Name: probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2020-07-30T13:30:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

פרוטוקול זה פותח על ידי ס.ק. במהלך מחקר הפוסט-טוקטורלי שלה במעבדה של ד"ר כריסטין ג'ייקובס-וגנר במכון הרפואי הווארד יוז והמכון למדעי המיקרוביאלית באוניברסיטת ייל. אנו מודים לד"ר ג'ייקובס-וגנר וחברי המעבדה שלה על תשומות שונות במהלך פיתוח השיטה וללורה טרוייר על הקריאה הביקורתית של כתב היד. ס.ק. מכירה בתמיכה מתכנית חוקרי סריל; K.V. מכיר בתמיכתו של ג'יימס מלומד Preble מחקר פרס מאוניברסיטת אילינוי.

<ol>
	<li>Bervoets, I., Charlier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity,+versatility+and+complexity+of+bacterial+gene+regulation+mechanisms:+opportunities+and+drawbacks+for+applications+in+synthetic+biology.">Diversity, versatility and complexity of bacterial gene regulation mechanisms: opportunities and drawbacks for applications in synthetic biology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 304-339 (2019).</li><li>Epshtein, V., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+RNA+polymerase+molecules+in+transcription+elongation.">Cooperation between RNA polymerase molecules in transcription elongation.</a> Science. 300 (5620), 801-805 (2003).</li><li>Vogel, U., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+chain+elongation+rate+in+Escherichia+coli+depends+on+the+growth+rate.">The RNA chain elongation rate in Escherichia coli depends on the growth rate.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 2807-2813 (1994).</li><li>Tennyson, C. N., Klamut, H. J., Worton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+dystrophin+gene+requires+16+hours+to+be+transcribed+and+is+cotranscriptionally+spliced.">The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is cotranscriptionally spliced.</a> Nature Genetics. 9, 184 (1995).</li><li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes.">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 16, 1128 (2009).</li><li>Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+RNA+Half-Life+Analysis+in+Escherichia+coli+Reveals+Positional+Patterns+of+Transcript+Degradation.">Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation.</a> Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).</li><li>Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. -. H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+decay+and+abundance+in+Escherichia+coli+at+single-gene+resolution+using+two-color+fluorescent+DNA+microarrays.">Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).</li><li>P&#233;rez-Ort&#237;n, J. E., Medina, D. A., Ch&#225;vez, S., Moreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+do+you+mean+by+transcription+rate.">What do you mean by transcription rate.</a> BioEssays. 35 (12), 1056-1062 (2013).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li><li>Kuchina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+single-cell+RNA+sequencing+by+split-pool+barcoding.">Microbial single-cell RNA sequencing by split-pool barcoding.</a> BioRxiv. , 869248 (2019).</li><li>Blattman, S. B., Jiang, W., Oikonomou, P., Tavazoie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotic+single-cell+RNA+sequencing+by+in+situ+combinatorial+indexing.">Prokaryotic single-cell RNA sequencing by in situ combinatorial indexing.</a> Nature Microbiology. , (2020).</li><li>Femino, A., Fay, F., Fogarty, K., Singer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Montero Llopis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+flow+of+genetic+information+in+bacteria.">Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria.</a> Nature. 466 (7302), 77-81 (2010).</li><li>So, L. -. h., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+properties+of+transcriptional+time+series+in+Escherichia+coli.">General properties of transcriptional time series in Escherichia coli.</a> Nature Genetics. 43 (6), 554-560 (2011).</li><li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells.">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li><li>Jones, D. L., Brewster, R. C., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+architecture+dictates+cell-to-cell+variability+in+gene+expression.">Promoter architecture dictates cell-to-cell variability in gene expression.</a> Science. 346 (6216), 1533-1536 (2014).</li><li>Iyer, S., Park, B. R., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantitative+measurement+of+transcriptional+kinetic+parameters+in+vivo.">Absolute quantitative measurement of transcriptional kinetic parameters in vivo.</a> Nucleic Acids Research. 44 (18), 142 (2016).</li><li>Kim, S., Beltran, B., Irnov, I., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Distance+Cooperative+and+Antagonistic+RNA+Polymerase+Dynamics+via+DNA+Supercoiling.">Long-Distance Cooperative and Antagonistic RNA Polymerase Dynamics via DNA Supercoiling.</a> Cell. 179 (1), 106-119 (2019).</li><li>Wang, M., Zhang, J., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+transcription+at+a+single+gene+copy+reveals+hidden+drivers+of+bacterial+individuality.">Measuring transcription at a single gene copy reveals hidden drivers of bacterial individuality.</a> Nature Microbiology. 4 (12), 2118-2127 (2019).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Labeling DNA (or RNA) for single-molecule FRET. 2012 (9), 1005-1008 (2012).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Ethanol Precipitation of DNA in Microcentrifuge Tubes. 2006 (1), 4456 (2006).</li><li>Skinner, S. O., Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization.">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li><li>Adesnik, M., Levinthal, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+and+degradation+of+lactose+operon+messenger+RNA+in+E.+coli.">The synthesis and degradation of lactose operon messenger RNA in E. coli.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 35, 451-459 (1970).</li><li>Campbell, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+for+rifampicin+inhibition+of+bacterial+RNA+polymerase.">Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase.</a> Cell. 104 (6), 901-912 (2001).</li><li>Raj, A., Tyagi, S., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 472, 365-386 (2010).</li><li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics.">High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Molecular Microbiology. 80 (3), 612-627 (2011).</li><li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oufti:+an+integrated+software+package+for+high-accuracy,+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis.">Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Molecular Microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).</li><li>Moffitt, J. R., Zhuang, X., Filonov, G. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).</li><li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+gene+expression+in+live+cells,+one+protein+molecule+at+a+time.">Probing gene expression in live cells, one protein molecule at a time.</a> Science. 311 (5767), 1600-1603 (2006).</li><li>Chen, H., Shiroguchi, K., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+study+of+mRNA+degradation+and+transcript+elongation+in+Escherichia+coli.">Genome-wide study of mRNA degradation and transcript elongation in Escherichia coli.</a> Molecular Systems Biology. 11 (1), 781 (2015).</li><li>Vogel, U., S&#248;rensen, M., Pedersen, S., Jensen, K. F., Kilstrup, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreasing+transcription+elongation+rate+in+Escherichia+Coli+exposed+to+amino+acid+starvation.">Decreasing transcription elongation rate in Escherichia Coli exposed to amino acid starvation.</a> Molecular Microbiology. 6 (15), 2191-2200 (1992).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+and+translation+contribute+to+gene+locus+relocation+to+the+nucleoid+periphery+in+E.+coli.">Transcription and translation contribute to gene locus relocation to the nucleoid periphery in E. coli.</a> Nature Communications. 10 (1), 5131 (2019).</li><li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast.">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li><li>Fontenete, S., Guimar&#227;es, N., Wengel, J., Azevedo, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+melting+temperatures+in+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+procedures+using+thermodynamic+models.">Prediction of melting temperatures in fluorescence in situ hybridization (FISH) procedures using thermodynamic models.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 36 (3), 566-577 (2016).</li><li>Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Zhang, J., Wang, M., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+gene+regulation+in+individual+cells+reveals+rapid+switching+between+promoter+states.">Measurement of gene regulation in individual cells reveals rapid switching between promoter states.</a> Science. 351 (6278), 1218-1222 (2016).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+shapes+the+turnover+of+a+bacterial+transcriptome.">Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome.</a> eLife. 5, 13065 (2016).</li><li>Fei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+in+vivo+target+search+kinetics+of+regulatory+noncoding+RNA.">Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA.</a> Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן, אנו הציגו פרוטוקול SMFISH למדידת קינטיקה mRNA ב E. coli. בפרוטוקולים SMFISH שפורסמו בעבר עבורחיידקים 23, תאים נשמרו בצינורות עד סוף הפרוטוקול, כל כך עד שהם מוכנים להדמיה. אמנם יש לו יתרונות רבים, כגון איגוד מינימלי לא ספציפי של בדיקות פלורסנט על משטח כיסוי23, קשה לעקוב אחר פרוטוקולים אלה כאשר יש דגימות רבות מניסוי קורס זמן. ראשית, נפח גדול יחסית של תאים (>1 מ"ל) צריך להיות נדגים ואפילו לקצור לפני קיבעון. שנית, דגימות התא צריך להיות צנטריפוגה מספר פעמים כדי להחליף פתרונות ולשטוף לאחר שלב הכלאה. בפרוטוקול שלנו, נפח קטן (<1 מ"ל) של תרבות מעורב ישירות עם פתרון תיקון בצינור 1.5 מ"ל, עוזר במהירות "להקפיא" את מצב התא ברגע הדגימה. כמו כן, תאים להישאר מחוברים אל פני השטח לאורך כל ההליך, פתרונות שונים ניתן להחליף במהירות על ידי שאף נוזלים עם מערכת סינון ואקום ויישום טיפות פתרון בבת אחת עם פיפטה רב ערוצית. הבדל זה הופך את הפרוטוקול שלנו ליתרון רב כאשר מספר גדול של דגימות צריך להיות מעובד בבת אחת. באמצעות הפרוטוקול שלנו, 12-48 דגימות ניתן לטפל בו זמנית ואת הליך FISH כולו ניתן להשלים בתוך ~ 8 שעות, על כמות דומה של זמן הדרוש עבור כמה דגימות(איור 2). למרות שהשתמשנו בביטוי lacZ ב E. coli כדוגמה, הפרוטוקול ישים באופן נרחב גנים שונים מינים חיידקיים עם שיקולים שנדונו להלן.
עבור גנים שונים, הדבר הראשון שיש לקחת בחשבון הוא גשושי SMFISH. אחד יכול לעצב בדיקות oligonucleotide אריח mRNA של עניין (איור 1A)13. בגישת בדיקה זו "ריצוף", כל בדיקה היא ~ 20 בסיס ארוך מתויג עם פלואורופור ב 5 ' או 3 ' terminus. אסטרטגיה זו נוחה כמו אין צורך מניפולציה גנטית. לחלופין, ניתן להוסיף חזרה דו-צמדית של רצף של כ-20 bp, זר לרצף הגנומי (לדוגמה, מערך של רצף lacO ב-Caulobacter crescentus14),ניתן להכניס לאזור הלא מתורגם של גן עניין, ובדיקה אחת המשלים ליחידה החוזרת משמשת לסימון הגישה mRNA ("מערך"; איור 1B). בשני המקרים, פלואורופורים מרובים לקשט mRNA, נותן אות פלואורסציה מוגבר שניתן להבדיל בקלות מבדיקה אחת שאינה קשורה באופן ספציפי בתוך תא.
אם לבחור גישות "ריצוף" או "מערך" תלוי בפקד השלילי, מדגם שבו איגוד לא ספציפי של בדיקות נבדק כי זה חסר mRNA היעד. עבור בדיקות ריצוף(איור 1A),זן מוטציה ללא גן של עניין או מצב, שבו הגן אינו מתעתק (למשל, דיכוי של lacZ)יכול לשמש שליטה שלילית לבדיקת איגוד לא ספציפי של בדיקות. עבור SmFISH מבוסס מערך (איור 1B), זן מסוג פראי חסר המערך יכול לשמש כפקד שלילי מכיוון שהוא אינו מכיל אתרי איגוד עבור הגששים.
תנאי הכלאה אופטימליים עשויים להיות תלויים רצפי בדיקה ואפילו הבחירה של צבעי פלואורופור. ייעלנו את מצב ההיברידיזציה עבור ערכות בדיקה lacZ על ידי שמירה על טמפרטורת הכלאה ב 37 °C ובדיקת ריכוזים שונים של ערכות בדיקה formamide בפתרון הכלאה. ריכוזים גבוהים יותר של formamide נוטים להפחית הן לא ספציפית וכריכהספציפית 26,35. אנו ממליצים לשנות באופן שיטתי את ההיברידיזציה ואת תנאי השטיפה שלה תוך שמירה על זמן היברידיזציה וטמפרטורה זהה. ככל שהמצב מחמיר יותר, הן לא ספציפית והן ירידה מחייבת ספציפית(איור 6). חשוב למצוא נקודה שבה הכריכה הלא ספציפית מתחילה להגיע מתחת לסף מקובל מבלי להתפשר עוד יותר על כריכה ספציפית. לדוגמה, השתמשנו ברמת האות שהושגה ללא גששים ("אין גששים") בשם סף(איור 6).
שיטת SmFISH בשני צבעים המסויגת שני אזורים נפרדים של mRNA מוגבלת לגנים ארוכים. כדי למדוד את קצב ההתרבות שעתוק, ניצלנו את העובדה כי lacZ הוא ארוך (3075 bp) ואת הביטוי שלה יכול להיות מושרה על ידי IPTG. כאשר גן קצר, קשה לעצב שתי ערכות בדיקה ריצוף (ליד 5' ו 3 ' קצוות) ולפתור את העיכוב בזמן בין הופעות של 5 ' לעומת 3 ' mRNA אזורים. במקרה זה, אפשר לספור mRNAs המתפתח במצב יציב על ידי smFISH ולנתח את התפלגותם עם מודל אנליטי שיש לו את קצב של תמלול תמלולים כפרמטר מתאים 20. כמו כן, כאשר גן של עניין אינו בלתי ניתן לסיבה, ניתן לטפל בתאים עם rifampicin בזמן אפס למדוד את השינוי הזמני באזורים 5 ' ו 3 ' mRNA. העיכוב מהירידה של אות mRNA 5 ' לזה של אות mRNA 3 ' לאחר מכן יכול לשמש כדי לחשב את קצב ההתארה שעתוק כפישנעשה בעבר 31.
לבסוף, פרוטוקול SmFISH הוא רב-תכליתי ותו לא ניתן לשלב אותו עם ערכות תיוג אחרות. בעבר, לוקוס DNA היה חזותי יחד עם mRNAs על ידי שילוב mRNA דגים עם או DNA FISH14 או פלורסנט כתב-מפעילמערכת 20. מוצרי חלבון ניתן לדמיין על ידי ביצוע immunofluorescence יחד עם mRNA FISH14,36. כמו כן, ניתן לשלב אותו עם מיקרוסקופיתסופר-רזולוציה תלת מימדית 37 כדי לדמיין mRNAs בכל שלושת הממדים38,39.

זרימת המידע הגנטי מ-DNA ל-mRNA וחלבון היא אחד התהליכים הסלולריים הבסיסיים ביותר, שהרגולציה שלהם חשובה לכושר תאי1. מספר mRNAs בתא נקבע על-ידי שני תהליכים דינמיים, שעתוק והשפלה של mRNA. עם זאת, איך שעתוק והשפלה mRNA מוסדרים בזמן ובמרחב של תא אחד נשאר לא לגמרי מובן, בעיקר בשל המחסור בשיטות ניסיוניות כדי למדוד כמותית הקינטיקה שלהם vivo.
שיטות המבוססות על mRNAs הכולל שחולצו מאוכלוסייה של תאים, כגון כתם צפוני, RT-PCR, רצף RNA, ומיקרו-מערך ביטוי גנים, יכול למדוד את ההבדל היחסי ברמות mRNA והיה בשימוש נרחב כדי לנתח את קצב התאווותשעתוק 2,3,,4,5 או שיעורהשפלהmRNA 6,7., עם זאת, הם אינם מספקים את המספר המוחלט של mRNAs לכל תא, ולכן, הם אינם מתאימים לתביעת קצב אתחול שעתוק8. כמו כן, מאחר mRNAs מופקים מאוכלוסייה של תאים, התפלגות מרחבית של mRNAs בתוך תא יחיד ואת השונות של מספרי עותק mRNA בין תאים אין אפשרות למדוד.
רצף RNA מהדור הבא בתאים בודדים (scRNAseq) יכול לכמת את מספר mRNAs לכל תא בקנה מידה גנומי9. עם זאת, קשה להשתמש בטכניקה זו כדי למדוד קינטיקה שעתוק, בשל אתגרים עם הכנת מדגם ועלות גבוהה. בפרט, היישום של scRNAseq לחיידקים היה קשה מבחינה טכנית בשל שפע mRNA נמוך10,11.
פלואורסצנטיות מולקולה אחת ב- situ hybridization (smFISH) מבוססת על הכלאה של גשושים בעלי תווית פלורסנטית חד-גדילית אשר רצפיהם משלימים את mRNA היעד שלעניין 12,13. הרעיון של הכלאה ספציפית לרצף דומה לזה המשמש כתם צפוני או RT-PCR, אבל הכלאה נעשית ב- situ בתוך תאים קבועים, כדי לשמר את התיור המקומי של mRNAs. האות של mRNA יחיד מוגבר באמצעות גששים רבים, ~ 20 נוקלאוטידים (nt) באורך, הכלאה לחלקים שונים של mRNA (איור 1A)13. בגישה זו "ריצוף" גשושית, מספר הגששים הדרושים כדי לזהות mRNA יחיד קובע מגבלה נמוכה יותר על אורך mRNA שניתן לומר. לחלופין, mRNA של עניין עשוי להיות תעתיק התמזגו למערך שאינו קידוד של רצפי מפעיל Lac טנדם, כך עותקים מרובים של בדיקה lacO תיוגנתנת להכלאה mRNA יחיד (איור 1B)14.
SmFISH שימש לכמת את מספר mRNAs לכל תא במצב יציב (כלומר, כאשר סינתזה וריקבון נמצאים באיזון) ולנתח את ממוצע ושונות של mRNAs בקרב תאיםחיידקיים 15,16,17. לאחרונה, SmFISH הוחל לכמת מספרי mRNA במצב לא יציב, מיד לאחר אינדוקציה או דיכוי של ביטוי גנים ב E. coli18,19,20. השינויים הזמניים במספרי עותק mRNA המוחלט שימשו לאחר מכן לחישוב קצב אתחול שעתוק, ההתארה, וסיום, כמו גם את קצב ההשפלה mRNA. עבור יישום זה, הליכי SmFISH קונבנציונליים יכולים להיות מסורבלים כי ישנן דגימות רבות, כל אחד מייצג נקודת זמן אחת, כי צריך לעבור שלבים חילופי מאגר מרובים (כלומר, צנטריפוגציה ושטיפה). כאן, אנו מתארים פרוטוקול smFISH, שבו שלבי טיפול מדגם הם פשטו באופן דרמטי על ידי כך שיש תאים דבוקים על פני השטח של כיסוי ועל ידי שאיפה נוזלים עם מערכת סינון ואקום14,19. באמצעות הביטוי lacZ ב- E. coli כדוגמה, זרימתהעבודה המלאה (איור 2)מדגימה, כולל ניתוח תמונה ( איור 3 ) המניב את הקינטיקה vivo של שעתוק(אתחול,התאווה וסיום) והשפלה mRNA, השתנות מתא לתא בביטוי mRNA, ומיקום mRNA. אנו צופים כי הפרוטוקול ישים באופן נרחב לבדיקה בקינטיות vivo ויציקה של mRNAs אחרים במין חיידקים שונים.

probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization

פלואורסץ מולקולה אחת בהכלאה סיטו (smFISH) מאפשר לספור את המספר המוחלט של mRNAs בתאים בודדים. כאן, אנו מתארים יישום של smFISH כדי למדוד את שיעורי שעתוק והשפלה mRNA ב Escherichia קולי. כמו SmFISH מבוסס על תאים קבועים, אנו מבצעים smFISH בנקודות זמן מרובות במהלך ניסוי קורס זמן, כלומר, כאשר תאים עוברים שינויים מסונכרנים על אינדוקציה או דיכוי של ביטוי גנים. בכל נקודת זמן, תת-אזורים של mRNA הם ייחודיים ספקטרלית כדי לחקור את ההתארגה תמלול וסיום מוקדם. התוצאה של פרוטוקול זה מאפשרת גם ניתוח התאמה מקומית תאית של mRNAs והטרוגניות במספרי עותק mRNA בין תאים. באמצעות פרוטוקול זה דגימות רבות (~ 50) ניתן לעבד בתוך 8 שעות, כמו משך הזמן הדרוש רק כמה דגימות. אנו דנים כיצד להחיל פרוטוקול זה כדי ללמוד את התמלול והשפלה קינטיקה של mRNAs שונים בתאים חיידקיים.

Watch this Scientific Journal Video about Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

פרוטוקול זה מתאר יישום של פלואורסצנטיות מולקולה אחת בהכלאה situ (smFISH) כדי למדוד את הקינטיות vivo של סינתזה mRNA והשפלה.

חיטוט mRNA קינטיקה בחלל וזמן ב Escherichia קולי באמצעות שני צבעים פלואורסצנטיות מולקולה אחת ב סיטו הכלאה

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

smFISH ידוע במדידת המספר המוחלט כמיקום תת-תאי של mRNAs. פרוטוקול sMFISH שני הצבעים שלנו יש את היכולת הנוסף של מדידת הקינטיקה של שעתוק והשפלה mRNA. בשיטה זו, ניתן לעבד דגימות רבות בו זמנית ללא תוספת זמן או מאמץ.לדוגמה, ארבעה ניסויים בקורס זמן המניבים 48 דגימות יכולים להיות מעובדים להדמיה בשמונה שעות. הפרוטוקול שלנו ישים באופן נרחב עבור גנים רבים ומינים חיידקיים. כדי להכין תלושי כיסוי ושקופיות זכוכית לניסוי.השתמש מטליות למקם תלושי כיסוי ומחלקות בצנצנת Coplin המכיל 100% אתנול ולמקם את הצנצנת באמבט מים קולי לספק במשך 15 עד 20 דקות. בסוף sonication לשטוף את השקופיות לכסות מחליק שלוש עד ארבע פעמים עם מים טהורים במיוחד לפני מילוי הצנצנת עם 70% אתנול וחוזר על sonication. כאשר כל שלבי sonication נעשים, לייבש את הכיסוי מחליק ומחליק עם גז חנקן.מקם את מחליקי הכיסוי בתיבת קצה פיפיאט ריקה של 1000 מיקרוליטר והצב את השקופיות בתיבת שקופית נקייה. לאחר מכן, בעקבות החורים של תיבת קצה פיפטה להשתמש סמן הידרופובי לצייר עיגולים על תלושי הכיסוי ולהחיל טיפה 20 microliter של 0.1% פולי l לינזין על כל בארות אלה. כדי להקים ניסוי קורס זמן, להוסיף 750 microliters מתרבות E.coli 20 מיליליטר גדל אקספוננציאלית לצינור תרבות 1.5 מיליליטר מסומן זמן אפס.ומיד להפוך את הצינור. לגרום ביטוי LAC Z עם 0.2 כדי IPTG מילימולר אחד ולהתחיל טיימר. לאחר בדיקת שעון הזמן, לאסוף את תרבות התא בכל נקודת זמן ניסיונית רצופה כפי שהוכח רק.בנקודת הזמן המתאימה במהלך הניסוי, להוסיף חמישה מילימולרים ONPF לבקבוק כדי להדחיק את ביטוי LAC Z ולהמשיך לדגום את התרבויות כדי לעקוב אחר השפלה mRNA. בסוף קורס הזמן מדגם רכישה, הדגירה את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות ואחריו דגירה על קרח במשך 30 דקות. בסוף צנטריפוגת הדגירה הדגימות כדי להסיר את התיקון ולהשתמש פיפטה כדי להסיר את supernatant.להשעות מחדש את החיידקים במיליליטר אחד של DEPC PBS ולשטוף את התאים פעמיים נוספות במיליליטר אחד של PBS DEPC טרי לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, להשעות מחדש את התאים 30 microliters של PBS DEPC טרי. עבור חלחלה של התאים.ראשית להוסיף את המדגם מכל נקודת זמן ל בארות הידרופובי בודדות על אחד אתנול מעורק זכוכית מכסה מחליק. ולאפשר לתאים לדבוק בכיסוי עם דגירה של 10 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מוסיפים 15 מיקרוליטרים של 70% אתנול לכל באר.לאחר ארבע דקות, שאף את האתנול מכל באר, כך שה בארות יבשות לחלוטין. לאחר הכביסה מוסיפים 30 מיקרוליטרים של פתרון טרום הכלאה לכל באר של תאים מחלחלים, ו דגירה התאים במשך 30 דקות בתנור 37 מעלות צלזיוס. החלף את פתרון ההכלאה מראש עם כ 30 microliters של פתרון הכלאה בדיקה לכל באר.ולכסות את התא בנייר אלומיניום במשך שעתיים דגירה בתנור 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה להשתמש פיפטה רב ערוצית לשטוף את בארות שלוש עד חמש פעמים עם 30 microliters של פתרון לשטוף לגם לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, דגירה התאים במשך 15 עד 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני לשטוף את בארות חמש פעמים עם 30 microliters של PBS DEPC טרי לכל לשטוף.לאחר הכביסה האחרונה, שאפו את כל הנוזלים מהכיסוי. ולהוסיף ארבעה microliters של PBS DEPC טרי לכל באר. השתמש מדפים כדי למקם בזהירות את המכסה להחליק על שקופית זכוכית מעקרת אתנול בצד למטה, ולהשתמש מסטיק שיניים סיליקון כדי לאטום את הקצוות של החלקת המכסה.כדי לאתר אזור מעניין, בחר את המצב החי של הדמיית ניגודיות פאזה ותמרן את מוט ההיגוי של הבמה כדי לשנות את שדה המבט בתוך באר. ממוקם באזור שבו צפיפות התאים אופטימלית והתאם את מוקד Z כך שתמונות תא ניגוד הפאזה נמצאות במוקד. לאחר מכן רכשו תמונה C five עם חשיפה של ארבע שניות, תמונת C שלוש עם חשיפה של שתי שניות ותדמית ניגודיות פאזה עם חשיפה של 0.2 שניות לכ-10 אזורים שונים ל הבאר.לחלופין, ניתן להפעיל רכישה של NDI שבה תמונות C חמש, C שלוש וחדות פאזה נרכשות בסדרות. לאחר הדמיה של כל הבארות, פתחו כלי פילוח תאים מתאים ולחץ על מחסנית. טען את תמונות ניגודיות הפאזה מעניינות ובחר מסגרות עצמאיות ולחץ על מ לחשב את פרופיל הפאזה כאפס.כדי להתחיל את תהליך הפילוח שבמהלכו יזהו את התאים ויחושבו קווי המתאר שלהם. טען את הפרמטרים המופיעים בתיקיה GitHub ולחץ על כל המסגרות. בסוף העיבוד בחר מיתאר כדי להמחיש את רשת שינוי.לאחר מכן, תחת לשונית זיהוי ספוט, בטל את הסימון של מחסנית, בדוק רשתות שינוי ולחץ על שפשוף כדי להתחיל בזיהוי הנקודה וכימות בהתבסס על שני המדידות של D Gaussian. בחר את התיקיה המכילה את התמונות הפלואורסצנטיות ואת קובץ רשת שינוי שחושב זה הרגע מתוך הליך זיהוי התאים וציין את שם הקובץ שאליו יישמרו תוצאות זיהוי הספוט. לאחר מכן השתמש בזרימת העבודה של ניתוח התמונה המסופקת ב- GitHub כדי לנתח את תמונות הפלואורסצנטיות.בשדה מלא זה של תצוגה כ 500 תאי E.coli בצפיפות טובה עבור פילוח התא ניתן לראות. המורפולוגיה של התאים בתמונות ניגודיות הפאזה צריכה להישאר דומה לזו של תאים חיים למטרות פילוח. אם התאים מחלחלים יתר על כן, המורפולוגיה שלהם תהפוך לבלתי מתאימה לפילוח.ההתפלגות של כתמי נקודה lac Z mRNA לפני אינדוקציה אינה מתאימה היטב עם הפצה נורמלית או פואסון בשל נוכחותם של כתמים עם התעצמויות גבוהות. כאשר הביטוי של lac Z הוא המושרה האות של חמישה mRNA X lac פריים עולה לפני שלוש האות העיקרי Lac Z mRNA עולה. אם הביטוי של Lac Z מודחק הן חמשת ושלושת אותות ה-MRNA המובילים של Lac Z פוחתים.כדי להשיג את קצב התארכות התמלול, עלייתם של חמשת ושלושת האותות המובילים מתאימים לקווים. בעוד שיעור השפלה mRNA מתקבל על ידי התאמת אזור הריקבון עם פונקציה מעריכית. מכיוון שדג מולקולה בודדת הוא טכניקה של תא יחיד, ניתן לנתח גם את השונות בין התא לתאים בתעתיק.בנוסף, ניתוח של colocalization של חמישה פריים ושלושה פריים Lac Z mRNA מאפשר את הצפיפות של פולימראזים RNA על הגן Lac Z להיות מכומת. כמו דגימות מנקודות זמן שונות מטופלים בו זמנית במהלך הליך זה. חשוב לשמור על הדגימה מופרדת בזמן שהם בצינורות ועל החלקת הכיסוי.באמצעות טכניקת מיקרוסקופיה חד-תאית זו של מולקולה בודדת. חוקרים יכולים כעת לחקור כיצד קינטיקה של שעתוק והשפלת mRNA קשורה למספרים המוחלטים או למיקומים התת-תאיים של mRNAs.

Research

JoVE Journal

Biology

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) פרוטוקול של זרע אדם

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

שימוש הר שלם באתרו הכלאה קישור לביולוגיה מולקולרית האורגניזם

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

מדידת קינטיקה של שעתוק mRNA בתאים חיים יחיד

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

זיהוי של רנ&quot;א נגיפי על ידי הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

שיטה פשוטה DNA הקרינה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה לכרומוזומים &quot;סתמת

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

תועלת רבה פנים של Co-ביטוי חלבון ב<em&gt; Coli Escherichia</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...