Name: probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2020-07-30T13:30:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Dieses Protokoll wurde von S.K. während ihrer Postdoktorandenforschung im Labor von Dr. Christine Jacobs-Wagner am Howard Hughes Medical Institute und am Microbial Sciences Institute der Yale University entwickelt. Wir danken Dr. Jacobs-Wagner und ihren Labormitgliedern für die verschiedenen Beiträge während der Methodenentwicklung und Laura Troyer für die kritische Lektüre des Manuskripts. S.K. erkennt die Unterstützung des Searle Scholars Program an; K.V. würdigt die Unterstützung des James Scholar Preble Research Award der University of Illinois.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Hier haben wir ein smFISH-Protokoll zur Messung der mRNA-Kinetik in E. coli vorgestellt. In den zuvor veröffentlichten smFISH-Protokollen für Bakterien23wurden Zellen bis zum Ende des Protokolls in den Röhren aufbewahrt, d.h. bis sie zur Bildgebung bereit sind. Obwohl es viele Vorteile hat, wie z. B. minimale unspezifische Bindung von Fluoreszenzsonden auf der Deckgeradenoberfläche23, ist es schwierig, diese Protokolle zu befolgen, wenn es viele Proben aus einem Zeitverlaufsexperiment gibt. Zunächst muss ein relativ großes Volumen von Zellen (>1 ml) vor der Fixierung beprobt und sogar geerntet werden. Zweitens müssen die Zellproben mehrmals zentrifugiert werden, um Lösungen auszutauschen und nach dem Hybridisierungsschritt zu waschen. In unserem Protokoll wird ein kleines Volumen (<1 ml) Kultur direkt mit einer Befestigungslösung in einem 1,5-ml-Rohr vermischt, was hilft, den Zellzustand zum Zeitpunkt der Probenahme schnell einzufrieren. Außerdem bleiben die Zellen während des gesamten Verfahrens an der Oberfläche befestigt, und verschiedene Lösungen können schnell ausgetauscht werden, indem Flüssigkeiten mit einem Vakuumfiltrationssystem angesaugt und Lösungstropfen gleichzeitig mit einer Mehrkanalpipette aufgebracht werden. Dieser Unterschied macht unser Protokoll sehr vorteilhaft, wenn eine große Anzahl von Proben gleichzeitig verarbeitet werden muss. Mit unserem Protokoll können 12-48 Proben gleichzeitig behandelt werden und die gesamte FISH-Prozedur kann innerhalb von 8 Stunden abgeschlossen werden, etwa eine ähnliche Zeit, die für ein paar Proben benötigt wird (Abbildung 2). Obwohl wir die Expression von lacZ in E. coli als Beispiel verwendet haben, ist das Protokoll weithin auf verschiedene Gene und Bakterienarten mit überlegungen anwendbar, die unten erläutert werden.
Bei verschiedenen Genen sind als erstes smFISH-Sonden zu beachten. Man kann Oligonukleotid-Sonden entwerfen, die die mRNA von Interesse fliesen (Abbildung 1A)13. Bei diesem "Fliesen"-Sondenansatz ist jede Sonde 20 Basislang und mit einem Fluorophor an der Endstation 5' oder 3' beschriftet. Diese Strategie ist praktisch, da keine genetische Manipulation erforderlich ist. Alternativ kann eine Tandem-Wiederholung von 20 bp Sequenz, fremd zur genomischen Sequenz (z. B. eine Reihe von LacO-Sequenzen in Caulobacter crescentus14), in den unübersetzten Bereich eines Gens von Interesse eingefügt werden und eine einzelne Sonde, die zur Wiederholungseinheit ergänzt, wird verwendet, um die mRNA zu kennzeichnen ("Array"-Ansatz; Abbildung 1B). In beiden Fällen schmücken mehrere Fluorophore eine mRNA und geben ein verstärktes Fluoreszenzsignal, das leicht von einer einzelnen Sonde unterschieden werden kann, die nicht spezifisch in einer Zelle gebunden ist.
Ob "Kachel"- oder "Array"-Ansätze gewählt werden sollen, hängt von der negativen Kontrolle ab, einer Probe, bei der die unspezifische Bindung von Sonden getestet wird, weil ihr die Ziel-mRNA fehlt. Bei Fliesensonden (Abbildung 1A) kann ein mutierter Stamm ohne das Gen von Interesse oder eine Bedingung, bei der das Gen nicht transkribiert wird (z. B. Unterdrückung von lacZ), als Negativkontrolle für die Prüfung der unspezifischen Bindung von Sonden dienen. Für den Array-basierten smFISH (Abbildung 1B) kann ein Wildtypstamm, der das Array fehlt, als Negativkontrolle dienen, da er keine Bindungsstellen für die Prüfpunkte enthält.
Optimale Hybridisierungsbedingungen können von den Sondensequenzen und sogar von der Wahl der Fluorophorfarbstoffe abhängen. Wir haben die Hybridisierungsbedingung für lacZ-Sondensätze optimiert, indem wir die Hybridisierungstemperatur bei 37 °C gehalten und verschiedene Konzentrationen von Sondensätzen und Formamid in der Hybridisierungslösung getestet haben. lacZ Höhere Konzentrationen von Formamid neigen dazu, sowohl unspezifische als auch spezifische Bindung zu reduzieren26,35. Wir empfehlen, die Hybridisierung und ihre Waschbedingungen systematisch zu ändern und gleichzeitig die Hybridisierungszeit und -temperatur gleich zu halten. Wenn die Bedingung strenger wird, nehmen sowohl unspezifische als auch spezifische Bindungsbindungen ab (Abbildung 6). Es ist wichtig, einen Punkt zu finden, an dem die unspezifische Bindung beginnt, unter einen akzeptablen Schwellenwert zu fallen, ohne dass eine spezifische Bindung weiter beeinträchtigt wird. Beispielsweise haben wir den signalpegel, der ohne Sonden ("keine Sonden") erhalten wurde, als Schwellenwert verwendet (Abbildung 6).
Die zweifarbige smFISH-Methode, die zwei separate Bereiche einer mRNA kennzeichnet, ist auf lange Gene beschränkt. Um die Rate der Transkriptionsdehnung zu messen, haben wir die Tatsache genutzt, dass lacZ lang ist (3075 bp) und seine Expression durch IPTG induziert werden kann. Wenn ein Gen kurz ist, ist es schwierig, zwei Fliesen-Sondensätze (nahe 5' und 3' Enden) zu entwerfen und die Zeitverzögerung zwischen den Auftritten von 5' vs. 3' mRNA-Regionen aufzulösen. In diesem Fall kann man im stetigen Zustand von smFISH aufkeimende mRNAs zählen und deren Verteilung mit einem analytischen Modell analysieren, das die Rate der Transkriptionsdehnung als passenden Parameter20hat. Wenn ein Gen von Interesse nicht induzierbar ist, kann man auch Zellen mit Rifampicin zum Zeitpunkt Null behandeln und die zeitliche Veränderung in 5' und 3' mRNA Subregionen messen. Die Verzögerung von der Abnahme des 5' mRNA-Signals auf das 3' mRNA-Signal kann dann verwendet werden, um die Rate der Transkriptionsdehnung zu berechnen, wie zuvor31getan.
Schließlich ist das smFISH-Protokoll vielseitig und kann mit anderen Kennzeichnungsschemata kombiniert werden. Zuvor wurde DNA-Lokus zusammen mit mRNAs durch die Kombination von mRNA FISH mit DNA FISH14 oder fluoreszierendem Reporter-Operator-System20visualisiert. Proteinprodukte können durch Immunfluoreszenz zusammen mit mRNA FISH14,36visualisiert werden. Es kann auch mit dreidimensionaler superhochauflösender Mikroskopie37 kombiniert werden, um mRNAs in allen drei Dimensionen38,39zu visualisieren.

Der Fluss genetischer Informationen von DNA zu mRNA und Protein ist einer der grundlegendsten zellulären Prozesse, dessen Regulierung für die zelluläre Fitness wichtig ist1. Die Anzahl der mRNAs in einer Zelle wird durch zwei dynamische Prozesse bestimmt, Transkription und mRNA-Abbau. Wie Transkription und mRNA-Abbau in Zeit und Raum einer einzelnen Zelle reguliert werden, bleibt jedoch nicht vollständig verstanden, was vor allem auf den Mangel an experimentellen Methoden zur quantitativen Messung ihrer Kinetik in vivo zurückzuführen ist.
Methoden, die auf der Gesamtanzahl der mRNAs basieren, die aus einer Population von Zellen extrahiert wurden, wie Northern Blot, RT-PCR, RNA-Sequenzierung und Genexpressionsmikroarrays, können den relativen Unterschied in mRNA-Spiegeln messen und wurden weit verbreitet, um die Rate der Transkriptionsdehnung2,3,4,5 oder die Rate des mRNA-Abbaus6,7zu analysieren. Sie liefern jedoch nicht die absolute Anzahl von mRNAs pro Zelle, und daher sind sie nicht geeignet, die Rate der Transkriptionsinitiierung zu untersuchen8. Da mRNAs aus einer Zellgesamtheit extrahiert werden, können die räumliche Verteilung von mRNAs innerhalb einer einzelnen Zelle und die Variabilität der mRNA-Kopierzahlen zwischen den Zellen nicht gemessen werden.
Die RNA-Sequenzierung der nächsten Generation an einzelnen Zellen (scRNAseq) kann die Anzahl der mRNAs pro Zelle in einer genomischen Skala9quantifizieren. Aufgrund von Herausforderungen bei der Probenvorbereitung und hohen Kosten bleibt es jedoch schwierig, diese Technik zur Messung der Transkriptionskinetik zu verwenden. Insbesondere die Anwendung von scRNAseq auf Bakterien war aufgrund der geringen mRNA-Überfluss10,11technisch schwierig.
Die Einmolekülfluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (smFISH) basiert auf der Hybridisierung fluoreszierend markierter einsträngiger Sonden, deren Sequenzen die Ziel-mRNA von Interesse12,13komplementär machen. Das Konzept der sequenzspezifischen Hybridisierung ähnelt dem, das in Northern Blot oder RT-PCR verwendet wird, aber die Hybridisierung erfolgt in situ innerhalb fester Zellen, um die native Lokalisierung von mRNAs zu erhalten. Das Signal einer einzelnen mRNA wird mit vielen Sonden verstärkt, die 20 Nukleotide (nt) in der Länge sind und mit verschiedenen Teilen einer mRNA hybridisieren (Abbildung 1A)13. Bei diesem "Kachel"-Sondenansatz legt die Anzahl der Sonden, die zum Nachweis einer einzelnen mRNA erforderlich sind, eine niedrigere Grenze für die Länge der mRNA fest, die untersucht werden kann. Alternativ kann die mRNA von Interesse transkriptionsweise zu einem nicht-kodierenden Array von Tandem-Lac-Operatorsequenzen verschmolzen werden, so dass mehrere Kopien einer fluoreszierend markierten LacO-Sonde zu einer einzigen mRNA hybridisieren (Abbildung 1B)14.
smFISH wurde verwendet, um die Anzahl der mRNAs pro Zelle im stationären Zustand zu quantifizieren (d. h. wenn Synthese und Zerfall im Gleichgewicht sind) und um den Mittelwert und die Variabilität von mRNAs zwischen Bakterienzellen15,16,17zu analysieren. Kürzlich wurde smFISH angewendet, um mRNA-Zahlen im nicht-stabilen Zustand zu quantifizieren, direkt nach der Induktion oder Unterdrückung der Genexpression in E. coli18,19,20. Die zeitlichen Veränderungen der absoluten mRNA-Kopierzahlen wurden dann verwendet, um die Rate der Transkriptionsinitiierung, Dehnung und Beendigung sowie die Rate des mRNA-Abbaus zu berechnen. Für diese Anwendung können herkömmliche smFISH-Verfahren umständlich sein, da es viele Proben gibt, die jeweils einen Zeitpunkt darstellen und mehrere Pufferaustauschschritte durchlaufen müssen (z. B. Zentrifugation und Waschen). Hier beschreiben wir ein smFISH-Protokoll, bei dem die Probenhandhabungsschritte drastisch vereinfacht werden, indem Zellen an der Oberfläche eines Deckellipss haften und Flüssigkeiten mit einem Vakuumfiltrationssystem14,19anhaften. Am Beispiel der Expression von lacZ in E. coli wird der vollständige Arbeitsablauf (Abbildung 2) demonstriert, einschließlich der Bildanalyse ( Abbildung3), die die In-vivo-Kinetik der Transkription (Initiierung, Dehnung und Beendigung) und den mRNA-Abbau, die Zell-zu-Zell-Variabilität in der mRNA-Expression und die mRNA-Lokalisierung ergibt. Wir gehen davon aus, dass das Protokoll weithin auf die In-vivo-Kinetik und Lokalisierung anderer mRNAs in verschiedenen Bakterienarten anwendbar ist.

probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization

Die Single-Molekül-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (smFISH) ermöglicht die Zählung der absoluten Anzahl von mRNAs in einzelnen Zellen. Hier beschreiben wir eine Anwendung von smFISH zur Messung der Transkriptionsraten und mRNA-Abbauraten bei Escherichia coli. Da smFISH auf festen Zellen basiert, führen wir smFISH zu mehreren Zeitpunkten während eines Zeitverlaufsexperiments durch, d.h. wenn Zellen bei Induktion oder Unterdrückung der Genexpression synchronisierte Veränderungen durchlaufen. Zu jedem Zeitpunkt werden Subregionen einer mRNA spektral unterschieden, um Transkriptionsdehnung und vorzeitige Beendigung zu sonden. Das Ergebnis dieses Protokolls ermöglicht auch die Analyse der intrazellulären Lokalisierung von mRNAs und Heterogenität in mRNA-Kopierzahlen zwischen Zellen. Mit diesem Protokoll können viele Samples (50)) innerhalb von 8 h verarbeitet werden, wie die Zeit, die für nur wenige Proben benötigt wird. Wir besprechen, wie dieses Protokoll angewendet werden kann, um die Transkriptions- und Abbaukinetik verschiedener mRNAs in Bakterienzellen zu untersuchen.

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Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Dieses Protokoll beschreibt eine Anwendung der einmolekularen Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (smFISH), um die In-vivo-Kinetik der mRNA-Synthese und -Degradation zu messen.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli mit Zwei-Farben-Einmolekülfluoreszenz in Situ-Hybridisierung

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

smFISH ist bekannt für die Messung der absoluten Zahl als subzellulärer Standort von mRNAs. Unser zweifarbiges sMFISH-Protokoll hat die zusätzliche Fähigkeit, die Kinetik der Transkription und mRNA-Degradation zu messen. Mit dieser Methode können viele Proben ohne zusätzlichen Zeit- oder Aufwand gleichzeitig verarbeitet werden.So können beispielsweise vier Zeitverlaufsexperimente mit 48 Proben für die Bildgebung in acht Stunden verarbeitet werden. Unser Protokoll ist allgemein für viele Gene und Bakterienarten anwendbar. So bereiten Sie Abdeckungsscheine und Glasscheiben für das Experiment vor.Verwenden Sie Zangen, um Deckelscheine und Rutschen in einem Coplin-Glas mit 100% Ethanol zu platzieren und das Glas in einem Wasserbad Ultraschall für 15 bis 20 Minuten zu platzieren. Am Ende der Beschallung waschen die Rutschen und Abdeckung rutscht drei bis vier Mal mit reinem Randwasser, bevor das Glas mit 70% Ethanol nachgefüllt und die Beschallung wiederholt. Wenn alle Beschallungsschritte abgeschlossen sind, trocknen Sie die Abdeckung rutscht und gleitet mit Stickstoffgas.Legen Sie die Abdeckung in eine leere 1000 Mikroliter Pipettenkippbox und legen Sie die Dias in eine saubere Schiebebox. Dann, nach den Löchern der Pipettenspitze Box verwenden Sie einen hydrophoben Marker, um Kreise auf die Abdeckung Slips zu ziehen und einen 20 Mikroliter Tropfen von 0,1%Poly l Lysin auf jede dieser Brunnen auftragen. Um ein Zeitkursexperiment einzurichten, fügen Sie 750 Mikroliter aus einer 20 Milliliter exponentiell wachsenden E.coli-Kultur zu einer 1,5-Milliliter-Kulturröhre hinzu, die mit Derzeit Null gekennzeichnet ist.Und sofort die Röhre umkehren. Lac Z-Expression mit 0,2 bis einem Millimolaren IPTG induzieren und einen Timer starten. Sammeln Sie nach der Überprüfung des Timers die Zellkultur zu jedem aufeinanderfolgenden experimentellen Zeitpunkt, wie soeben gezeigt.Zum geeigneten Zeitpunkt während des Experiments fügen Sie dem Kolben fünf Millimolar ONPF hinzu, um die Lac-Z-Expression zu unterdrücken und die Kulturen weiter zu testen, um den mRNA-Abbau zu verfolgen. Am Ende der Zeit Kursprobe Erfassung, inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 15 Minuten gefolgt von Inkubation auf Eis für 30 Minuten. Am Ende der Inkubationszentrifugieren Sie die Proben, um das Fixativ zu entfernen und verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen.Die Bakterien in einem Milliliter DEPC PBS wieder aussetzen und die Zellen zwei weitere Male in einem Milliliter frischer DEPC PBS pro Waschgang waschen. Nach der letzten Wäsche die Zellen in 30 Mikrolitern frischer DEPC-PBS wieder aufhängen. Zur Permeabilisierung der Zellen.Fügen Sie die Probe zunächst von jedem Zeitpunkt an einzelne hydrophobe Brunnen auf einem der Ethanol-sterilisierten Glasabdeckungsscheine hinzu. Und lassen Sie die Zellen mit einer Inkubation von 10 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur am Deckschein haften. Am Ende der Inkubation 15 Mikroliter 70% Ethanol zu jedem Brunnen hinzufügen.Nach vier Minuten das Ethanol aus jedem Brunnen ansaugen, so dass die Brunnen vollständig trocken sind. Nach dem Waschen fügen Sie 30 Mikroliter Vorhybridisierungslösung zu jedem Brunnen von permeabilisierten Zellen, und inkubieren die Zellen für 30 Minuten in einem 37 Grad Celsius Ofen. Ersetzen Sie die Vorhybridisierungslösung durch ca. 30 Mikroliter Sondenhybridisierungslösung pro Brunnen.Und bedecken Sie die Kammer mit Aluminiumfolie für eine zweistündige Inkubation im 37 Grad Celsius Ofen. Am Ende der Inkubation verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die Brunnen drei- bis fünfmal mit 30 Mikroliter Waschlösung pro Brunnen pro Waschgang zu spülen. Nach der letzten Wäsche die Zellen 15 bis 30 Minuten bei 37 Grad Celsius bebrüten, bevor Sie die Brunnen fünfmal mit 30 Mikrolitern frischer DEPC PBS pro Wäsche waschen.Nach der letzten Wäsche die gesamte Flüssigkeit aus dem Deckelschlupf absaugen. Und fügen Sie vier Mikroliter frische DEPC PBS zu jedem Brunnen hinzu. Verwenden Sie Zangen, um den Deckelschlupf vorsichtig auf eine Ethanol-sterilisierte Glasrutsche Nachteilen nach unten zu legen, und verwenden Sie Silikon-Zahngummi, um die Ränder des Abdeckungsschlupfes zu versiegeln.Um einen Interessenbereich zu lokalisieren, wählen Sie den Live-Modus der Phasenkontrast-Bildgebung aus und manövrieren Sie den Bühnen-Joystick, um das Sichtfeld innerhalb eines Brunnens zu ändern. Einen Bereich, in dem die Zelldichte optimal ist, und passen Sie den Z-Fokus so an, dass die Phasenkontrastzellenbilder im Fokus stehen. Dann erfassen Sie ein C-Fünf-Bild mit einer Belichtung von vier Sekunden, ein C-Drei-Bild mit einer Belichtung von zwei Sekunden und ein Phasenkontrastbild mit einer Belichtung von 0,2 Sekunden für ca. 10 verschiedene Bereiche pro Bohrplatz.Alternativ kann eine NDI-Erfassung ausgeführt werden, bei der C-Fünf-, C-Drei- und Phasenkontrastbilder in Reihe erfasst werden. Wenn alle Bohrungen abgebildet wurden, öffnen Sie ein entsprechendes Zellsegmentierungswerkzeug, und klicken Sie auf den Stapel. Laden Sie die Phasenkontrastbilder von Interesse, wählen Sie unabhängige Frames aus, und klicken Sie auf das Computephasenprofil als Null.Beginnen Sie den Segmentierungsprozess, bei dem die Zellen identifiziert und ihre Konturen berechnet werden. Laden Sie die im GitHub-Ordner bereitgestellten Parameter, und klicken Sie auf alle Frames. Wählen Sie am Ende der Verarbeitung Kontur aus, um das Netz zu visualisieren.Als nächstes, unter der Spot-Erkennung Registerkarte, deaktivieren Sie Stapel, überprüfen Sie Netze und klicken Sie auf Reiben, um die Spot-Identifikation und Quantifizierung basierend auf den beiden D Gaußian Fitting zu beginnen. Wählen Sie den Ordner aus, der die fluoreszierenden Bilder und die Netzdatei enthält, die gerade aus dem Zellerkennungsverfahren berechnet wurde, und geben Sie den Dateinamen an, in dem die Spoterkennungsergebnisse gespeichert werden sollen. Verwenden Sie dann den auf GitHub bereitgestellten Bildanalyse-Workflow, um die Fluoreszenzbilder zu analysieren.In diesem vollen Sichtfeld können ca. 500 E.coli-Zellen mit einer guten Dichte zur Zellsegmentierung beobachtet werden. Die Morphologie der Zellen in den Phasenkontrastbildern sollte für Segmentierungszwecke mit der von lebenden Zellen vergleichbar bleiben. Wenn die Zellen überpermeabilisiert sind, wird ihre Morphologie für die Segmentierung ungeeignet.Die Verteilung von lac Z mRNA-Spotintensitäten vor der Induktion passt aufgrund des Vorhandenseins von Spots mit hohen Intensitäten nicht gut zu einer normalen oder Poisson-Verteilung. Wenn die Expression von lac Z induziert wird, erhöht sich das Signal von fünf Prime lac Z mRNA, bevor das drei Prim-Lac-Z-mRNA-Signal zunimmt. Wenn die Expression von lac Z unterdrückt wird, nehmen sowohl die fünf als auch drei Prim-Lac-Z-mRNA-Signale ab.Um die Rate der Transkriptionsdehnung zu erhalten, ist der Anstieg der fünf und drei Hauptsignale mit Linien geeignet. Während die Rate des mRNA-Abbaus durch Die Anpassung des Zerfallsbereichs mit einer exponentiellen Funktion erreicht wird. Da einzelmolekulare Fische eine Einzelzelltechnik sind, können auch Zell-zu-Zell-Variabilitäten in der Transkription analysiert werden.Darüber hinaus ermöglicht die Analyse der Kolokalisierung von fünf Prime- und drei Prime-Lac-Z-mRNA die Quantifizierung der Dichte der RNA-Polymerasen auf dem lac Z-Gen. Da Proben aus verschiedenen Zeitpunkten während dieses Verfahrens gleichzeitig behandelt werden. Es ist wichtig, die Probe getrennt zu halten, während sie sich in den Rohren und auf dem Deckelschlupf befindet.Mit dieser einzelmolekularen Einzelzellmikroskopie-Technik. Forscher können nun untersuchen, wie Transkription und mRNA-Abbaukinetik mit den absoluten Zahlen oder subzellulären Positionen von mRNAs zusammenhängen.

Research

JoVE Journal

Biology

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

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Forschung

Biologie

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