Name: probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2020-07-30T13:30:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Questo protocollo è stato sviluppato da S.K. durante la sua ricerca post-dottorato nel laboratorio della dott.ssa Christine Jacobs-Wagner presso l'Howard Hughes Medical Institute e il Microbial Sciences Institute dell'Università di Yale. Ringraziamo il Dr. Jacobs-Wagner e i suoi membri del laboratorio per vari input durante lo sviluppo del metodo e Laura Troyer per la lettura critica del manoscritto. S.K. riconosce il sostegno del Searle Scholars Program; K.V. riconosce il sostegno del James Scholar Preble Research Award dell'Università dell'Illinois.

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Qui, abbiamo presentato un protocollo smFISH per misurare la cinetica dell'mRNA in E. coli. Nei protocolli smFISH pubblicati in precedenza per i batteri23, le cellule sono state tenute nei tubi fino alla fine del protocollo, vale a di qui fino a quando non sono pronte per l'imaging. Anche se ha molti vantaggi, come l'associazione minima non specifica di sonde fluorescenti sulla superficie coverslip23, è difficile seguire questi protocolli quando ci sono molti campioni da un esperimento di corso di tempo. In primo luogo, un volume relativamente grande di cellule (>1 mL) deve essere campionato e persino raccolto prima della fissazione. In secondo luogo, i campioni di cellule devono essere centrifugati più volte per scambiare soluzioni e lavarsi dopo la fase di ibridazione. Nel nostro protocollo, un piccolo volume (<1 mL) di coltura viene direttamente miscelato con una soluzione di fissaggio in un tubo da 1,5 mL, contribuendo a "congelare" rapidamente lo stato della cella al momento del campionamento. Inoltre, le cellule rimangono attaccate alla superficie per tutta la procedura e diverse soluzioni possono essere scambiate rapidamente aspirando liquidi con un sistema di filtrazione del vuoto e applicando gocce di soluzione contemporaneamente con una pipetta multicanale. Questa differenza rende il nostro protocollo altamente vantaggioso quando un gran numero di campioni devono essere elaborati contemporaneamente. Utilizzando il nostro protocollo, 12-48 campioni possono essere gestiti contemporaneamente e l'intera procedura FISH può essere completata entro 8 ore, circa una quantità di tempo simile necessaria per alcuni campioni (Figura 2). Anche se abbiamo usato come esempio l'espressione di lac in E. coli, il protocollo è ampiamente applicabile a diversi geni e specie batteriche con considerazioni discusse di seguito.
Per i diversi geni, la prima cosa da considerare sono le sonde smFISH. Si possono progettare sonde oligonucleotide che affiancare l'mRNA di interesse (Figura 1A)13. In questo approccio di sonda "piastrellante", ogni sonda è lunga 20 dollari ed etichettata con un fluoroforo al capolinea 5' o 3'. Questa strategia è conveniente in quanto non è necessaria alcuna manipolazione genetica. In alternativa, una ripetizione tandem della sequenza di 20 bp, estranea alla sequenza genomica (ad esempio, una matrice di sequenza lacO in Caulobacter crescentus14), può essere inserita nella regione non tradotta di un gene di interesse e una singola sonda complementare all'unità di ripetizione viene utilizzata per etichettare l'mRNA (approccio "array"; Figura 1B). In entrambi i casi, più fluorofori decorano un mRNA, dando segnale di fluorescenza amplificato che può essere facilmente differenziato da una singola sonda legata in modo non specifico all'interno di una cellula.
La scelta di approcci "affiancamento" o "array" dipende dal controllo negativo, un campione in cui viene testata l'associazione non specifica delle sonde perché manca dell'mRNA di destinazione. Per le sonde di affiancamento (Figura 1A), un ceppo mutante senza il gene di interesse o una condizione, in cui il gene non è trascritto (ad esempio, la repressione del lac) può servire come controllo negativo per testare il legame non specifico delle sonde. Per l'oggetto basato su matrice ( ), un ceppo di tipo selvatico privo della matrice può fungere da controllo negativo perché non contiene siti di associazione per i probe.
Le condizioni di ibridazione ottimali possono dipendere dalle sequenze di sonda e persino dalla scelta dei coloranti fluoroforo. Abbiamo ottimizzato la condizione di ibridazione per i set di sonde lac, mantenendo la temperatura di ibridazione a 37 gradi centigradi e testando diverse concentrazioni di set di sonde e formamide nella soluzione di ibridazione. Concentrazioni più elevate di formamide tendono a ridurre sia l'associazione non specifica che la specificaassociazione 26,35. Si consiglia di cambiare sistematicamente l'ibridazione e le sue condizioni di lavaggio mantenendo lo stesso tempo di ibridazione e temperatura. Man mano che la condizione diventa più rigorosa, diminuiscono sia l'associazione non specifica che la diminuzione dell'associazione (Figura 6). È importante trovare un punto in cui l'associazione non specifica inizia a raggiungere al di sotto di una soglia accettabile senza compromettere ulteriormente l'associazione specifica. Ad esempio, è stato utilizzato il livello di segnale ottenuto senza sonde ("nessuna sonda") come soglia (Figura 6).
Il metodo smFISH a due colori che etichetta due regioni separate di un mRNA è limitato a geni lunghi. Per misurare il tasso di allungamento della trascrizione, abbiamo approfittato del fatto che la lac è lunga (3075 bp) e la sua espressione può essere indotta da IPTG. Quando un gene è breve, è difficile progettare due set di sonde di affiancamento (vicino a 5' e 3' estremità) e risolvere il ritardo di tempo tra le apparizioni di regioni di mRNA da 5' e 3'. In questo caso, si possono contare gli mRNA nascenti allo stato costante di smFISH e analizzarne la distribuzione con un modello analitico con il tasso di allungamento della trascrizione come parametrodi adattamento 20. Inoltre, quando un gene di interesse non è inducibile, si possono trattare le cellule con rifampicina al momento zero e misurare il cambiamento temporale nelle sottosocieti di mRNA 5' e 3'. Il ritardo dalla diminuzione del segnale mRNA di 5' a quello del segnale mRNA 3' può quindi essere utilizzato per calcolare il tasso di allungamento della trascrizione come fatto inprecedenza 31.
Infine, il protocollo smFISH è versatile e può essere combinato con altri schemi di etichettatura. In precedenza, il locus del DNA è stato visualizzato insieme agli mRNA combinando mRNA FISH con DNA FISH14 o sistema fluorescente reporter-operatore20. I prodotti proteici possono essere visualizzati eseguendo l'immunofluorescenza insieme all'mRNA FISH14,36. Inoltre, può essere combinato con la microscopia tridimensionale super-risoluzione37 per visualizzare gli mRNA in tutte e tre ledimensioni 38,39.

Il flusso di informazioni genetiche dal DNA all'mRNA e alle proteine è uno dei processi cellulari più fondamentali, la cui regolazione è importante per la forma fisicacellulare 1. Il numero di mRNA in una cella è determinato da due processi dinamici, la trascrizione e la degradazione dell'mRNA. Tuttavia, il modo in cui la trascrizione e la degradazione dell'mRNA sono regolate nel tempo e nello spazio di una singola cellula non rimane completamente compreso, in gran parte a causa della carenza di metodi sperimentali per misurare quantitativamente la loro cinetica in vivo.
I metodi basati su mRNA totali estratti da una popolazione di cellule, come Northern blot, RT-PCR, RNA sequencing e microarray di espressione genica, possono misurare la differenza relativa nei livelli di mRNA e sono stati ampiamente utilizzati per analizzare il tasso di allungamento della trascrizione2,3,4,5 o il tasso di degradazione dell'mRNA6,7. Tuttavia, non forniscono il numero assoluto di mRNA per cellula e, di conseguenza, non sono adatti per sondare il tasso di iniziazione della trascrizione8. Inoltre, poiché gli mRNA vengono estratti da una popolazione di cellule, la distribuzione spaziale degli mRNA all'interno di una singola cellula e la variabilità dei numeri di copia dell'mRNA tra le cellule non possono essere misurati.
Il sequenziamento dell'RNA di nuova generazione su singole cellule (scRNAseq) può quantificare il numero di mRNA per cellula in una scala genomica9. Tuttavia, rimane difficile utilizzare questa tecnica per misurare la cinetica della trascrizione, a causa di sfide con la preparazione del campione e il costo elevato. In particolare, l'applicazione di scRNAseq ai batteri è stata tecnicamente difficile a causa della bassa abbondanza di mRNA10,11.
La fluorescenza a singola molecola in situ ibridazione (smFISH) si basa sull'ibridazione di sonde a singolo filamento etichettate fluorescente le cui sequenze sono complementari all'mRNA di destinazionedi interesse 12,13. Il concetto di ibridazione specifica della sequenza è simile a quello utilizzato in Northern blot o RT-PCR, ma l'ibridazione viene eseguita in situ all'interno di celle fisse, per preservare la localizzazione nativa degli mRNA. Il segnale di un singolo mRNA viene amplificato utilizzando molte sonde, 20 nucleotidi (nt) di lunghezza, ibridando in diverse parti di un mRNA (Figura 1A)13. In questo approccio di sonda "piastrella", il numero di sonde necessarie per rilevare un singolo mRNA imposta un limite inferiore alla lunghezza dell'mRNA che può essere analizzato. In alternativa, l'mRNA di interesse può essere scritratto in una matrice non codificante di sequenze di operatori lac tandem, in modo che più copie di una sonda lacO fluorescente si ibride in un singolo mRNA (Figura 1B)14.
smFISH è stato utilizzato per quantificare il numero di mRNA per cellula a stato costante (cioè, quando la sintesi e il decadimento sono in equilibrio) e per analizzare la media e la variabilità degli mRNA tra le cellule batteriche15,16,17. Recentemente, smFISH è stato applicato per quantificare i numeri di mRNA allo stato non stabile, subito dopo l'induzione o la repressione dell'espressione genica in E. coli18,19,20. Le variazioni temporali nei numeri di copia dell'mRNA assoluto sono state quindi utilizzate per calcolare il tasso di iniziazione della trascrizione, allungamento e terminazione, nonché il tasso di degradazione dell'mRNA. Per questa applicazione, le procedure smFISH convenzionali possono essere ingombranti perché ci sono molti campioni, ognuno dei quali rappresenta un punto di tempo, che devono passare attraverso più passaggi di scambio di buffer (ad esempio, centrifugazione e lavaggio). Qui, descriviamo un protocollo smFISH, in cui le fasi di movimentazione del campione sono notevolmente semplificate avendo cellule aderenti alla superficie di un coverslip e aspirando liquidi con un sistema di filtrazione del vuoto14,19. Utilizzando come esempio l'espressione di lac in E. coli, viene dimostrato il flusso di lavoro completo (Figura 2), inclusa l'analisi dell'immagine (Figura 3) che produce la cinetica in vivo della trascrizione (iniziazione, allungamento e terminazione) e la degradazione dell'mRNA, la variabilità da cellula a cellula nell'espressione mRNA e la localizzazione dell'mRNA. Prevediamo che il protocollo è ampiamente applicabile per sondare cinetica in vivo e localizzazione di altri mRNA in varie specie di batteri.

probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization

La fluorescenza a singola molecola nell'ibridazione in situ (smFISH) consente di contare il numero assoluto di mRNA nelle singole cellule. Qui, descriviamo un'applicazione di smFISH per misurare i tassi di trascrizione e degradazione dell'mRNA in Escherichia coli. Poiché smFISH si basa su cellule fisse, eseguiamo smFISH in più punti di tempo durante un esperimento di corso nel tempo, cioè quando le cellule sono sottoposte a cambiamenti sincronizzati in caso di induzione o repressione dell'espressione genica. In ogni momento, le sotto-regioni di un mRNA sono spettralmente distinte per l'allungamento della trascrizione della sonda e la terminazione prematura. Il risultato di questo protocollo consente anche di analizzare la localizzazione intracellulare degli mRNA e l'eterogeneità nei numeri di copia dell'mRNA tra le cellule. Utilizzando questo protocollo è possibile elaborare molti campioni (50 USD) entro 8 h, come la quantità di tempo necessaria per pochi campioni. Discutiamo come applicare questo protocollo per studiare la trascrizione e la cinetica di degradazione di diversi mRNA nelle cellule batteriche.

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Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Questo protocollo descrive un'applicazione di fluorescenza a singola molecola in ibridazione situ (smFISH) per misurare la cinetica in vivo della sintesi e della degradazione dell'mRNA.

Sondare la cinetica dell'mRNA nello spazio e nel tempo in Escherichia coli utilizzando la fluorescenza a singola molecola a due colori in ibridazione situ

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

smFISH è noto per misurare il numero assoluto come posizione subcellulare degli mRNA. Il nostro protocollo sMFISH a due colori ha la capacità di misurare la cinetica della trascrizione e della degradazione dell'mRNA. Utilizzando questo metodo, molti campioni possono essere elaborati contemporaneamente senza tempi o sforzi aggiuntivi.Ad esempio, quattro esperimenti di corsi di tempo che producono 48 campioni possono essere elaborati per l'imaging in otto ore. Il nostro protocollo è ampiamente applicabile a molti geni e specie batteriche. Per preparare vetrini di copertura e vetrini per l'esperimento.Utilizzare le forcep per posizionare scivoli di copertura e scivoli in un barattolo coplin contenente 100% di etanolo e posizionare il barattolo in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 15-20 minuti. Al termine della sonicazione lavare gli scivoli e il coperchio scivola da tre a quattro volte con acqua ultra pura prima di riempire il barattolo con il 70% di etanolo e ripetere la sonicazione. Al termine di tutte le fasi di sonicazione, asciugare i coperchi e gli scivoli con gas azoto.Posizionare il coperchio scivola in una scatola di punta vuota di pipetta da 1000 microliter e posizionare le diapositive in una scatola scorrevole pulita. Quindi, seguendo i fori della scatola di punta della pipetta, utilizzare un marcatore idrofobico per disegnare cerchi sui coperchi e applicare una goccia di 20 microliter dello 0,1% di lisina poli l a ciascuno di questi pozzi. Per impostare un esperimento di corso del tempo, aggiungere 750 microlitri da una coltura E.coli in crescita esponenziale di 20 millilitri a un tubo di coltura da 1,5 millilitri contrassegnato con il tempo zero.E invertire immediatamente il tubo. Indurre l'espressione lac Z con IPTG da 0,2 a un millimolare e avviare un timer. Dopo aver controllato il timer, raccogliere la coltura cellulare in ogni punto di tempo sperimentale consecutivo come appena dimostrato.Nel momento appropriato durante l'esperimento, aggiungere cinque ONPF millimolare al pallone per reprimere l'espressione Z della lac e continuare a campionare le colture per tenere traccia della degradazione dell'mRNA. Al termine dell'acquisizione del campione del corso di tempo, incubare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti seguiti dall'incubazione sul ghiaccio per 30 minuti. Al termine della centrifugazione di incubazione i campioni per rimuovere il fissatore e utilizzare una pipetta per rimuovere il supernatante.Sospendere di nuovo i batteri in un millilitro di DEPC PBS e lavare le cellule altre due volte in un millilitro di PBS DEPC fresco per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, sospendere di nuovo le celle in 30 microlitri di PBS DEPC fresco. Per la permeabilità delle cellule.Per prima cosa aggiungi il campione da ogni punto di tempo ai singoli pozzi idrofobici su uno dei vetri sterilizzati a etanolo. E consentire alle cellule di aderire allo scivolo di copertura con un'incubazione da 10 a 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aggiungere 15 microlitri di 70% di etanolo a ciascun pozzo.Dopo quattro minuti, aspirare l'etanolo da ogni pozzo in modo che i pozzi siano completamente asciutti. Dopo il lavaggio aggiungere 30 microlitri di soluzione di pre ibridazione ad ogni pozzo di cellule permeabilizzate e incubare le cellule per 30 minuti in un forno a 37 gradi Celsius. Sostituire la soluzione di pre ibridazione con circa 30 microlitri di soluzione di ibridazione a sonda per pozzo.E coprire la camera con un foglio di alluminio per un'incubazione di due ore nel forno a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione utilizzare una pipetta multicanale per risciacquare i pozzi da tre a cinque volte con 30 microlitri di soluzione di lavaggio per pozzo per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare le cellule per 15-30 minuti a 37 gradi Celsius prima di lavare i pozzi cinque volte con 30 microlitri di PBS DEPC fresco per lavaggio.Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare tutto il liquido dallo scivolo di copertura. E aggiungere quattro microlitri di PBS DEPC fresco ad ogni pozzo. Utilizzare le forcep per posizionare con cura lo scivolamento del coperchio su un lato del campione di vetro sterilizzato a etanolo verso il basso e utilizzare gomma dentale in silicone per sigillare i bordi dello scivolo di copertura.Per individuare un'area di interesse, selezionare la modalità live di imaging a contrasto di fase e manovrare il joystick dello stadio per cambiare il campo visivo all'interno di un pozzo. Situato un'area in cui la densità cellulare è ottimale e regolare la messa a fuoco Z in modo che le immagini delle celle a contrasto di fase siano a fuoco. Quindi acquisire un'immagine C cinque con un'esposizione di quattro secondi, un'immagine C tre con un'esposizione di due secondi e un'immagine di contrasto di fase con un'esposizione di 0,2 secondi per circa 10 aree diverse per pozzo.In alternativa, è possibile eseguire un'acquisizione NDI in cui le immagini C cinque, C tre e di contrasto di fase vengono acquisite in serie. Una volta che tutti i pozzi sono stati imageati, aprire uno strumento di segmentazione delle celle appropriato e annullare il clic sulla pila. Caricare le immagini di contrasto di fase di interesse e selezionare fotogrammi indipendenti e fare clic sul profilo di fase di calcolo come zero.Per iniziare il processo di segmentazione durante il quale verranno identificate le celle e verranno calcolati i loro contorni. Caricare i parametri forniti nella cartella GitHub e fare clic su tutti i frame. Al termine dell'elaborazione, selezionate il contorno per visualizzare la mesh.Successivamente, sotto la scheda di rilevamento spot, deselezionare la pila, controllare le mesh e fare clic su strofinare per iniziare l'identificazione e la quantificazione del punto in base al raccordo gaussiano D. Selezionare la cartella contenente le immagini fluorescenti e il file mesh appena calcolato dalla procedura di rilevamento delle celle e indicare il nome del file in cui verranno salvati i risultati del rilevamento spot. Quindi usa il flusso di lavoro di analisi delle immagini fornito su GitHub per analizzare le immagini a fluorescenza.In questo campo visivo completo si possono osservare circa 500 cellule E.coli ad una buona densità per la segmentazione cellulare. La morfologia delle cellule nelle immagini di contrasto di fase dovrebbe rimanere paragonabile a quella delle cellule vive ai fini della segmentazione. Se le cellule sono sovra permeabili, la loro morfologia diventerà inadatta alla segmentazione.La distribuzione delle intensità del punto di mRNA Z lac prima dell'induzione non si adatta bene a una distribuzione normale o poisson a causa della presenza di macchie con elevate intensità. Quando l'espressione del lac Z è indotta il segnale di cinque mRNA Z lac primi aumenta prima che il segnale mRNA Z lac primo aumenti. Se l'espressione del lac Z viene repressa, entrambi i segnali di mRNA Z lac a cinque e tre primi diminuiscono.Per ottenere la velocità di allungamento della trascrizione, l'ascesa dei cinque e tre segnali primi è adatta alle linee. Mentre la velocità di degradazione dell'mRNA si ottiene adattando la regione di decadimento con una funzione esponenziale. Poiché il pesce a singola molecola è una tecnica a singola cellula, è anche possibile analizzare le variabilità da cellula a cellula nella trascrizione.Inoltre, l'analisi della colocalizzazione di cinque mRNA Z lac primi e tre primi permette di quantificare la densità delle RNA polimerasi sul gene Z laco. Poiché campioni provenienti da diversi punti di tempo vengono gestiti contemporaneamente durante questa procedura. È importante mantenere il campione separato mentre si trova nei tubi e sullo scivolo di copertura.Usando questa tecnica di microscopia a singola molecola a singola cellula. I ricercatori possono ora esplorare come la trascrizione e la cinetica della degradazione dell'mRNA siano correlate ai numeri assoluti o alle posizioni subcellulari degli mRNA.

Research

JoVE Journal

Biology

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