Name: probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2020-07-30T13:30:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Ce protocole a été développé par S.K. au cours de ses recherches postdoctorales dans le laboratoire de la Dre Christine Jacobs-Wagner au Howard Hughes Medical Institute et au Microbial Sciences Institute de l’Université Yale. Nous remercions la Dre Jacobs-Wagner et ses membres de laboratoire pour les diverses contributions au cours de l’élaboration de la méthode et Laura Troyer pour la lecture critique du manuscrit. S.K. reconnaît l’appui du Programme des boursiers Searle; K.V. reconnaît le soutien du James Scholar Preble Research Award de l’Université de l’Illinois.

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ici, nous avons présenté un protocole smFISH pour mesurer la cinétique de l’ARNm chez E. coli. Dans les protocoles smFISH précédemment publiés pour les bactéries23, les cellules ont été conservées dans les tubes jusqu’à la toute fin du protocole, c’est-à-dire jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’imagerie. Bien qu’il ait de nombreux avantages, tels que la liaison non spécifique minimale des sondes fluorescentes sur la surface de couverture23, il est difficile de suivre ces protocoles quand il ya de nombreux échantillons d’une expérience de cours dans le temps. Premièrement, un volume relativement important de cellules (>1 mL) doit être échantillonné et même récolté avant fixation. Deuxièmement, les échantillons de cellules doivent être centrifugés plusieurs fois pour échanger des solutions et se laver après l’étape d’hybridation. Dans notre protocole, un petit volume (<1 mL) de culture est directement mélangé avec une solution de fixation dans un tube de 1,5 mL, aidant à « geler » rapidement l’état cellulaire au moment de l’échantillonnage. En outre, les cellules restent attachées à la surface tout au long de la procédure, et différentes solutions peuvent être échangées rapidement en aspirant des liquides avec un système de filtration sous vide et en appliquant des gouttes de solution à la fois avec une pipette multi-canaux. Cette différence rend notre protocole très avantageux lorsqu’un grand nombre d’échantillons doivent être traités immédiatement. En utilisant notre protocole, 12 à 48 échantillons peuvent être manipulés simultanément et l’ensemble de la procédure FISH peut être complété dans un délai d’environ 8 heures, environ une quantité similaire de temps nécessaire pour quelques échantillons (Figure 2). Bien que nous ayons utilisé l’expression de lacZ dans E. coli comme exemple, le protocole est largement applicable à différents gènes et espèces bactériennes avec des considérations discutées ci-dessous.
Pour différents gènes, la première chose à considérer est les sondes smFISH. On peut concevoir des sondes oligonucléotides qui carreauxent l’ARNm d’intérêt (Figure 1A)13. Dans cette approche de sonde de « carrelage », chaque sonde est de 20 de base longue et étiquetée avec un fluorophore au terminus de 5 ou 3'. Cette stratégie est pratique car aucune manipulation génétique n’est nécessaire. Alternativement, une répétition en tandem d’une séquence d’environ 20 pb, étrangère à la séquence génomique (p. ex., un tableau de séquence de lacO dans Caumobacter crescentus14)peut être insérée dans la région non traduite d’un gène d’intérêt et une seule sonde complémentaire à l’unité de répétition est utilisée pour étiqueter l’ARNM (approche « array » ; Figure 1B). Dans les deux cas, plusieurs fluorophores décorent un ARNm, ce qui donne un signal de fluorescence amplifié qui peut être facilement différencié d’une seule sonde non spécifiquement liée à l’intérieur d’une cellule.
Le choix des approches de « carrelage » ou de « tableau » dépend du contrôle négatif, un échantillon où la liaison non spécifique des sondes est testée parce qu’elle n’a pas l’ARNm cible. Pour les sondes de carrelage (Figure 1A), une souche mutante sans le gène d’intérêt ou une condition, dans laquelle le gène n’est pas transcrit (par exemple, la répression de lacZ) peut servir de contrôle négatif pour tester la liaison non spécifique des sondes. Pour le smFISH (Figure 1B)à base de tableau , une souche de type sauvage dépourvue du tableau peut servir de contrôle négatif car elle ne contient pas de sites de liaison pour les sondes.
Les conditions optimales d’hybridation peuvent dépendre des séquences de sonde et même du choix des colorants fluorophore. Nous avons optimisé la condition d’hybridation pour les ensembles de sondes lacZ en maintenant la température d’hybridation à 37 °C et en testant différentes concentrations d’ensembles de sondes et de formamide dans la solution d’hybridation. Des concentrations plus élevées de formamide ont tendance à réduire à la fois la liaison non spécifique et spécifique26,35. Nous recommandons de modifier systématiquement l’hybridation et ses conditions de lavage tout en maintenant le temps et la température d’hybridation les mêmes. À mesure que la condition devient plus stricte, la diminution non spécifique et la liaison spécifique (figure 6). Il est important de trouver un point où la liaison non spécifique commence à atteindre en dessous d’un seuil acceptable sans compromettre davantage la liaison spécifique. Par exemple, nous avons utilisé le niveau de signal obtenu sans sondes (« as de sonde ») comme seuil (figure 6).
La méthode smFISH bicolore qui étiquette deux régions distinctes d’un ARNm est limitée aux gènes longs. Pour mesurer le taux d’allongement de la transcription, nous avons profité du fait que le lacZ est long (3075 pb) et que son expression peut être induite par l’IPTG. Lorsqu’un gène est court, il est difficile de concevoir deux ensembles de sondes de carrelage (près de 5' et 3' extrémités) et de résoudre le délai entre les apparitions des régions de 5' contre 3' d’ARNm. Dans ce cas, on peut compter les ARNms naissants à l’état stable par smFISH et analyser leur distribution avec un modèle analytique qui a le taux d’élongation de transcription comme paramètre approprié20. En outre, quand un gène d’intérêt n’est pas inductible, on peut traiter des cellules avec de la rifampicine au moment zéro et mesurer le changement temporel dans les sous-régions de l’ARNm 5' et 3'. Le délai de la diminution du signal d’ARNm de 5' à celui du signal d’ARNm de 3' peut alors être utilisé pour calculer le taux d’allongement de transcription comme fait précédemment31.
Enfin, le protocole smFISH est polyvalent et peut être combiné avec d’autres schémas d’étiquetage. Auparavant, le locus d’ADN a été visualisé avec les ARNms en combinant fish d’ARNm avec l’ADN FISH14 ou le système fluorescent reporter-opérateur20. Les produits protéiques peuvent être visualisés en effectuant l’immunofluorescence avec l’ARNm FISH14,36. En outre, il peut être combiné avec la microscopie en trois dimensions super-résolution37 pour visualiser les ARNms dans les trois dimensions38,39.

Le flux d’informations génétiques de l’ADN à l’ARNm et aux protéines est l’un des processus cellulaires les plus fondamentaux, dont la régulation est importante pour la condition physique cellulaire1. Le nombre d’ARNms dans une cellule est déterminé par deux processus dynamiques, la transcription et la dégradation de l’ARNm. Cependant, la façon dont la transcription et la dégradation de l’ARNm sont réglementées dans le temps et l’espace d’une seule cellule ne sont pas complètement comprises, en grande partie en raison de la pénurie de méthodes expérimentales pour mesurer quantitativement leur cinétique in vivo.
Les méthodes basées sur le total des ARNms extraits d’une population de cellules, telles que la tache nordique, RT-PCR, séquençage de l’ARN et les microarrays d’expression génique, peuvent mesurer la différence relative dans les niveaux d’ARNm et ont été largement utilisées pour analyser le taux d’élongation de transcription2,3,4,5 ou le taux de dégradation de l’ARNm6,7. Cependant, ils ne fournissent pas le nombre absolu d’ARNm par cellule, et donc, ils ne sont pas appropriés pour sonder le taux d’initiation de transcription8. En outre, étant donné que les ARNm sont extraits d’une population de cellules, la distribution spatiale des ARNms à l’intérieur d’une seule cellule et la variabilité des nombres de copies d’ARNm entre les cellules ne peuvent pas être mesurées.
Le séquençage de l’ARN de nouvelle génération sur des cellules individuelles (scRNAseq) peut quantifier le nombre d’ARNms par cellule dans une échelle génomique9. Cependant, il reste difficile d’utiliser cette technique pour mesurer la cinétique de transcription, en raison de défis avec la préparation de l’échantillon et le coût élevé. En particulier, l’application de scRNAseq aux bactéries a été techniquement difficile en raison de l’abondance faible de l’ARNm10,11.
L’hybridation in situ de fluorescence monomolécule (smFISH) est basée sur l’hybridation de sondes mono-échouées étiquetées fluorescentement dont les séquences sont complémentaires à l’ARNm cible d’intérêt12,13. Le concept d’hybridation spécifique à la séquence est similaire à celui utilisé dans northern blot ou RT-PCR, mais l’hybridation se fait in situ dans des cellules fixes, afin de préserver la localisation indigène des ARNm. Le signal d’un seul ARNm est amplifié à l’aide de nombreuses sondes, ~20 nucléotides (nt) de longueur, hybridant à différentes parties d’un ARNm (Figure 1A)13. Dans cette approche de sonde de « carrelage », le nombre de sondes nécessaires pour détecter un seul ARNm fixe une limite inférieure sur la longueur de l’ARNm qui peut être évaluée. Alternativement, l’ARNm d’intérêt peut être fusionné transcriptionnellement à un tableau non codant de séquences d’opérateurs de lac tandem, de sorte que plusieurs copies d’une sonde laco fluorescente étiquetée hybrident à un seul ARNm (Figure 1B)14.
smFISH a été utilisé pour quantifier le nombre d’ARNms par cellule à un état stable (c.-à-d. lorsque la synthèse et la décomposition sont en équilibre) et pour analyser la moyenne et la variabilité des ARNm chez les cellules bactériennes15,16,17. Récemment, smFISH a été appliqué pour quantifier les numéros d’ARNm à un état non stable, juste après l’induction ou la répression de l’expression génique dans E. coli18,19,20. Les changements temporels dans les numéros absolus de copie d’ARNm ont ensuite été utilisés pour calculer le taux d’initiation de transcription, d’allongement et de terminaison, ainsi que le taux de dégradation de l’ARNm. Pour cette application, les procédures smFISH conventionnelles peuvent être lourdes parce qu’il existe de nombreux échantillons, représentant chacun un point de temps, qui doivent passer par plusieurs étapes d’échange de mémoire tampon (c.-à-d. la centrifugation et le lavage). Ici, nous décrivons un protocole smFISH, dans lequel les étapes de manipulation de l’échantillon sont considérablement simplifiées en ayant des cellules adhéré à la surface d’un couvercle et en aspirant les liquides avec un système de filtration sous vide14,19. En utilisant l’expression de lacZ dans E. coli comme exemple, le flux de travail complet (figure 2) est démontré, y compris l’analyse d’image (figure 3) produisant la cinétique in vivo de la transcription (initiation, élongation et terminaison) et la dégradation de l’ARNm, la variabilité cellule-cellule dans l’expression de l’ARNm, et la localisation de l’ARNm. Nous prévoyons que le protocole est largement applicable à la cinétique in vivo de sonde et à la localisation d’autres ARNms dans diverses espèces de bactéries.

probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization

L’hybridation in situ de fluorescence monomolécule permet de compter le nombre absolu d’ARNms dans les cellules individuelles. Ici, nous décrivons une application de smFISH pour mesurer les taux de transcription et de dégradation de l’ARNm chez Escherichia coli. Comme smFISH est basé sur des cellules fixes, nous effectuons smFISH à plusieurs moments au cours d’une expérience de cours de temps, c’est-à-dire lorsque les cellules subissent des changements synchronisés lors de l’induction ou la répression de l’expression des gènes. À chaque moment, les sous-régions d’un ARNm sont spectralement distinguées pour sonder l’allongement de la transcription et la terminaison prématurée. Le résultat de ce protocole permet également d’analyser la localisation intracellulaire des ARNms et l’hétérogénéité dans les numéros de copie d’ARNm parmi les cellules. L’utilisation de ce protocole de nombreux échantillons (~50) peut être traitée dans les 8 heures, comme le temps nécessaire pour seulement quelques échantillons. Nous discutons de la façon d’appliquer ce protocole pour étudier la cinétique de transcription et de dégradation de différents ARNms dans les cellules bactériennes.

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Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Ce protocole décrit une application de l’hybridation in situ de fluorescence monomolécule (smFISH) pour mesurer la cinétique in vivo de la synthèse et de la dégradation de l’ARNm.

Sonder la cinétique de l’ARNm dans l’espace et le temps à Escherichia coli à l’aide de l’hybridation de fluorescence in situ à deux couleurs

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

smFISH est connu pour mesurer le nombre absolu comme emplacement sous cellulaire des ARNH. Notre protocole sMFISH de deux couleurs a la capacité supplémentaire de mesurer la cinétique de la transcription et de la dégradation de l’ARNm. En utilisant cette méthode, de nombreux échantillons peuvent être traités simultanément sans plus de temps ni d’effort.Par exemple, quatre expériences de cours de temps donnant 48 échantillons peuvent être traitées pour imagerie en huit heures. Notre protocole est largement applicable à de nombreux gènes et espèces bactériennes. Pour préparer des feuillets de couverture et des glissières en verre pour l’expérience.Utilisez des forceps pour placer des glissements de couverture et des glissières dans un bocal Coplin contenant 100% d’éthanol et placez le bocal dans un bain d’eau ultrasonique répondre pendant 15 à 20 minutes. À la fin de la sonication laver les glissières et couvrir glisse trois à quatre fois avec de l’eau ultra pure avant de remplir le bocal avec 70% d’éthanol et de répéter la sonication. Lorsque toutes les étapes de sonication sont terminées, séchez les glissements de couverture et glissez avec du gaz azoté.Placez le couvercle glisse dans une boîte vide de pointe de pipette de 1000 microlitres et placez les glissières dans une boîte de glissière propre. Ensuite, en suivant les trous de la boîte à pointes pipette utiliser un marqueur hydrophobe pour dessiner des cercles sur les feuillets de couverture et d’appliquer une baisse de 20 microlitres de 0,1%Poly l lysine à chacun de ces puits. Pour mettre en place une expérience de cours du temps, ajoutez 750 microlitres d’une culture E.coli de croissance exponentielle de 20 millilitres à un tube de culture de 1,5 millilitre marqué temps zéro.Et inverser immédiatement le tube. Induire l’expression du lac Z avec 0,2 à un millimolar IPTG et démarrer une incontrème. Après avoir vérifié la timer, recueillir la culture cellulaire à chaque point de temps expérimental consécutif comme vient de le démontrer.Au moment opportun au cours de l’expérience, ajouter cinq millimolaires ONPF à la fiole pour réprimer l’expression du lac Z et continuer à échantillonner les cultures pour suivre la dégradation de l’ARNm. À la fin de l’acquisition de l’échantillon de cours, incuber les échantillons à température ambiante pendant 15 minutes, puis les incubations sur glace pendant 30 minutes. À la fin de la centrifugeuse d’incubation, les échantillons pour enlever le fixatif et utiliser une pipette pour enlever le supernatant.Re-suspendre les bactéries dans un millilitre de DEPC PBS et laver les cellules deux fois de plus en un millilitre de PBS DEPC frais par lavage. Après le dernier lavage, suspendre à nouveau les cellules dans 30 microlitres de PBS DEPC frais. Pour la perméabilisation des cellules.Ajoutez d’abord l’échantillon à partir de chaque point de temps à des puits hydrophobes individuels sur l’un des feuillets de couverture en verre stérilisés à l’éthanol. Et permettre aux cellules d’adhérer à la feuille de couverture avec une incubation de 10 à 30 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, ajouter 15 microlitres de 70 % d’éthanol à chaque puits.Après quatre minutes, aspirer l’éthanol de chaque puits afin que les puits soient complètement secs. Après lavage ajouter 30 microlitres de solution de pré-hybridation à chaque puits de cellules perméabilisées, et incuber les cellules pendant 30 minutes dans un four de 37 degrés Celsius. Remplacer la solution de pré-hybridation par environ 30 microlitres de solution d’hybridation de sonde par puits.Et couvrir la chambre de papier d’aluminium pendant deux heures d’incubation dans le four de 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, utilisez une pipette multicanal pour rincer les puits trois à cinq fois avec 30 microlitres de solution de lavage par puits par lavage. Après le dernier lavage, incuber les cellules pendant 15 à 30 minutes à 37 degrés Celsius avant de laver les puits cinq fois avec 30 microlitres de PBS DEPC frais par lavage.Après le dernier lavage, aspirer tout le liquide de la feuille de couverture. Et ajouter quatre microlitres de DEPC PBS frais à chaque puits. Utilisez des forceps pour placer soigneusement le glissement du couvercle sur un échantillon de glissière en verre stérilisé à l’éthanol vers le bas, et utilisez de la gomme dentaire en silicone pour sceller les bords du glissement du couvercle.Pour localiser une zone d’intérêt, sélectionnez le mode en direct d’imagerie par contraste de phase et manœuvrez le joystick de scène pour changer le champ de vision dans un puits. Situé une zone dans laquelle la densité cellulaire est optimale et ajuster la mise au point Z de telle sorte que les images de la cellule de contraste de phase sont au point. Ensuite, acquérir une image C cinq avec une exposition de quatre secondes, une image C trois avec une exposition de deux secondes et une image de contraste de phase avec une exposition de 0,2 seconde pour environ 10 zones différentes par puits.Alternativement, une acquisition NDI dans laquelle C cinq, C trois et phases contrastées images sont acquises en série peut être exécuté. Lorsque tous les puits ont été photographiés, ouvrez un outil de segmentation cellulaire approprié et déchez la pile. Chargez les images de contraste de phase d’intérêt et sélectionnez des images indépendantes et cliquez sur calculer le profil de phase comme zéro.Pour commencer le processus de segmentation au cours duquel les cellules seront identifiées et leurs contours seront calculés. Chargez les paramètres fournis dans le dossier GitHub et cliquez sur tous les cadres. À la fin du traitement sélectionnez le contour pour visualiser le maillage.Ensuite, sous l’onglet détection ponctuelle, décocher la pile, vérifier les mailles et cliquer sur frotter pour commencer l’identification des taches et la quantification basée sur les deux raccords Gaussian D. Sélectionnez le dossier contenant les images fluorescentes et le fichier de maille qui vient d’être calculé à partir de la procédure de détection cellulaire et indiquez le nom du fichier auquel les résultats de détection ponctuelle seront enregistrés. Ensuite, utilisez le workflow d’analyse d’image fourni sur GitHub pour analyser les images de fluorescence.Dans ce champ de vision complet, environ 500 cellules E.coli à une bonne densité de segmentation cellulaire peuvent être observées. La morphologie des cellules dans les images de contraste de phase devrait rester comparable à celle des cellules vivantes à des fins de segmentation. Si les cellules sont surcommenciées, leur morphologie deviendra impropre à la segmentation.La distribution des intensités ponctuelles de l’ARNm du lac Z avant l’induction ne correspond pas bien à une distribution normale ou poisson en raison de la présence de taches à forte intensité. Lorsque l’expression du lac Z est induite, le signal de cinq ARNm Z de lac Z augmente avant que le signal d’ARNm de trois premiers lac Z augmente. Si l’expression du lac Z est réprimée, les signaux d’ARNm de cinq et trois premiers lac Z diminuent.Pour obtenir le taux d’allongement de transcription, la montée des cinq et trois signaux principaux sont adaptés avec les lignes. Alors que le taux de dégradation de l’ARNm est obtenu en adaptant la région de décomposition avec une fonction exponentielle. Puisque le poisson de molécule simple est une technique de cellule simple, les variabilités de cellule à cellule dans la transcription peuvent également être analysées.De plus, l’analyse de la colocalisation de cinq ARNm Z premier et de trois principaux lac Z permet de quantifier la densité des polymésases ARN sur le gène du lac Z. Comme les échantillons de différents points de temps sont manipulés simultanément au cours de cette procédure. Il est important de garder l’échantillon séparé pendant qu’ils sont dans les tubes et sur le bordereau de couverture.En utilisant cette technique de microscopie à cellules simples à molécule unique. Les chercheurs peuvent maintenant explorer comment la cinétique de la transcription et de la dégradation de l’ARNm est liée aux nombres absolus ou aux emplacements subcellulaires des ARNM.

Research

JoVE Journal

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