Name: probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2020-07-30T13:30:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

यह प्रोटोकॉल एस. के. द्वारा हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट और येल विश्वविद्यालय में माइक्रोबियल साइंसेज इंस्टीट्यूट में डॉ क्रिस्टीन जैकब्स-वैगनर की प्रयोगशाला में अपने पोस्टडॉक्टोरल शोध के दौरान विकसित किया गया था । हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पठन के लिए विधि विकास और लौरा ट्रॉयर के दौरान विभिन्न आदानों के लिए डॉ जैकब्स-वैगनर और उनके लैब सदस्यों को धन्यवाद देते हैं । एस. के. Searle विद्वानों कार्यक्रम से समर्थन स्वीकार करते हैं; केवी इलिनोइस विश्वविद्यालय से जेम्स स्कॉलर प्रीबल रिसर्च अवार्ड के समर्थन को स्वीकार करते हैं ।

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लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

यहां, हम ई. कोलाईमें mRNA काइनेटिक्स को मापने के लिए एक smfish प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया । बैक्टीरिया23के लिए पहले प्रकाशित smfish प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं को प्रोटोकॉल के अंत तक ट्यूबों में रखा गया था, कि जब तक वे इमेजिंग के लिए तैयार हैं । हालांकि इसके कई लाभ हैं, जैसे कि कवरस्लिप सतह23पर फ्लोरोसेंट जांच के न्यूनतम गैर-विशिष्ट बाध्यकारी, जब एक समय-पाठ्यक्रम प्रयोग से कई नमूने होते हैं तो इन प्रोटोकॉल का पालन करना मुश्किल होता है। सबसे पहले, कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा (>1 mL) के लिए नमूना और यहां तक कि निर्धारण से पहले काटा जाना चाहिए । दूसरा, सेल नमूनों को समाधान का आदान-प्रदान करने और संकरण कदम के बाद धोने के लिए कई बार अपकेंद्री करने की आवश्यकता है । हमारे प्रोटोकॉल में, संस्कृति की एक छोटी मात्रा (<1 एमएल) सीधे एक १.५-एमएल ट्यूब में एक फिक्सिंग समाधान के साथ मिलाया जाता है, जो नमूने के समय सेल राज्य को जल्दी से "फ्रीज" करने में मदद करता है। इसके अलावा, कोशिकाएं पूरी प्रक्रिया में सतह से जुड़ी रहती हैं, और वैक्यूम फिल्ट्रेशन सिस्टम के साथ तरल पदार्थों को एस्पिरेशन करके और मल्टी-चैनल पिपेट के साथ एक बार में समाधान बूंदों को लागू करके विभिन्न समाधानों का आदान-प्रदान किया जा सकता है। यह अंतर हमारे प्रोटोकॉल को अत्यधिक लाभप्रद बनाता है जब बड़ी संख्या में नमूनों को एक बार में संसाधित करने की आवश्यकता होती है। हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, 12-48 नमूनों को एक साथ संभाला जा सकता है और पूरी मछली प्रक्रिया ~ 8 घंटे के भीतर पूरी की जा सकती है, कुछ नमूनों(चित्रा 2)के लिए आवश्यक समय की एक समान राशि के बारे में। यद्यपि हमने एक उदाहरण के रूप में ई. कोलाई में लैक्ज़ की अभिव्यक्ति का उपयोग किया, प्रोटोकॉल नीचे चर्चा किए गए विचारों के साथ विभिन्न जीन और जीवाणु प्रजातियों पर व्यापक रूप से लागू होता है।
विभिन्न जीन के लिए, पहली बात पर विचार करने के लिए smfish जांच है । कोई भी ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच कर सकता है जो ब्याज के एमआरएनए(चित्र 1ए)13को टाइल करता है । इस "टाइलिंग" जांच दृष्टिकोण में, प्रत्येक जांच ~ 20 आधार लंबी है और 5 ' या 3 ' टर्मिनस पर एक फ्लोरोफोर के साथ लेबल । यह रणनीति सुविधाजनक है क्योंकि कोई आनुवंशिक हेरफेर की जरूरत नहीं है । वैकल्पिक रूप से, ~ 20 बीपी अनुक्रम का एक मिलकर दोहराने, जीनोमिक अनुक्रम के लिए विदेशी (उदाहरण के लिए, Caulobacter वर्धमान14में लाको अनुक्रम की एक सरणी), ब्याज की एक जीन के अअनुवादित क्षेत्र में डाला जा सकता है और दोहराने इकाई के लिए एक एकल जांच पूरक mRNA लेबल ("सरणी" दृष्टिकोण; चित्रा 1B)। दोनों ही मामलों में, कई फ्लोरोफोरस एक एमआरएनए को सजाते हैं, जो परिलक्षित फ्लोरेसेंस संकेत देते हैं जिसे आसानी से एक कोशिका के अंदर गैर-विशिष्ट रूप से बंधे एक जांच से अलग किया जा सकता है।
"टाइलिंग" या "सरणी" दृष्टिकोण चुनना है या नहीं, यह नकारात्मक नियंत्रण पर निर्भर करता है, एक नमूना जहां जांच के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी का परीक्षण किया जाता है क्योंकि इसमें लक्ष्य एमआरएनए का अभाव है। टाइलिंग जांच(चित्रा 1A),ब्याज या एक शर्त के जीन के बिना एक उत्परिवर्ती तनाव के लिए, जिसमें जीन लिखित नहीं है (जैसे, lacZके दमन) जांच के गैर विशिष्ट बाध्यकारी परीक्षण के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम कर सकते हैं । सरणी-आधारित smfish(चित्रा 1B)के लिए, सरणी की कमी वाला एक जंगली प्रकार का तनाव नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम कर सकता है क्योंकि इसमें जांच के लिए बाध्यकारी साइटें शामिल नहीं हैं।
इष्टतम संकरण की स्थिति जांच दृश्यों और यहां तक कि फ्लोरोफोर रंगों की पसंद पर निर्भर हो सकती है। हमने संकरण तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखकर और संकरण समाधान में जांच सेट और फॉर्ममाइड की विभिन्न सांद्रता का परीक्षण करके लैक्ज़ जांच सेटों के लिए संकरण स्थिति को अनुकूलित किया। फॉर्मामाइड की अधिक सांद्रता गैर - विशिष्ट और विशिष्ट बाध्यकारी दोनों26,35को कम करती है । हम संकरण समय और तापमान को समान रखते हुए व्यवस्थित रूप से संकरण और इसकी धोने की स्थिति को बदलने की सलाह देते हैं। के रूप में हालत और अधिक कठोर हो जाता है, दोनों गैर विशिष्ट और विशिष्ट बाध्यकारी कमी(चित्रा 6)। यह एक बिंदु है जहां गैर विशिष्ट बाध्यकारी आगे विशिष्ट बाध्यकारी समझौता किए बिना एक स्वीकार्य दहलीज से नीचे हिट करने के लिए शुरू होता है खोजने के लिए महत्वपूर्ण है । उदाहरण के लिए, हमने बिना किसी जांच ("कोई जांच नहीं") के बिना प्राप्त सिग्नल स्तर का उपयोग एक सीमा(चित्र 6) केरूप में किया।
एक एमआरएनए के दो अलग-अलग क्षेत्रों को लेबल करने वाली दो रंग की स्मफिश विधि लंबे जीन तक सीमित है। प्रतिलेखन विस्तार की दर को मापने के लिए, हमने इस तथ्य का लाभ उठाया कि लैक्ज़ लंबा (3075 बीपी) है और इसकी अभिव्यक्ति आईपीटीजी द्वारा प्रेरित की जा सकती है। जब एक जीन कम होता है, तो दो टाइलिंग प्रोब सेट (5' और 3 ' सिरों के पास) डिजाइन करना मुश्किल होता है और 5 ' बनाम 3 ' एमआरएनए क्षेत्रों के दिखावे के बीच समय की देरी को हल करना मुश्किल होता है । इस मामले में, कोई भी एसएमफिश द्वारा स्थिर स्थिति में नवजात mRNAs की गणना कर सकता है और एक विश्लेषणात्मक मॉडल के साथ उनके वितरण का विश्लेषण कर सकता है जिसमें एक फिटिंग पैरामीटर20के रूप में ट्रांसक्रिप्शन विस्तार की दर है। इसके अलावा, जब ब्याज का जीन अक्षुण्ण नहीं होता है, तो कोई भी समय शून्य पर रिफाम्पिकिन के साथ कोशिकाओं का इलाज कर सकता है और 5 ' और 3 ' mRNA उप-क्षेत्रों में लौकिक परिवर्तन को माप सकता है । 5 एमआरएनए सिग्नल की कमी से 3 ' एमआरएनए सिग्नल की कमी से देरी का उपयोग पहले31के अनुसार प्रतिलेखन विस्तार की दर की गणना करने के लिए किया जा सकता है।
अंत में, smfish प्रोटोकॉल बहुमुखी है और अन्य लेबलिंग योजनाओं के साथ जोड़ा जा सकता है। इससे पहले, डीएनए लोकस को या तो डीएनए फिश14 या फ्लोरोसेंट रिपोर्टर-ऑपरेटर सिस्टम20के साथ एमआरएनए फिश के संयोजन से mRNAs के साथ एक साथ कल्पना की गई थी । एमआरएनए फिश14,36के साथ मिलकर इम्यूनोफ्लोरेसेंस करके प्रोटीन उत्पादों की कल्पना की जा सकती है । इसके अलावा, इसे तीन आयामी सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी37 के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि तीनों आयामों38,,39में आरएएनए की कल्पना की जा सके।

डीएनए से एमआरएनए और प्रोटीन तक आनुवंशिक जानकारी का प्रवाह सबसे मौलिक सेलुलर प्रक्रियाओं में से एक है, जिसका विनियमन सेलुलर फिटनेस1के लिए महत्वपूर्ण है। एक कोशिका में mRNAs की संख्या दो गतिशील प्रक्रियाओं, प्रतिलेखन, और mRNA गिरावट द्वारा निर्धारित किया जाता है। हालांकि, कैसे प्रतिलेखन और mRNA गिरावट समय में विनियमित कर रहे है और एक ही कोशिका के स्थान पूरी तरह से समझ में नहीं आता है, मोटे तौर पर प्रयोगात्मक तरीकों की कमी के कारण मात्रात्मक रूप से वीवो में अपने काइनेटिक्स को मापने के लिए ।
कोशिकाओं की आबादी से निकाले गए कुल mRNAs के आधार पर विधियां, जैसे उत्तरी दाग, आरटी-पीसीआर, आरएनए अनुक्रमण, और जीन अभिव्यक्ति microarrays, एमआरएनए के स्तर में सापेक्ष अंतर को माप सकते हैं और व्यापक,रूप से ट्रांसक्रिप्शन विस्तार2,3,4,5 या एमआरएनए,क्षरण6, 7,7की दर की दर का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया गया है।, हालांकि, वे प्रति सेल एमआरएन की पूर्ण संख्या प्रदान नहीं करते हैं, और इसलिए, वे ट्रांसक्रिप्शन दीक्षा8की दर की जांच करने के लिए उपयुक्त नहीं हैं। इसके अलावा, क्योंकि mRNAs कोशिकाओं की आबादी से निकाले जाते हैं, एक ही कोशिका के भीतर mRNAs के स्थानिक वितरण और कोशिकाओं के बीच mRNA कॉपी संख्या की परिवर्तनशीलता मापा नहीं जा सकता है ।
व्यक्तिगत कोशिकाओं (scRNAseq) पर अगली पीढ़ी के आरएनए अनुक्रमण जीनोमिक स्केल9में प्रति सेल mRNAs की संख्या निर्धारित कर सकते हैं । हालांकि, नमूना तैयारी और उच्च लागत के साथ चुनौतियों के कारण ट्रांसक्रिप्शन काइनेटिक्स को मापने के लिए इस तकनीक का उपयोग करना मुश्किल बना हुआ है। विशेष रूप से, कम एमआरएनए बहुतायत10, 11,11के कारण बैक्टीरिया के लिए scRNAseq का आवेदन तकनीकी रूप से मुश्किल हो गया है।
सीटू संकरण (एसएमफिश) में एकल-अणु फ्लोरेसेंस फ्लोरोसेंटली-लेबल एकल-फंसे जांच के संकरण पर आधारित है जिनके दृश्य ब्याज12, 13,13के लक्ष्य एमआरएनए के पूरक हैं। अनुक्रम-विशिष्ट संकरण की अवधारणा उत्तरी दाग या आरटी-पीसीआर में उपयोग की जाने वाली है, लेकिन संकरण निश्चित कोशिकाओं के भीतर सीटू में किया जाता है, ताकि RNAs के मूल स्थानीयकरण को संरक्षित किया जा सके। एक एमआरएनए का संकेत कई जांचों का उपयोग करके परिलक्षित होता है, ~ 20 न्यूक्लियोटाइड (एनटी) लंबाई में, एक एमआरएनए(चित्रा 1A)13के विभिन्न हिस्सों में संकरण। इस "टाइलिंग" जांच दृष्टिकोण में, एक ही mRNA का पता लगाने के लिए आवश्यक जांच की संख्या mRNA की लंबाई है कि assayed जा सकता है पर एक कम सीमा सेट । वैकल्पिक रूप से, ब्याज की एमआरएनए को ट्रांसक्रिप्शनली रूप से टैंडेम लाख ऑपरेटर दृश्यों की एक गैर-कोडिंग सरणी में जोड़ा जा सकता है, जैसे कि फ्लोरोसेंटली लेबल वाली लैको प्रोब की कई प्रतियां एक एमआरएनए(चित्रा 1 बी)14के लिए संकरित होती हैं।
smfish स्थिर राज्य में प्रति सेल mRNAs की संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है (यानी, जब संश्लेषण और क्षय संतुलन में हैं) और जीवाणु कोशिकाओं के बीच mRNAs के मतलब और परिवर्तनशीलता का विश्लेषण करने के लिए15,16,,17।, हाल ही में, ई. कोलाई,18, 19,19,20में जीन अभिव्यक्ति के प्रेरण या दमन के ठीक बाद, गैर-स्थिर स्थिति में एमआरएनए संख्याओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए smfish लागू किया गया है । पूर्ण एमआरएनए कॉपी नंबरों में अस्थायी परिवर्तन तब ट्रांसक्रिप्शन दीक्षा, विस्तार और समाप्ति की दर की गणना करने के साथ-साथ एमआरएनए क्षरण की दर का उपयोग किया जाता था। इस आवेदन के लिए, पारंपरिक smfish प्रक्रियाओं बोझिल हो सकता है क्योंकि वहां कई नमूने हैं, प्रत्येक एक समय बिंदु का प्रतिनिधित्व करते हैं, कि कई बफर विनिमय कदम (यानी, अपकेंद्रित्र और धोने) के माध्यम से जाने की जरूरत है । यहां, हम एक स्मफिश प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसमें सेल को कवर्लिप की सतह का पालन करके और वैक्यूम निस्पंदन प्रणाली14, 19,के साथ तरल पदार्थ को प्राप्त करके नमूना हैंडलिंग चरणों को नाटकीय रूप से सरल बनायाजाताहै। एक उदाहरण के रूप में ई. कोलाई में लैक्ज़ की अभिव्यक्ति का उपयोग करते हुए, पूर्ण कार्यप्रवाह(चित्रा 2)का प्रदर्शन किया जाता है, जिसमें छवि विश्लेषण(चित्र 3)ट्रांसक्रिप्शन (दीक्षा, विस्तार, और समाप्ति) के वीवो काइनेटिक्स में उपज और एमआरएनए क्षरण, एमआरएनए अभिव्यक्ति में सेल-टू-सेल परिवर्तनशीलता, और एमआरएनए स्थानीयकरण शामिल है। हम आशा करते हैं कि प्रोटोकॉल विभिन्न बैक्टीरिया प्रजातियों में वीवो काइनेटिक्स और अन्य mRNAs के स्थानीयकरण में जांच के लिए व्यापक रूप से लागू होता है।

probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization

सीटू संकरण (एसएमफिश) में एकल-अणु फ्लोरेसेंस व्यक्तिगत कोशिकाओं में एमआरएएनए की पूर्ण संख्या की गणना करने की अनुमति देता है। यहां, हम एस्चेरिचिया कोलाईमें प्रतिलेखन और एमआरएनए क्षरण की दरों को मापने के लिए smfish के एक आवेदन का वर्णन करते हैं। चूंकि स्मफिश निश्चित कोशिकाओं पर आधारित है, इसलिए हम एक समय-पाठ्यक्रम प्रयोग के दौरान कई समय बिंदुओं पर smfish प्रदर्शन करते हैं, यानी, जब कोशिकाएं जीन अभिव्यक्ति के प्रेरण या दमन पर सिंक्रोनाइज्ड परिवर्तनों से गुजर रही होती हैं। हर समय बिंदु पर, एक एमआरएनए के उप-क्षेत्रों को प्रतिलेखन विस्तार और समय से पहले समाप्ति की जांच करने के लिए स्पेक्ट्रैल रूप से प्रतिष्ठित किया जाता है। इस प्रोटोकॉल का परिणाम कोशिकाओं के बीच एमआरएएनए कॉपी नंबरों में mRNAs और विषमता के इंट्रासेलुलर स्थानीयकरण का विश्लेषण करने की भी अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके कई नमूनों (~ 50) को 8 घंटे के भीतर संसाधित किया जा सकता है, जैसे कि कुछ नमूनों के लिए आवश्यक समय की मात्रा। हम चर्चा करते हैं कि बैक्टीरियल कोशिकाओं में विभिन्न mRNAs के प्रतिलेखन और क्षरण गतिज का अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल को कैसे लागू किया जाए।

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Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

यह प्रोटोकॉल एमआरएनए संश्लेषण और क्षरण के वीवो काइनेटिक्स को मापने के लिए सीटू संकरण (एसएमफिश) में एकल-अणु फ्लोरेसेंस के अनुप्रयोग का वर्णन करता है।

सीटू संकरण में दो रंग एकल अणु फ्लोरेसेंस का उपयोग करके एस्चेरिचिया कोलाई में अंतरिक्ष और समय में एमआरएनए काइनेटिक्स की जांच करना

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

smfish mRNAs के उप सेलुलर स्थान के रूप में निरपेक्ष संख्या को मापने के लिए जाना जाता है । हमारे दो रंग sMFISH प्रोटोकॉल प्रतिलेखन और mRNA गिरावट के काइनेटिक्स को मापने की जोड़ा क्षमता है । इस विधि का उपयोग करके, अतिरिक्त समय या प्रयास के बिना कई नमूनों को एक साथ संसाधित किया जा सकता है।उदाहरण के लिए, 48 नमूनों को उत्पील्ड करने वाले चार समय के पाठ्यक्रम प्रयोगों को आठ घंटे में इमेजिंग के लिए संसाधित किया जा सकता है। हमारा प्रोटोकॉल मोटे तौर पर कई जीन और बैक्टीरियल प्रजातियों के लिए लागू होता है । प्रयोग के लिए कवर स्लिप और ग्लास स्लाइड तैयार करना।100% इथेनॉल वाले कॉप्लिन जार में कवर स्लिप और स्लाइड रखने के लिए संदंश का उपयोग करें और जार को 15 से 20 मिनट तक पानी के स्नान अल्ट्रासोनिक में रखें। सोनीशन के अंत में स्लाइड धोएं और 70% इथेनॉल के साथ जार को रिफिल करने और सोनीशन को दोहराने से पहले अल्ट्रा प्योर पानी के साथ तीन से चार बार स्लाइड को कवर करें। जब सभी सोनिकेशन कदम हो जाएं, तो कवर स्लिप और स्लाइड को नाइट्रोजन गैस से सुखा लें।कवर स्लिप को एक खाली 1000 माइक्रोलिटर पिपेट टिप बॉक्स में रखें और स्लाइड्स को एक साफ स्लाइड बॉक्स में रखें। फिर, पिपेट टिप बॉक्स के छेद के बाद कवर स्लिप पर हलकों को आकर्षित करने के लिए हाइड्रोफोबिक मार्कर का उपयोग करें और इन कुओं में से प्रत्येक के लिए 0.1% पॉली एल लिसाइन की 20 माइक्रोलीटर ड्रॉप लागू करें। एक समय पाठ्यक्रम प्रयोग स्थापित करने के लिए, एक 20 मिलीलीटर तेजी से बढ़ रही ई.कोलाई संस्कृति से 1.5 मिलीलीटर संस्कृति ट्यूब के लिए 750 माइक्रोलीटर जोड़ें जो समय शून्य के रूप में चिह्नित है।और तुरंत ट्यूब उलटा। 0.2 से एक मिलीमोलर आईपीटीजी के साथ लाख जेड अभिव्यक्ति को प्रेरित करें और एक टाइमर शुरू करें। टाइमर की जांच करने के बाद, प्रत्येक लगातार प्रयोगात्मक समय बिंदु पर सेल संस्कृति को इकट्ठा करें जैसा कि सिर्फ प्रदर्शन किया गया था।प्रयोग के दौरान उचित समय बिंदु पर, लाख जेड अभिव्यक्ति को दबाने के लिए फ्लास्क में पांच मिलीमोलर ओपीएफ जोड़ें और एमआरएनए क्षरण को ट्रैक करने के लिए संस्कृतियों का नमूना जारी रखें। समय पाठ्यक्रम नमूना अधिग्रहण के अंत में, 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूनों को इनक्यूबेट और 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेशन के बाद । इनक्यूबेशन के अंत में फिक्सेटिव को हटाने के लिए नमूनों को अपकेंद्रित्र करें और सुपरनेट को हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।डीईपीसी पीबीएस के एक मिलीलीटर में बैक्टीरिया को फिर से निलंबित करें और प्रति वॉश ताजा डीईपीसी पीबीएस के एक मिलीलीटर में कोशिकाओं को दो बार और धोएं। अंतिम धोने के बाद, ताजा डीईपीसी पीबीएस के 30 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं के पारमेबिलाइजेशन के लिए।सबसे पहले हर बार से नमूना जोड़ें इथेनॉल निष्फल ग्लास कवर स्लिप में से एक पर व्यक्तिगत हाइड्रोफोबिक कुओं के लिए बिंदु । और कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 10 से 30 मिनट की इनक्यूबेशन के साथ कवर स्लिप का पालन करने की अनुमति दें। इनक्यूबेशन के अंत में, प्रत्येक कुएं में 70% इथेनॉल के 15 माइक्रोलीटर जोड़ें।चार मिनट के बाद, प्रत्येक कुएं से इथेनॉल को एस्पिरेट करें ताकि कुएं पूरी तरह से सूख जाएं। धोने के बाद प्रत्येक कुएं में पूर्व संकरण समाधान के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें, और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में 30 मिनट तक इनक्यूबेट करें। पूर्व संकरण समाधान को जांच संकरण समाधान के लगभग 30 माइक्रोलीटर के साथ बदलें।और ३७ डिग्री सेल्सियस ओवन में एक दो घंटे इनक्यूबेशन के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ चैंबर को कवर । इनक्यूबेशन के अंत में एक बहु चैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए तीन से पांच बार धोने के समाधान के 30 माइक्रोलीटर के साथ धोने के समाधान के 30 माइक्रोलीटर प्रति अच्छी तरह से प्रति धोने कुल्ला । अंतिम धोने के बाद, प्रति वॉश ताजा डीईपीसी पीबीएस के 30 माइक्रोलीटर के साथ पांच बार कुओं को धोने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 से 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।अंतिम धोने के बाद, कवर स्लिप से सभी तरल को एस्पिरेट करें। और प्रत्येक अच्छी तरह से ताजा DEPC PBS के चार माइक्रोलीटर जोड़ें । कवर स्लिप को सावधानीपूर्वक एक इथेनॉल निष्फल ग्लास स्लाइड नमूना पक्ष पर रखने के लिए संदंश का उपयोग करें, और कवर स्लिप के किनारों को सील करने के लिए सिलिकॉन डेंटल गम का उपयोग करें।ब्याज के क्षेत्र का पता लगाने के लिए चरण कंट्रास्ट इमेजिंग के लाइव मोड का चयन करें और एक अच्छी तरह से भीतर देखने के क्षेत्र को बदलने के लिए मंच जॉयस्टिक पैंतरेबाज़ी करें। एक ऐसा क्षेत्र स्थित जिसमें सेल घनत्व इष्टतम है और जेड फोकस को समायोजित करें जैसे कि चरण विपरीत सेल छवियां फोकस में हैं। फिर चार सेकंड के एक्सपोजर के साथ सी पांच छवि प्राप्त करें, दो सेकंड के एक्सपोजर के साथ एक सी तीन छवि और लगभग 10 विभिन्न क्षेत्रों के लिए 0.2 सेकंड के एक्सपोजर के साथ एक चरण विपरीत छवि।वैकल्पिक रूप से, एक एनडीआई अधिग्रहण जिसमें सी पांच, सी तीन और चरण विपरीत छवियों श्रृंखला में अधिग्रहीत कर रहे है चलाया जा सकता है । जब सभी कुओं को चित्रित किया गया है, तो एक उपयुक्त सेल सेगमेंटेशन टूल खोलें, और स्टैक को खोलना। ब्याज के चरण विपरीत छवियों को लोड करें और स्वतंत्र फ्रेम का चयन करें और शून्य के रूप में गणना चरण प्रोफ़ाइल पर क्लिक करें।विभाजन प्रक्रिया शुरू करने के लिए जिसके दौरान कोशिकाओं की पहचान की जाएगी और उनकी रूपरेखा की गणना की जाएगी। गिटहब फोल्डर में दिए गए पैरामीटर लोड करें और सभी फ्रेम पर क्लिक करें। प्रसंस्करण के अंत में जाल की कल्पना करने के लिए समोच्च का चयन करें।इसके बाद, स्पॉट डिटेक्शन टैब के तहत, अनचेक स्टैक, पश की जांच करें और दो डी गॉसियन फिटिंग के आधार पर स्पॉट पहचान और मात्राकरण शुरू करने के लिए रगड़ पर क्लिक करें। फ्लोरोसेंट छवियों और जाल फ़ाइल वाले फ़ोल्डर का चयन करें जिसकी गणना सेल डिटेक्शन प्रक्रिया से की गई थी और फ़ाइल नाम को इंगित करता है जिससे स्पॉट डिटेक्शन परिणाम सहेजे जाएंगे। फिर फ्लोरेसेंस छवियों का विश्लेषण करने के लिए गिटहब पर प्रदान किए गए छवि विश्लेषण कार्यप्रवाह का उपयोग करें।देखने के इस पूरे क्षेत्र में लगभग 500 ई.कोलाई कोशिकाओं सेल विभाजन के लिए एक अच्छा घनत्व पर मनाया जा सकता है. चरण विपरीत छवियों में कोशिकाओं की आकृति विज्ञान विभाजन उद्देश्यों के लिए जीवित कोशिकाओं की तुलना में रहना चाहिए। यदि कोशिकाएं अधिक हो जाती हैं, तो उनकी आकृतिकरण विभाजन के लिए अनुपयुक्त हो जाएगी।इंडक्शन से पहले लाख जेड एमआरएनए स्पॉट तीव्रता का वितरण उच्च तीव्रता वाले स्थानों की उपस्थिति के कारण सामान्य या पॉइसन वितरण के साथ अच्छी तरह से फिट नहीं होता है। जब लाख जेड की अभिव्यक्ति प्रेरित होती है तो तीन प्राइम लाख जेड एमआरएनए सिग्नल बढ़ने से पहले पांच प्राइम लाख जेड एमआरएनए का सिग्नल बढ़ जाता है। यदि लाख जेड की अभिव्यक्ति का दमन किया जाता है तो पांच और तीन प्राइम लाख जेड एमआरएनए सिग्नल दोनों कम हो जाते हैं।प्रतिलेखन विस्तार की दर प्राप्त करने के लिए, पांच और तीन प्रमुख संकेतों का उदय लाइनों के साथ फिट हैं। जबकि एमआरएनए क्षरण की दर घातीय कार्य के साथ क्षय क्षेत्र को फिट करके प्राप्त की जाती है। क्योंकि एकल अणु मछली एक एकल कोशिका तकनीक है, प्रतिलेखन में सेल से सेल वेरिबिलिटी का भी विश्लेषण किया जा सकता है।इसके अलावा, पांच प्राइम और तीन प्राइम लाख जेड एमआरएनए के कोलोकैलाइजेशन का विश्लेषण लाख जेड जीन पर आरएनए पॉलीमरेसेस के घनत्व को मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है । चूंकि इस प्रक्रिया के दौरान विभिन्न समय बिंदुओं से नमूनों को एक साथ संभाला जाता है। यह नमूना अलग रखने के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि वे ट्यूबों में और कवर पर्ची पर कर रहे हैं ।इस एकल अणु एकल कोशिका माइक्रोस्कोपी तकनीक का उपयोग करना। शोधकर्ता अब यह पता लगा सकते हैं कि कैसे प्रतिलेखन और mRNA क्षरण काइनेटिक्स पूर्ण संख्या या mRNAs के उपकोशिकीय स्थानों से संबंधित हैं ।

Research

JoVE Journal

Biology

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