Name: probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2020-07-30T13:30:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

このプロトコルは、ハワード・ヒューズ医学研究所とイェール大学微生物科学研究所のクリスティーン・ジェイコブス・ワーグナー博士の研究室での博士研究員の間にS.K.によって開発されました。ジェイコブス・ワーグナー博士と研究室のメンバーに対し、メソッド開発中の様々なインプットと、原稿の批判的な読み取りについてローラ・トロイヤーに感謝します。S.K.はサール・スカラーズ・プログラムからの支援を認める。K.V.は、イリノイ大学のジェームズ・スカラー・プレブル・リサーチ・アワードの支援を認めています。

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著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

ここでは、大腸菌のmRNA運動を測定するためのsmFISHプロトコルを発表しました。以前に公開された細菌23のsmFISHプロトコルでは、細胞は、イメージングの準備ができるまで、プロトコルの最後までチューブに保持されていました。カバースリップ表面23上の蛍光プローブの非特異的結合の最小など多くの利点を有するが、時間経過実験から多くのサンプルがある場合には、これらのプロトコルに従うことは困難である。まず、比較的大量の細胞 (>1 mL) をサンプリングし、固定前に収穫する必要があります。第二に、細胞サンプルは、溶液を交換し、ハイブリダイゼーションステップ後に洗浄するために複数回遠心分離する必要があります。我々のプロトコルでは、培養液の小さな容積(<1 mL)が1.5mLチューブの固定溶液と直接混合され、サンプリングの瞬間に細胞状態を素早く「凍結」するのに役立ちます。また、細胞は手順全体を通して表面に付着したままで、異なる溶液は、真空ろ過システムで液体を吸引し、マルチチャネルピペットで一度に溶液滴を適用することによって迅速に交換することができます。この違いは、多数のサンプルを一度に処理する必要がある場合に、プロトコルを非常に有利にします。プロトコルを使用すると、12~48個のサンプルを同時に処理でき、FISHの手順全体を約8時間以内に完了できます(図2)。例として大腸菌におけるlacZの発現を例に用いたが、このプロトコルは、以下に考察する様々な遺伝子および細菌種に広く適用可能である。
異なる遺伝子については、最初に考慮すべき事項はsmFISHプローブです。1つは、目的のmRNAをタイルするオリゴヌクレオチドプローブを設計してもよい(図1A)13.この「タイリング」プローブアプローチでは、各プローブは~20塩基長であり、5'または3'末流部で蛍光色素で標識される。この戦略は、遺伝子操作が必要とされていないので便利です。あるいは、タンデム反復~20bp配列は、ゲノム配列に対して異質(例えば、コーロバクター三日月14日のlacO配列)、目的の遺伝子の非翻訳領域に挿入され、かつ、反復単位に相補的な単一のプローブがmRNA(「配列」アプローチ)に標識するために使用される。図1B)。いずれの場合も、複数の蛍光体がmRNAを飾り、細胞内に非特異的に結合した単一のプローブから容易に分化できる増幅蛍光シグナルを与える。
「タイル」または「アレイ」アプローチを選択するかどうかは、陰性制御に依存し、プローブの非特異的結合が標的mRNAを欠いているために試験されるサンプルである。タイリングプローブ(図1A)の場合、対象遺伝子または条件のない変異株は、遺伝子が転写されない(例えば 、lacZの抑制)プローブの非特異的結合を試験するための陰性制御として機能し得る。アレイベースのsmFISH(図1B)では、プローブの結合部位が含まれていないため、アレイを欠いた野生型のひずみは負のコントロールとして機能します。
最適なハイブリダイゼーション条件は、プローブ配列、さらにはフルオロフォア色素の選択に依存する可能性があります。37°Cのハイブリダイゼーション温度を保ち、ハイブリダイゼーション液中のプローブセットとフォルミドの異なる濃度をテストすることで、lacZプローブセットのハイブリダイゼーション条件を最適化しました。より高濃度のホルムアミドは、非特異的および特異的結合の両方を減少させる傾向がある26,,35.ハイブリダイゼーション時間と温度を同じに保ちながら、ハイブリダイゼーションとその洗浄条件を体系的に変更することをおすすめします。条件がより厳しくなるにつれて、非特異的および特異的結合の両方が減少する(図6)。非特異的結合が許容可能なしきい値を下回り始めるポイントを見つけることが重要です。たとえば、プローブなしで得られた信号レベル(「プローブなし」)をしきい値として使用しました(図6)。
mRNAの2つの別個の領域を標識する2色smFISH法は、長い遺伝子に限定される。転写伸びの速度を測定するために 、lacZ が長く(3075 bp)であり、その発現がIPTGによって誘導され得るという事実を利用した。遺伝子が短いとき、2つのタイリングプローブセット(5'と3'の端の近く)を設計し、5' と 3' mRNA 領域の出現の間の時間遅延を解決することは困難です。この場合、smFISHによって安定状態で新生mRNAを数え、転写率がフィッティングパラメータ20としてある解析モデルを用いて分布を分析することができる。また、目的の遺伝子が誘導できない場合、リフィンピシンを有する細胞を時間0で治療し、5'および3'mRNAサブ領域の時間変化を測定することができる。5'mRNAシグナルの減少から3'mRNAシグナルのそれへの遅延は、次いで、31以前に行われた転写伸びの速度を計算するために使用することができる。
最後に、smFISHプロトコルは汎用性があり、他のラベリングスキームと組み合わせることができます。以前は、DNAの遺伝子座をmRNA FISHとDNA FISH14または蛍光レポーターオペレータシステム20と組み合わせることにより、mRNAと共に可視化した。タンパク質産物は、mRNA FISH14,36,36と共に免疫蛍光を行うことによって可視化され得る。また、3次元超解像顕微鏡37と組み合わせることで、3次元38、39の全ての3次元でmRNAを可視化することができる。39

DNAからmRNAおよびタンパク質への遺伝情報の流れは、細胞の適合性にとってその調節が重要である最も基本的な細胞プロセスの1つである。細胞内のmRNAの数は、2つの動的プロセス、転写、およびmRNA分解によって決定されます。しかし、単一の細胞の時間と空間における転写およびmRNA分解がどのように調節されているかは、主に生体内でのそれらの動力学を定量的に測定する実験方法の不足のために、完全には理解されていない。
ノーザンブロット、RT-PCR、RNAシーケンシング、遺伝子発現マイクロアレイなどの細胞集団から抽出された総mRNAに基づく方法は、mRNAレベルの相対的な差を測定することができ、転写伸長率2、3、4、53,4,5またはmRNA分解率66、77を分析するために広く使用されている。しかし、それらは細胞あたりのmRNAの絶対数を提供しない、したがって、彼らは転写開始率8を調査するのに適していない。また、mRNAは細胞集団から抽出されるため、単一細胞内のmRNAの空間分布や細胞間のmRNAコピー数の変動性を測定することはできません。
個々の細胞に対する次世代RNAシーケンシング(scRNAEq)は、ゲノムスケール9における細胞当たりのmRNA数を定量することができる。しかし、サンプル調製と高コストの課題により、転写動態を測定するためにこの技術を使用することは依然として困難です。特に、細菌へのscRNAEqの適用は、mRNAの存在量が低い10,11,11のために技術的に困難であった。
この場合の一分子蛍光は、その蛍光標識された一本鎖プローブのハイブリダイゼーションに基づいており、その配列は目的とする標的mRNA12,13,13と相補的である。配列特異的ハイブリダイゼーションの概念は、ノーザンブロットまたはRT-PCRで使用される概念と同様であるが、mRNAのネイティブな局在を維持するために、ハイブリッド化は固定細胞内のその時点で行われる。単一mRNAのシグナルは、多くのプローブを用いて増幅され、〜20ヌクレオチド(nt)長さ、mRNAの異なる部分にハイブリダイズする(図1A)13。13この「タイリング」プローブアプローチでは、単一のmRNAを検出するために必要なプローブの数は、アッセイできるmRNAの長さに下限を設定します。あるいは、目的のmRNAは、タンデムLacオペレータ配列の非コード配列に転写的に融合していてもよいし、蛍光標識されたlacOプローブの複数のコピーが単一のmRNAにハイブリダイズするように(図1B)14。14
smFISHは、定常状態(すなわち、合成と崩壊のバランスが取れている場合)における細胞当たりのmRNA数を定量化し、細菌細胞15、16、17,16,17の間でmRNAの平均および変動性を分析するために使用されてきた。近年、smFISHは、大腸菌18、19、20,19,20における遺伝子発現の誘導または抑制直後に、非定常状態でのmRNA数の定量化に適用されている。その後、絶対mRNAコピー数の時間変化を使用して、転写開始率、伸長率、および終了率、ならびにmRNA分解率を計算した。このアプリケーションでは、従来のsmFISH手順は、多くのサンプルがあり、それぞれが1つの時点を表し、複数のバッファ交換ステップ(すなわち、遠心分離および洗浄)を経る必要があるため、煩雑な場合があります。ここでは、細胞をカバースリップの表面に付着させ、真空ろ過システム14,19,19で液体を吸引することによりサンプル処理工程が劇的に単純化されるsmFISHプロトコルについて説明する。大腸菌におけるlacZの発現を例として、画像解析(図3)を含む完全なワークフロー(図2)が、転写(開始、伸長、および終了)およびmRNA分解のインビボ運動を生み出す、mRNA発現における細胞間変動性、およびmRNA局在化を含む、完全なワークフロー(図2)を示す。このプロトコルは、生体内運動学のプローブや、様々な細菌種における他のmRNAの局在化に広く適用可能であることを期待しています。

probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization

その場合の単一分子蛍光(smFISH)は、個々の細胞内のmRNAの絶対数を数える。ここでは、 大腸菌における転写およびmRNA分解率を測定するためのsmFISHの適用について述べた。smFISHは固定細胞に基づいているため、時間経過実験中、すなわち細胞が遺伝子発現の誘導または抑制時に同期変化を起こしているとき、複数の時点でsmFISHを実行します。各時点で、mRNAのサブ領域は、プローブ転写伸長および早期終了とスペクトル的に区別される。このプロトコルの結果はまた、細胞間のmRNAコピー数におけるmRNAおよび異質性の細胞内局在化を分析することを可能にする。このプロトコルを使用すると、多くのサンプル(〜50)を8時間以内に処理することができます。細菌細胞における異なるmRNAの転写および分解動態を研究するために、このプロトコルを適用する方法を議論する。

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Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

このプロトコルは、mRNA合成および分解のインビボ運動を測定するための一分子蛍光をその場所でのハイブリダイゼーション(smFISH)での適用について説明する。

Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた 大腸菌 における空間と時間におけるmRNA運動学の探査

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

smFISHは、mRNAの細胞下位置として絶対数を測定するために知られています。当社の2色sMFISHプロトコルは、転写およびmRNA分解の運動を測定する追加機能を有する。この方法を使用すると、余分な時間や労力をかけずに多くのサンプルを同時に処理できます。例えば、48サンプルを得る4つのタイムコース実験は、8時間でイメージングのために処理することができる。当社のプロトコルは、多くの遺伝子や細菌種に広く適用されます。実験用のカバースリップとガラススライドを準備する。100%エタノールを含むコプリン瓶にカバースリップとスライドを入れ、15〜20分間水浴超音波ケータリングに瓶を置くために鉗子を使用してください。超音波処理の終わりにスライドを洗浄し、70%エタノールで瓶を補充し、超音波処理を繰り返す前に、超純水で3〜4回スリップカバー。すべての超音波処理ステップが完了したら、カバースリップを乾燥させ、窒素ガスでスライドします。カバースリップを空の1000マイクロリットルピペットチップボックスに入れ、スライドをきれいなスライドボックスに入れます。次いで、ピペットチップボックスの穴に続いて、疎水性マーカーを使用してカバースリップに円を描き、これらのウェルのそれぞれに0.1%Poly lリジンの20マイクロリットルのドロップを適用します。タイムコース実験を設定するには、指数関数的に成長している20ミリリットルの大腸菌培養物から、タイムゼロとマークされた1.5ミリリットルの培養チューブに750マイクロリットルを加えます。そしてすぐに管を反転する。0.2 から 1 ミリモル IPTG で lac Z の発現を誘導し、タイマーを開始します。タイマーを確認した後、ちょうど示したように、連続した実験時点の細胞培養を収集する。実験中の適切な時点で、フラスコに5ミリモルONPFを加え、lac Z発現を抑制し、培養物をサンプリングし続けてmRNA分解を追跡する。タイムコースサンプルの取得終了時に、室温でサンプルを15分間インキュベートし、氷上で30分間インキュベーションします。インキュベーション遠心分離機の終わりには、固定剤を除去し、ピペットを使用して上清を除去するためにサンプルを遠心分離する。DEPC PBSの1ミリリットルで細菌を再懸濁し、洗浄ごとに新鮮なDEPC PBSの1ミリリットルでさらに2回細胞を洗浄します。最後の洗浄後、新鮮なDEPC PBSの30マイクロリットルで細胞を再懸濁します。細胞の透過性のため。まず、エタノール滅菌ガラスカバースリップの1つに個々の疎水性井戸に各時間ポイントからサンプルを追加します。そして、細胞が室温で10〜30分のインキュベーションでカバースリップに付着するようにします。インキュベーションの終わりに、各ウェルに70%エタノールの15マイクロリットルを加えます。4分後、各ウェルからエタノールを吸引し、井戸が完全に乾燥するようにする。洗浄後、透過化された細胞の各ウェルに30マイクロリットルのプレハイブリダイゼーション溶液を加え、37°Cのオーブンで30分間培養します。プレハイブリダイゼーション溶液をウェルあたり約30マイクロリットルのプローブハイブリダイゼーション溶液に置き換えます。そして37°Cのオーブンで2時間のインキュベーションのためのアルミニウムホイルで部屋をカバーする。インキュベーションの最後に、マルチチャンネルピペットを使用して、洗浄ごとに30マイクロリットルの洗浄液でウェルを3〜5回洗い流します。最後の洗浄の後、37°Cで15〜30分間細胞をインキュベートしてから、1回の洗浄ごとに30マイクロリットルの新鮮なDEPC PBSで井戸を5回洗浄します。最後の洗浄後、カバースリップからすべての液体を吸引します。そして、各井戸に新鮮なDEPC PBSの4マイクロリットルを追加します。鉗子を使用して、カバースリップをエタノール滅菌ガラススライドサンプル側の下に慎重に置き、シリコーンデンタルガムを使用してカバースリップの端を密封します。対象領域を特定するには、位相コントラストイメージングのライブモードを選択し、井戸内の視野を変更するためにステージジョイスティックを操作します。位相コントラストのセル画像が焦点を合わせ、Zフォーカスを調整して最適な領域に位置する。次に、4秒露光を伴うC 5画像、2秒露光を伴うC3画像、およびウェルあたり約10の異なる領域に対して0.2秒の露出を有する位相コントラスト画像を取得する。あるいは、直列にC5、C3及び位相コントラスト画像が取得されるNDI取得を実行することができる。すべてのウェルがイメージ化されたら、適切なセルセグメンテーションツールを開き、スタックをクリック解除します。対象の位相コントラスト画像をロードして独立したフレームを選択し、フェーズプロファイルをゼロとして計算します。セルが識別され、それらの輪郭が計算されるセグメント化プロセスを開始します。GitHub フォルダーに指定されたパラメーターを読み込み、すべてのフレームをクリックします。処理の最後に輪郭を選択してメッシュを視覚化します。次に、スポット検出タブで、スタックをオフにし、メッシュをチェックし、2つのDガウスフィッティングに基づいてスポット識別と定量を開始するためにこすりをクリックします。蛍光画像と、細胞検出手順から計算したメッシュファイルを含むフォルダを選択し、スポット検出結果を保存するファイル名を指定します。次に、GitHub で提供されている画像分析ワークフローを使用して、蛍光画像を分析します。この全視野では、細胞のセグメンテーションに適した密度で約500個の大腸菌細胞が観察できる。位相コントラスト画像の細胞の形態は、セグメンテーション目的で生細胞の形態と同等であり続けるべきである。細胞が透過性を超える場合、その形態はセグメンテーションには適さない。誘導前のラックZ mRNAスポット強度の分布は、高強度のスポットの存在により、正常分布またはポアソン分布とは適合しません。ラックZの発現が誘導されると、3つのプライムラックZmRNAシグナルが増加する前に5つのプライムラックZmRNAのシグナルが増加する。ラックZの発現が抑圧された場合、5個と3つのプライムラックZmRNAシグナルが減少する。転写伸長の速度を得るために、5および3つの主要信号の上昇は線に適合する。mRNA分解の速度は、指数関数を有する崩壊領域を適合させることによって得られる。単一分子魚は単一細胞の技術であるため、転写における細胞間の変動性も分析できる。さらに、5つの素数と3つのプライムラックZ mRNAの共局在化の分析により、lac Z遺伝子上のRNAポリメラーゼの密度を定量化することができます。異なる時間ポイントからのサンプルは、この手順の間に同時に処理されます。チューブとカバースリップの間、サンプルを分離しておくことが重要です。この単一分子単一細胞顕微鏡法を用いた。研究者は、トランスクリプションおよびmRNA分解動態がmRNAの絶対数または細胞内位置にどのように関連しているかを調べることができます。

Research

JoVE Journal

Biology

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

蛍光その場で</emヒト精子の>ハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

全マウントを使用するその場で</em分子とOrganismal生物学をリンクする>ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

単一生細胞におけるmRNAの転写の動態を測定

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

における真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニング大腸菌</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

蛍光によるウイルスRNAの検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離<em&gt; in vitroで</em&gt; mRNAに沿って並進一時サイトを識別するために

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

蛍光DNAための簡単​​な方法<em&gt;その場で</em&gt;ぺしゃんこ染色体へのハイブリダイゼーション

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

タンパク質の共発現の多面的メリットで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた 大腸菌 における空間と時間におけるmRNA運動学の探査

Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた大腸菌における空間と時間におけるmRNA運動学の探査