RNA+sequencing+by+in+situ+combinatorial+indexing.">Prokaryotic single-cell RNA sequencing by in situ combinatorial indexing.</a> Nature Microbiology. , (2020).</li><li>Femino, A., Fay, F., Fogarty, K., Singer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Montero Llopis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+flow+of+genetic+information+in+bacteria.">Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria.</a> Nature. 466 (7302), 77-81 (2010).</li><li>So, L. -. h., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+properties+of+transcriptional+time+series+in+Escherichia+coli.">General properties of transcriptional time series in Escherichia coli.</a> Nature Genetics. 43 (6), 554-560 (2011).</li><li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells.">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li><li>Jones, D. L., Brewster, R. C., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+architecture+dictates+cell-to-cell+variability+in+gene+expression.">Promoter architecture dictates cell-to-cell variability in gene expression.</a> Science. 346 (6216), 1533-1536 (2014).</li><li>Iyer, S., Park, B. R., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantitative+measurement+of+transcriptional+kinetic+parameters+in+vivo.">Absolute quantitative measurement of transcriptional kinetic parameters in vivo.</a> Nucleic Acids Research. 44 (18), 142 (2016).</li><li>Kim, S., Beltran, B., Irnov, I., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Distance+Cooperative+and+Antagonistic+RNA+Polymerase+Dynamics+via+DNA+Supercoiling.">Long-Distance Cooperative and Antagonistic RNA Polymerase Dynamics via DNA Supercoiling.</a> Cell. 179 (1), 106-119 (2019).</li><li>Wang, M., Zhang, J., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+transcription+at+a+single+gene+copy+reveals+hidden+drivers+of+bacterial+individuality.">Measuring transcription at a single gene copy reveals hidden drivers of bacterial individuality.</a> Nature Microbiology. 4 (12), 2118-2127 (2019).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Labeling DNA (or RNA) for single-molecule FRET. 2012 (9), 1005-1008 (2012).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Ethanol Precipitation of DNA in Microcentrifuge Tubes. 2006 (1), 4456 (2006).</li><li>Skinner, S. O., Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization.">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li><li>Adesnik, M., Levinthal, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+and+degradation+of+lactose+operon+messenger+RNA+in+E.+coli.">The synthesis and degradation of lactose operon messenger RNA in E. coli.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 35, 451-459 (1970).</li><li>Campbell, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+for+rifampicin+inhibition+of+bacterial+RNA+polymerase.">Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase.</a> Cell. 104 (6), 901-912 (2001).</li><li>Raj, A., Tyagi, S., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 472, 365-386 (2010).</li><li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics.">High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Molecular Microbiology. 80 (3), 612-627 (2011).</li><li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oufti:+an+integrated+software+package+for+high-accuracy,+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis.">Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Molecular Microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).</li><li>Moffitt, J. R., Zhuang, X., Filonov, G. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).</li><li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+gene+expression+in+live+cells,+one+protein+molecule+at+a+time.">Probing gene expression in live cells, one protein molecule at a time.</a> Science. 311 (5767), 1600-1603 (2006).</li><li>Chen, H., Shiroguchi, K., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+study+of+mRNA+degradation+and+transcript+elongation+in+Escherichia+coli.">Genome-wide study of mRNA degradation and transcript elongation in Escherichia coli.</a> Molecular Systems Biology. 11 (1), 781 (2015).</li><li>Vogel, U., S&#248;rensen, M., Pedersen, S., Jensen, K. F., Kilstrup, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreasing+transcription+elongation+rate+in+Escherichia+Coli+exposed+to+amino+acid+starvation.">Decreasing transcription elongation rate in Escherichia Coli exposed to amino acid starvation.</a> Molecular Microbiology. 6 (15), 2191-2200 (1992).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+and+translation+contribute+to+gene+locus+relocation+to+the+nucleoid+periphery+in+E.+coli.">Transcription and translation contribute to gene locus relocation to the nucleoid periphery in E. coli.</a> Nature Communications. 10 (1), 5131 (2019).</li><li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast.">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li><li>Fontenete, S., Guimar&#227;es, N., Wengel, J., Azevedo, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+melting+temperatures+in+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+procedures+using+thermodynamic+models.">Prediction of melting temperatures in fluorescence in situ hybridization (FISH) procedures using thermodynamic models.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 36 (3), 566-577 (2016).</li><li>Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Zhang, J., Wang, M., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+gene+regulation+in+individual+cells+reveals+rapid+switching+between+promoter+states.">Measurement of gene regulation in individual cells reveals rapid switching between promoter states.</a> Science. 351 (6278), 1218-1222 (2016).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+shapes+the+turnover+of+a+bacterial+transcriptome.">Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome.</a> eLife. 5, 13065 (2016).</li><li>Fei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+in+vivo+target+search+kinetics+of+regulatory+noncoding+RNA.">Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA.</a> Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).</li></ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Hier presenteerden we een smFISH protocol voor het meten van mRNA kinetiek in E. coli. In de eerder gepubliceerde smFISH protocollen voor bacteriën23, cellen werden bewaard in de buizen tot het einde van het protocol, dat wil zeggen totdat ze klaar zijn voor beeldvorming. Hoewel het vele voordelen heeft, zoals minimale niet-specifieke binding van fluorescerende sondes op het coverslip oppervlak23,is het moeilijk om deze protocollen te volgen wanneer er veel monsters zijn van een tijdscursusexperiment. Ten eerste moet een relatief groot volume cellen (>1 mL) worden bemonsterd en zelfs geoogst vóór fixatie. Ten tweede moeten de celmonsters meerdere keren worden gecentrifugeerd om oplossingen uit te wisselen en te wassen na de hybridisatiestap. In ons protocol wordt een klein volume (<1 mL) van cultuur direct gemengd met een bevestigingsoplossing in een 1,5 mL-buis, waardoor de celtoestand op het moment van bemonstering snel wordt "bevroren". Ook blijven cellen tijdens de procedure aan het oppervlak bevestigd en kunnen verschillende oplossingen snel worden uitgewisseld door vloeistoffen te aspireren met een vacuümfiltratiesysteem en het toepassen van oplossingsdruppels in een keer met een multi-channel pipet. Dit verschil maakt ons protocol zeer voordelig wanneer een groot aantal monsters in één keer moet worden verwerkt. Met behulp van ons protocol kunnen 12-48 monsters gelijktijdig worden behandeld en kan de volledige FISH-procedure binnen ~ 8 uur worden voltooid, ongeveer een vergelijkbare hoeveelheid tijd die nodig is voor een paar monsters(figuur 2). Hoewel we de expressie van lacZ in E. coli als voorbeeld gebruikten, is het protocol breed toepasbaar op verschillende genen en bacteriële soorten met overwegingen die hieronder worden besproken.
Voor verschillende genen, het eerste ding om te overwegen is smFISH sondes. Men kan oligonucleotidesondes ontwerpen die het mRNA van belang tegelen (Figuur 1A)13. In deze "tegel" sonde aanpak, elke sonde is ~ 20 basis lang en gelabeld met een fluorofofre op de 5 'of 3 'eindpunt. Deze strategie is handig omdat er geen genetische manipulatie nodig is. Als alternatief kan een tandemrecitie van ~20 bp-sequentie, vreemd lacO aan de genomische sequentie (bijvoorbeeld een array van lacO-sequentie in Caulobacter crescentus14),worden ingevoegd in het onvertaalde gebied van een gen van belang en wordt een enkele sonde die complementair is aan de herhalingseenheid gebruikt om de mRNA -benadering te labelen; Figuur 1B). In beide gevallen versieren meerdere fluoroforen een mRNA, waardoor een versterkt fluorescentiesignaal wordt gegeven dat gemakkelijk kan worden onderscheiden van een enkele sonde die niet specifiek in een cel is gebonden.
Of het nu gaat om "tegel" of "array"-benaderingen, hangt af van de negatieve controle, een monster waarbij niet-specifieke binding van sondes wordt getest omdat het doelmRNA ontbreekt. Voor tegelsondes (figuur 1A), kan een gemuteerde stam zonder het gen van belang of een aandoening, waarbij het gen niet wordt getranscribeerd (bijvoorbeeld onderdrukking van lacZ)dienen als een negatieve controle voor het testen van niet-specifieke binding van sondes. Voor de array-gebaseerde smFISH (Figuur 1B), een wild-type stam ontbreekt de array kan dienen als een negatieve controle, omdat het geen bindende sites voor de sondes bevatten.
Optimale hybridisatie voorwaarden kunnen afhangen van de sonde sequenties en zelfs de keuze van fluorofofre kleurstoffen. We hebben de hybridisatievoorwaarde voor lacZ-sondesets geoptimaliseerd door de hybridisatietemperatuur op 37 °C te houden en verschillende concentraties sondesets en formamide in de hybridisatieoplossing te testen. lacZ Hogere concentraties van formamide hebben de neiging om zowel niet-specifieke als specifieke binding26,35te verminderen . We raden aan om de hybridisatie en de wasomstandigheden systematisch te veranderen terwijl de hybridisatietijd en temperatuur gelijk blijven. Naarmate de voorwaarde strenger wordt, nemen zowel niet-specifieke als specifieke bindingsdaling(figuur 6). Het is belangrijk om een punt te vinden waarop de niet-specifieke binding onder een aanvaardbare drempel begint te komen zonder de specifieke binding verder in gevaar te brengen. We gebruikten bijvoorbeeld het signaalniveau dat zonder sondes ("geen sondes") is verkregen als drempel(figuur 6).
De tweekleurige smFISH-methode die twee afzonderlijke gebieden van een mRNA labelt, is beperkt tot lange genen. Om de snelheid van transcriptieverlenging te meten, hebben we gebruik gemaakt van het feit dat lacZ lang is (3075 bp) en de expressie ervan kan worden veroorzaakt door IPTG. Wanneer een gen kort is, is het moeilijk om twee tegelsondesets te ontwerpen (bijna 5' en 3' uiteinden) en de vertraging tussen verschijningen van 5' versus 3' mRNA-regio's op te lossen. In dit geval kan men ontluikende mRNAs bij steady state tellen door smFISH en hun distributie analyseren met een analytisch model dat de snelheid van transcriptieverlenging heeft als een passende parameter20. Ook wanneer een gen van belang niet onduceerbaar is, kan men cellen met rifampicine op tijd nul behandelen en de temporele verandering in 5' en 3' mRNA sub-gebieden meten. De vertraging van de daling van het 5'mRNA-signaal tot dat van het mRNA-signaal van 3 kan vervolgens worden gebruikt om de snelheid van transcriptieverlenging te berekenen zoals eerder gedaan31.
Ten slotte is het smFISH-protocol veelzijdig en kan het worden gecombineerd met andere etiketteringsschema's. Voorheen werd DNA locus samen met mRNAs gevisualiseerd door mRNA FISH te combineren met DNA FISH14 of fluorescerend reporter-operator systeem20. Eiwitproducten kunnen worden gevisualiseerd door het uitvoeren van immunofluorescentie samen met mRNA FISH14,36. Ook kan het worden gecombineerd met driedimensionale microscopie met superresolutie37 om mRNAs in alle drie de dimensies38,39te visualiseren .

De stroom van genetische informatie van DNA naar mRNA en eiwit is een van de meest fundamentele cellulaire processen, waarvan de regulering belangrijk is voor cellulaire fitness1. Het aantal mRNAs in een cel wordt bepaald door twee dynamische processen, transcriptie en mRNA-afbraak. Echter, hoe transcriptie en mRNA afbraak worden geregeld in de tijd en ruimte van een enkele cel blijft niet volledig begrepen, grotendeels te wijten aan het tekort aan experimentele methoden om kwantitatief te meten hun kinetiek in vivo.
Methoden op basis van de totale mRNAs gewonnen uit een populatie van cellen, zoals Noordelijke vlek, RT-PCR, RNA sequencing, en genexpressie microarrays, kan meten van het relatieve verschil in mRNA niveaus en zijn op grote schaal gebruikt om de snelheid van transcriptie rek2,3,4,5 of de snelheid van mRNA afbraak6,7te analyseren ., Zij bieden echter niet het absolute aantal mRNAs per cel, en daarom zijn ze niet geschikt voor het indringen van de mate van transcriptie-initiatie8. Ook omdat mRNAs worden geëxtraheerd uit een populatie van cellen, kan de ruimtelijke verdeling van mRNAs binnen een enkele cel en de variabiliteit van mRNA-kopienummers tussen cellen niet worden gemeten.
RNA-sequencing van de volgende generatie op individuele cellen (scRNAseq) kan het aantal mRNAs per cel kwantificeren in een genomische schaal9. Het blijft echter moeilijk om deze techniek te gebruiken om transcriptiekinetiek te meten, als gevolg van uitdagingen met monstervoorbereiding en hoge kosten. In het bijzonder is de toepassing van scRNAseq op bacteriën technisch moeilijk geweest als gevolg van een lage mRNA-overvloed10,11.
Single-molecule fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) is gebaseerd op de hybridisatie van fluorescerende enkelstrengse sondes waarvan de sequenties complementair zijn aan het doel mRNA van belang12,13. Het concept van sequentie-specifieke hybridisatie is vergelijkbaar met die gebruikt in Noordelijke vlek of RT-PCR, maar de hybridisatie wordt gedaan in situ binnen vaste cellen, om de native lokalisatie van mRNAs te behouden. Het signaal van een enkele mRNA wordt versterkt met behulp van vele sondes, ~ 20 nucleotiden (nt) in lengte, hybridiseren naar verschillende delen van een mRNA (Figuur 1A)13. In deze "tegel" sonde aanpak, het aantal sondes die nodig zijn om een enkele mRNA detecteren stelt een ondergrens op de lengte van mRNA die kan worden onderzocht. Als alternatief kan het mRNA van belang transcriptie worden gesmolten tot een niet-codering array van tandem Lac operator sequenties, zodanig dat meerdere kopieën van een fluorescerend gelabelde lacO sonde hybridiseren tot een enkele mRNA (Figuur 1B)14.
smFISH is gebruikt om het aantal mRNAs per cel in stabiele toestand te kwantificeren (d.w.z. wanneer synthese en verval in evenwicht zijn) en om de gemiddelde en variabiliteit van mRNAs onder bacteriële cellen15,16,,17te analyseren . Onlangs is smFISH toegepast op het kwantificeren van mRNA-getallen in niet-steady state, direct na inductie of onderdrukking van genexpressie in E. coli18,19,20. De temporele veranderingen in de absolute mRNA-kopienummers werden vervolgens gebruikt om het percentage transcriptieinwijding, verlenging en beëindiging te berekenen, evenals de snelheid van mRNA-degradatie. Voor deze toepassing kunnen conventionele zelfzuchtige procedures omslachtig zijn omdat er veel monsters zijn, die elk een eenmalig punt vertegenwoordigen, die meerdere bufferuitwisselingsstappen moeten doorlopen (d.w.z. centrifugatie en wassen). Hier beschrijven we een smFISH-protocol, waarin de stappen voor de behandeling van het monster drastisch worden vereenvoudigd door cellen aan het oppervlak van een coverslip te laten hechten en door vloeistoffen te aspireren met een vacuümfiltratiesysteem14,19. Met behulp van de expressie van lacZ in E. coli als voorbeeld, wordt de volledige workflow(figuur 2) aangetoond, inclusief beeldanalyse (figuur 3) die de in vivo kinetiek van transcriptie (initiatie, verlenging en beëindiging) en mRNA-afbraak, cel-tot-cel variabiliteit in mRNA-expressie en mRNA-lokalisatie oplevert. We verwachten dat het protocol op grote schaal van toepassing is op sonde in vivo kinetiek en lokalisatie van andere mRNAs in verschillende bacteriesoorten.

probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization

Single-molecule fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) maakt het mogelijk om het absolute aantal mRNAs in individuele cellen te tellen. Hier beschrijven we een toepassing van smFISH om de percentages transcriptie en mRNA-afbraak in Escherichia coli te meten. Omdat smFISH is gebaseerd op vaste cellen, voeren we smFISH uit op meerdere tijdstippen tijdens een tijdscursusexperiment, d.w.z. wanneer cellen gesynchroniseerde veranderingen ondergaan bij inductie of onderdrukking van genexpressie. Op elk moment punt, sub-regio's van een mRNA worden spectrally onderscheiden om transcriptie verlenging en voortijdige beëindiging sonde. Het resultaat van dit protocol maakt het ook mogelijk voor het analyseren van intracellulaire lokalisatie van mRNAs en heterogeniteit in mRNA-kopienummers tussen cellen. Met behulp van dit protocol veel monsters (~ 50) kan worden verwerkt binnen 8 uur, net als de hoeveelheid tijd die nodig is voor slechts een paar monsters. We bespreken hoe dit protocol toe te passen om de transcriptie en afbraak kinetiek van verschillende mRNAs in bacteriële cellen te bestuderen.

Watch this Scientific Journal Video about Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Dit protocol beschrijft een toepassing van fluorescentie met één molecuul in situ hybridisatie (smFISH) om de in vivo kinetiek van mRNA-synthese en -afbraak te meten.

Indringende mRNA Kinetics in ruimte en tijd in Escherichia coli met behulp van Two-Color Single-Molecule Fluorescentie in Situ Hybridisatie

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

smFISH staat bekend om het meten van het absolute aantal als sub cellulaire locatie van mRNAs. Onze twee kleuren sMFISH protocol heeft de toegevoegde mogelijkheid van het meten van de kinetiek van transcriptie en mRNA afbraak. Met behulp van deze methode kunnen veel monsters tegelijkertijd worden verwerkt zonder extra tijd of moeite.Zo kunnen vier keerloopexperimenten die 48 monsters opleveren, in acht uur worden verwerkt voor beeldvorming. Ons protocol is breed toepasbaar voor vele genen en bacteriesoorten. Om afdekslipjes en glazen glijbanen voor te bereiden op het experiment.Gebruik tangen om deklips en glijbanen in een Coplin-pot met 100% ethanol te plaatsen en plaats de pot in een ultrasone waterbad voor 15 tot 20 minuten. Aan het einde van de sonicatie wassen de dia's en deksel glijdt drie tot vier keer met ultra zuiver water voor het bijvullen van de pot met 70%ethanol en het herhalen van de sonicatie. Wanneer alle sonicatiestappen zijn gedaan, droogt de dekking uit en glijdt met stikstofgas.Plaats de deksel glijdt in een lege 1000 microliter pipet tip box en plaats de glijbanen in een schone schuifdoos. Dan, na de gaten van de pipet tip box gebruik maken van een hydrofobe marker om cirkels te trekken op de cover slips en breng een 20 microliter druppel van 0,1% Poly l lysine op elk van deze putten. Om het opzetten van een tijd cursus experiment, voeg 750 microliter van een 20 milliliter exponentieel groeiende E.coli cultuur aan een 1,5 milliliter cultuur buis gemarkeerd tijd nul.En onmiddellijk de buis omkeren. Induceer lac Z expressie met 0,2 tot een millimolar IPTG en start een timer. Na het controleren van de timer, het verzamelen van de celcultuur op elk opeenvolgend experimenteel tijdstip, zoals net aangetoond.Voeg tijdens het experiment tijdens het experiment vijf millimolar ONPF toe aan de kolf om de lac Z-expressie te onderdrukken en blijf de culturen bemonsteren om de mRNA-afbraak bij te houden. Aan het einde van de tijd cursus monster verwerving, incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten, gevolgd door incubatie op ijs gedurende 30 minuten. Aan het einde van de incubatiecentrifugeren de monsters om de fixatieve te verwijderen en gebruik een pipet om de supernatant te verwijderen.Stel de bacteriën opnieuw op in een milliliter DEPC PBS en was de cellen nog twee keer in één milliliter verse DEPC PBS per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, opnieuw opschorten van de cellen in 30 microliter van verse DEPC PBS. Voor permeabilisatie van de cellen.Voeg eerst het monster van elk keer punt aan individuele hydrofobe putten op een van de ethanol gesteriliseerde glazen deksel slips. En laat de cellen zich hechten aan de afdeksel met een 10 tot 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur. Voeg aan het einde van de incubatie 15 microliter van 70% ethanol toe aan elke put.Na vier minuten, aspirate de ethanol uit elke put, zodat de putten volledig droog zijn. Voeg na het wassen 30 microliter pre-hybridisatieoplossing toe aan elke put van permeabiliseerde cellen en broed de cellen gedurende 30 minuten in een oven van 37 graden Celsius. Vervang de pre hybridisatieoplossing door ongeveer 30 microliters sondehybrideoplossing per put.En bedek de kamer met aluminiumfolie voor een twee uur durende incubatie in de 37 graden Celsius oven. Gebruik aan het einde van de incubatie een multi-channel pipet om de putten drie tot vijf keer te spoelen met 30 microliters wasoplossing per put per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, incubeer de cellen gedurende 15 tot 30 minuten bij 37 graden Celsius voor het wassen van de putten vijf keer met 30 microliters van verse DEPC PBS per wasbeurt.Na de laatste wasbeurt, aspirate alle vloeistof uit de cover slip. En voeg vier microliters van verse DEPC PBS aan elke put. Gebruik tangen om de afdekking voorzichtig op een ethanol gesteriliseerd glas schuifmonster naar beneden, en gebruik siliconen tandvlees om de randen van de cover slip afdichting.Als u een interessegebied wilt vinden, selecteert u de live-modus van fasecontrastbeeldvorming en manoeuvreert u de werkbare joystick om het gezichtsveld binnen een put te wijzigen. Plaats een gebied waarin de celdichtheid optimaal is en pas de Z-focus zodanig aan dat de fasecontrastcelbeelden scherp zijn. Verwerf vervolgens een C vijf-beeld met een belichting van vier seconden, een C-afbeelding met een belichting van twee seconden en een fasecontrastbeeld met een belichting van 0,2 seconde voor ongeveer 10 verschillende gebieden per put.Als alternatief kan een NDI-acquisitie worden uitgevoerd waarbij C vijf-, C-drie- en fasecontrastafbeeldingen in serie worden verworven. Wanneer alle putten zijn afgebeeld, opent u een geschikt celsegmentatiegereedschap en u de stapel losklikken. Laad de fasecontrastafbeeldingen van interesse en selecteer onafhankelijke frames en klik op rekenfaseprofiel als nul.Om te beginnen met het segmentatieproces waarin de cellen worden geïdentificeerd en hun contouren worden berekend. Laad de parameters in de Map GitHub en klik op alle frames. Aan het einde van de verwerking selecteer contour om het net te visualiseren.Vervolgens, onder de spot detectie tabblad, uitchecken stapel, controleer mazen en klik wrijven om te beginnen met de spot identificatie en kwantificering op basis van de twee D Gaussian montage. Selecteer de map met de fluorescerende afbeeldingen en het netbestand dat zojuist is berekend op basis van de celdetectieprocedure en geef de bestandsnaam aan waarop de resultaten van de spotdetectie worden opgeslagen. Gebruik vervolgens de werkstroom voor beeldanalyse op GitHub om de fluorescentiebeelden te analyseren.In dit volledige gezichtsveld kunnen ongeveer 500 E.coli cellen met een goede dichtheid voor celsegmentatie worden waargenomen. De morfologie van de cellen in de fasecontrastbeelden moet voor segmentatiedoeleinden vergelijkbaar blijven met die van levende cellen. Als de cellen meer dan permeabiliseerd zijn, zal hun morfologie ongeschikt worden voor segmentatie.De verdeling van lac Z mRNA spot intensiteiten voor inductie past niet goed bij een normale of Poisson verdeling als gevolg van de aanwezigheid van vlekken met hoge intensiteiten. Wanneer de expressie van lac Z wordt geïnduceerd neemt het signaal van vijf prime lac Z mRNA toe voordat het drievoudige lac Z mRNA-signaal toeneemt. Als de expressie van lac Z wordt onderdrukt zowel de vijf en drie prime lac Z mRNA signalen afnemen.Om de snelheid van transcriptieverlenging te verkrijgen, zijn de opkomst van de vijf en drie priemsignalen geschikt voor lijnen. Terwijl de snelheid van mRNA afbraak wordt verkregen door het monteren van het verval gebied met een exponentiële functie. Omdat single molecule vis is een eencellige techniek, cel tot cel variabiliteiten in transcriptie kan ook worden geanalyseerd.Bovendien maakt de analyse van de colocalisatie van vijf priemgezftigde en drie priemgez mRNA het mogelijk om de dichtheid van de RNA-polymerasen op het lac Z-gen te kwantificeren. Als monsters uit verschillende tijdpunten gelijktijdig worden behandeld tijdens deze procedure. Het is belangrijk om het monster gescheiden te houden terwijl ze in de buizen en op de dek slip.Met behulp van deze single molecule eencellige microscopie techniek. Onderzoekers kunnen nu onderzoeken hoe transcriptie en mRNA afbraak kinetiek zijn gerelateerd aan de absolute aantallen of subcellulaire locaties van mRNAs.

Research

JoVE Journal

Biology

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Fluorescentie In situ Hybridisatie (FISH) Protocol in menselijk sperma

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Met behulp van Whole Mount In situ Hybridisatie aan Moleculaire Biologie en organismale Link

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

Het meten van de kinetiek van mRNA transcriptie in Single levende cellen

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening van Fungal endoglucanase activiteit in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Detectie van virale RNA door fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolatie van Ribosoom Bound Nascent Polypeptiden<em&gt; In vitro</em&gt; Om Translationeel Pauze plaatsen langs mRNA identificeren

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Het in kaart brengen Bacteriële Functionele Netwerken en Wegen in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Gebruik van synthetische Genetische Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Eenvoudige methode voor fluorescentie DNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie aan Geplette Chromosomen

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

De veelzijdige voordelen van Protein Co-expressie in<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...