Name: probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2020-07-30T13:30:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Este protocolo foi desenvolvido pela S.K. durante sua pesquisa de pós-doutorado no laboratório da Dra. Agradecemos ao Dr. Jacobs-Wagner e seus membros do laboratório por várias entradas durante o desenvolvimento do método e Laura Troyer pela leitura crítica do manuscrito. S.K. reconhece apoio do Programa De Estudiosos searle; K.V. reconhece o apoio do James Scholar Preble Research Award da Universidade de Illinois.

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui, apresentamos um protocolo smFISH para medir cinética mRNA em E. coli. Nos protocolos smFISH publicados anteriormente para bactérias23, as células foram mantidas nos tubos até o final do protocolo, ou seja, até que estejam prontas para a imagem. Embora tenha muitos benefícios, como a ligação mínima e inespecífica de sondas fluorescentes na superfície do deslizamento de cobertura23,é difícil seguir esses protocolos quando há muitas amostras de um experimento de curso de tempo. Primeiro, um volume relativamente grande de células (>1 mL) precisa ser amostrado e até mesmo colhido antes da fixação. Em segundo lugar, as amostras de células precisam ser centrifugadas várias vezes para trocar soluções e lavar após a etapa de hibridização. Em nosso protocolo, um pequeno volume (<1 mL) de cultura é diretamente misturado com uma solução de fixação em um tubo de 1,5 mL, ajudando a "congelar" rapidamente o estado celular no momento da amostragem. Além disso, as células permanecem presas à superfície durante todo o procedimento, e diferentes soluções podem ser trocadas rapidamente aspirando líquidos com um sistema de filtragem a vácuo e aplicando gotas de solução de uma só vez com uma pipeta multicanal. Essa diferença torna nosso protocolo altamente vantajoso quando um grande número de amostras precisa ser processado de uma só vez. Usando nosso protocolo, 12-48 amostras podem ser manuseadas simultaneamente e todo o procedimento FISH pode ser concluído dentro de ~8 horas, cerca de um tempo semelhante necessário para algumas amostras(Figura 2). Embora tenhamos usado como exemplo a expressão de lacZ em E. coli, o protocolo é amplamente aplicável a diferentes genes e espécies bacterianas com considerações discutidas abaixo.
Para diferentes genes, a primeira coisa a considerar são sondas smFISH. Pode-se projetar sondas oligonucleotídeos que ladrilho o mRNA de interesse(Figura 1A)13. Nesta abordagem da sonda "ladrilho", cada sonda tem ~20 de comprimento base e é rotulada com um fluoróforo no terminus de 5' ou 3'. Esta estratégia é conveniente, pois nenhuma manipulação genética é necessária. Alternativamente, uma repetição tandem de ~20 bp sequência, estranha à sequência genômica (por exemplo, uma matriz de sequência lacO em Caulobacter crescentus14), pode ser inserida na região não traduzida de um gene de interesse e uma única sonda complementar à unidade de repetição é usada para rotular a abordagem mRNA ("array"; Figura 1B). Em ambos os casos, vários fluoroforos decoram um mRNA, dando sinal de fluorescência amplificada que pode ser facilmente diferenciado de uma única sonda inespecificamente ligada dentro de uma célula.
Se escolher abordagens de "ladrilho" ou "matriz" depende do controle negativo, uma amostra onde a ligação inespecífica de sondas é testada porque não tem o mRNA alvo. Para sondas de ladrilho(Figura 1A), uma cepa mutante sem o gene de interesse ou uma condição, na qual o gene não é transcrito (por exemplo, a repressão da lacZ) pode servir como um controle negativo para testar a ligação inespecífica de sondas. Para o smFISH baseado em matriz (Figura 1B),uma cepa de tipo selvagem sem a matriz pode servir como um controle negativo porque não contém locais de vinculação para as sondas.
As condições ideais de hibridização podem depender das sequências da sonda e até mesmo da escolha de corantes fluoróforos. Otimizamos a condição de hibridização para conjuntos de sondas lacZ mantendo a temperatura de hibridização a 37 °C e testando diferentes concentrações de conjuntos de sondas e formamida na solução de hibridização. Maiores concentrações de formamida tendem a reduzir tanto a vinculação inespecífica quanto específica26,35. Recomendamos mudar sistematicamente a hibridização e suas condições de lavagem, mantendo o tempo e a temperatura da hibridização os mesmos. À medida que a condição se torna mais rigorosa, tanto a diminuição vinculante não específica quanto específica(Figura 6). É importante encontrar um ponto em que a vinculação inespecífica comece a bater abaixo de um limiar aceitável sem comprometer ainda mais a vinculação específica. Por exemplo, usamos o nível de sinal obtido sem quaisquer sondas ("sem sondas") como limiar(Figura 6).
O método smFISH de duas cores rotulando duas regiões separadas de um mRNA está limitado a genes longos. Para medir a taxa de alongamento da transcrição, aproveitamos o fato de que lacZ é longo (3075 bp) e sua expressão pode ser induzida pelo IPTG. Quando um gene é curto, é difícil projetar dois conjuntos de sondas de ladrilhos (perto de extremidades de 5' e 3') e resolver o atraso de tempo entre as aparências de 5' vs. 3' mRNA regiões. Neste caso, pode-se contar mRNAs nascentes em estado estável por smFISH e analisar sua distribuição com um modelo analítico que tem a taxa de alongamento de transcrição como parâmetrode montagem 20. Além disso, quando um gene de interesse não é indutor, pode-se tratar células com rifampicina no momento zero e medir a mudança temporal nas sub-regiões de 5' e 3' mRNA. O atraso da diminuição do sinal de 5' mRNA para o de 3' mRNA pode então ser usado para calcular a taxa de alongamento da transcrição como feito anteriormente31.
Finalmente, o protocolo smFISH é versátil e pode ser combinado com outros esquemas de rotulagem. Anteriormente, o lócus de DNA foi visualizado juntamente com mRNAs, combinando mRNA FISH com o DNA FISH14 ou o sistema fluorescente reporter-operator20. Os produtos proteicos podem ser visualizados pela realização de imunofluorescência juntamente com mRNA FISH14,36. Além disso, pode ser combinado com microscopia tridimensional de super-resolução37 para visualizar mRNAs nas três dimensões38,39.

O fluxo de informações genéticas do DNA para o mRNA e da proteína é um dos processos celulares mais fundamentais, cuja regulação é importante para a aptidão celular1. O número de mRNAs em uma célula é determinado por dois processos dinâmicos, transcrição e degradação do mRNA. No entanto, como a transcrição e a degradação do mRNA são reguladas no tempo e no espaço de uma única célula não é completamente compreendida, em grande parte devido à escassez de métodos experimentais para medir quantitativamente sua cinética in vivo.
Métodos baseados em mRNAs totais extraídos de uma população de células, como mancha do Norte, RT-PCR, sequenciamento de RNA e microarrays de expressão genética, podem medir a diferença relativa nos níveis de mRNA e têm sido amplamente utilizados para analisar a taxa de alongamento da transcrição2,,3,,4,5 ou a taxa de degradação do mRNA6,,7. No entanto, eles não fornecem o número absoluto de mRNAs por célula e, portanto, não são adequados para sondar a taxa de iniciação de transcrição8. Além disso, como os mRNAs são extraídos de uma população de células, a distribuição espacial de mRNAs dentro de uma única célula e a variabilidade dos números de cópias mRNA entre as células não podem ser medidas.
O sequenciamento de RNA de última geração em células individuais (scRNAseq) pode quantificar o número de mRNAs por célula em uma escala genômica9. No entanto, ainda é difícil usar essa técnica para medir a cinética de transcrição, devido a desafios com preparação amostral e alto custo. Em particular, a aplicação de scRNAseq a bactérias tem sido tecnicamente difícil devido à baixa abundância de mRNA10,11.
A fluorescência de molécula única na hibridização situ (smFISH) baseia-se na hibridização de sondas de um único fio fluorescente cujas sequências são complementares ao mRNA alvo de interesse12,13. O conceito de hibridização específica de sequência é semelhante ao usado na mancha norte ou RT-PCR, mas a hibridização é feita in situ dentro de células fixas, para preservar a localização nativa de mRNAs. O sinal de um único mRNA é amplificado usando muitas sondas, ~20 nucleotídeos (nt) de comprimento, hibridizando para diferentes partes de um mRNA (Figura 1A)13. Nesta abordagem da sonda "ladrilho", o número de sondas necessárias para detectar um único mRNA estabelece um limite menor no comprimento do mRNA que pode ser avaliado. Alternativamente, o mRNA de interesse pode ser transcritivamente fundido a uma matriz não codificadora de sequências de operadores lac tandem, de tal forma que várias cópias de uma sonda lacO fluorescentemente rotulada hibridizem para um único mRNA(Figura 1B)14.
smFISH tem sido usado para quantificar o número de mRNAs por célula em estado estável (ou seja, quando a síntese e a decadência estão em equilíbrio) e para analisar a média e variabilidade das mRNAs entre as células bacterianas15,,16,,17. Recentemente, o smFISH foi aplicado para quantificar os números de mRNA em estado não estável, logo após a indução ou repressão da expressão genética em E. coli18,,19,20. As alterações temporais nos números absolutos de cópias do mRNA foram então utilizadas para calcular a taxa de iniciação, alongamento e término da transcrição, bem como a taxa de degradação do mRNA. Para esta aplicação, os procedimentos convencionais de smFISH podem ser complicados porque existem muitas amostras, cada uma representando um ponto de tempo, que precisam passar por múltiplas etapas de troca de buffer (ou seja, centrifugação e lavagem). Aqui, descrevemos um protocolo smFISH, no qual as etapas de manuseio da amostra são dramaticamente simplificadas por ter células aderidas à superfície de um deslizamento de cobertura e aspirando líquidos com um sistema de filtragem de vácuo14,19. Utilizando-se como exemplo a expressão de lacZ em E. coli, demonstra-se o fluxo de trabalho completo (Figura 2),incluindo a análise de imagem(Figura 3) produzindo a cinética in vivo da transcrição (iniciação, alongamento e terminação) e a degradação mRNA, variabilidade célula-celular na expressão mRNA e localização mRNA. Prevemos que o protocolo é amplamente aplicável à sonda cinética in vivo e localização de outros mRNAs em várias espécies de bactérias.

probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization

Fluorescência de molécula única na hibridização situ (smFISH) permite contar o número absoluto de mRNAs em células individuais. Aqui, descrevemos uma aplicação de smFISH para medir as taxas de transcrição e degradação do mRNA em Escherichia coli. Como o smFISH é baseado em células fixas, realizamos smFISH em vários pontos de tempo durante um experimento de curso de tempo, ou seja, quando as células estão passando por alterações sincronizadas após a indução ou repressão da expressão genética. Em cada ponto de tempo, sub-regiões de um mRNA são espectralmente distinguidas para o alongamento da transcrição da sonda e término prematuro. O resultado deste protocolo também permite analisar a localização intracelular de mRNAs e heterogeneidade em números de cópias mRNA entre as células. Usando este protocolo muitas amostras (~50) podem ser processadas dentro de 8h, como a quantidade de tempo necessária para apenas algumas amostras. Discutimos como aplicar este protocolo para estudar a transcrição e a cinética de degradação de diferentes mRNAs em células bacterianas.

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Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Este protocolo descreve uma aplicação de fluorescência de molécula única na hibridização situ (smFISH) para medir a cinética in vivo da síntese e degradação do mRNA.

Sondando cinética mRNA no espaço e no tempo em Escherichia coli usando fluorescência de molécula única de duas cores na hibridização situ

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

smFISH é conhecido por medir o número absoluto como localização subcelular de mRNAs. Nosso protocolo sMFISH de duas cores tem a capacidade adicional de medir a cinética da transcrição e a degradação do mRNA. Usando este método, muitas amostras podem ser processadas simultaneamente sem tempo extra ou esforço.Por exemplo, quatro experimentos de curso de tempo que produzem 48 amostras podem ser processados para imagens em oito horas. Nosso protocolo é amplamente aplicável para muitos genes e espécies bacterianas. Para preparar deslizamentos de cobertura e lâminas de vidro para o experimento.Use fórceps para colocar deslizamentos de cobertura e slides em um frasco de Coplin contendo 100% de etanol e coloque o frasco em um banho de água ultrassônico por 15 a 20 minutos. No final da sônica lave os slides e cubra deslizes três a quatro vezes com água ultra pura antes de encher o frasco com 70% de etanol e repetir a sônica. Quando todas as etapas de sônica são feitas, seque os deslizamentos de cobertura e deslizes com gás nitrogênio.Coloque as tampas em uma caixa de ponta de pipeta de 1000 microliter vazia e coloque os slides em uma caixa de slides limpa. Em seguida, seguindo os orifícios da caixa de ponta da pipeta use um marcador hidrofóbico para desenhar círculos nos deslizamentos de cobertura e aplicar uma queda de 20 microliter de 0,1%Poli l lysine para cada um desses poços. Para configurar um experimento de curso de tempo, adicione 750 microliters de uma cultura E.coli de 20 mililitros que crescem exponencialmente para um tubo de cultura de 1,5 mililitro marcado como zero tempo.E imediatamente inverter o tubo. Induzir a expressão lac Z com 0,2 a um IPTG mililitro e iniciar um temporizador. Depois de verificar o temporizador, colete a cultura celular em cada ponto de tempo experimental consecutivo como apenas demonstrado.No ponto de tempo apropriado durante o experimento, adicione cinco ONPF milimolares ao frasco para reprimir a expressão lac Z e continue a amostrar as culturas para rastrear a degradação do mRNA. Ao final do curso de tempo aquisição da amostra, incubar as amostras à temperatura ambiente por 15 minutos seguido de incubação no gelo por 30 minutos. No final da centrífuga de incubação as amostras para remover o fixador e usar uma pipeta para remover o supernante.Suspenda a bactéria em um mililitro de DEPC PBS e lave as células mais duas vezes em um mililitro de DEPC PBS fresco por lavagem. Após a última lavagem, suspenda as células em 30 microliters de DEPC PBS frescos. Para permeabilização das células.Primeiro adicione a amostra de cada ponto de cada ponto de tempo a poços hidrofóbicos individuais em um dos deslizamentos de tampa de vidro esterilizados com etanol. E permitir que as células aderam ao deslizamento de cobertura com uma incubação de 10 a 30 minutos à temperatura ambiente. Ao final da incubação, adicione 15 microliters de 70% de etanol a cada poço.Depois de quatro minutos, aspire o etanol de cada poço para que os poços fiquem completamente secos. Após a lavagem adicione 30 microliters de solução de pré-hibridização a cada poço de células permeabilizadas, e incuba as células por 30 minutos em um forno de 37 graus Celsius. Substitua a solução de pré-hibridização por aproximadamente 30 microliters de solução de hibridização de sonda por poço.E cubra a câmara com papel alumínio para uma incubação de duas horas no forno Celsius de 37 graus. No final da incubação use uma pipeta multicanal para enxaguar os poços três a cinco vezes com 30 microliters de solução de lavagem por poço por lavagem. Após a última lavagem, incubar as células por 15 a 30 minutos a 37 graus Celsius antes de lavar os poços cinco vezes com 30 microliters de DEPC PBS fresco por lavagem.Após a última lavagem, aspire todo o líquido do deslizamento da tampa. E adicione quatro microliters de DEPC PBS frescos a cada poço. Use fórceps para colocar cuidadosamente o deslizamento da tampa em um deslizamento de vidro esterilizado com etanol lado para baixo, e use goma dentária de silicone para selar as bordas do deslizamento da tampa.Para localizar uma área de interesse selecione o modo ao vivo de imagem de contraste de fase e manoe o joystick de palco para alterar o campo de visão dentro de um poço. Localizou uma área em que a densidade celular é ótima e ajustar o foco Z de modo que as imagens das células de contraste de fase estejam em foco. Em seguida, adquira uma imagem C cinco com uma exposição de quatro segundos, uma imagem C três com uma exposição de dois segundos e uma imagem de contraste de fase com uma exposição de 0,2 segundo para aproximadamente 10 áreas diferentes por poço.Alternativamente, uma aquisição ndi na qual c cinco, C três e imagens de contraste de fase são adquiridas em série pode ser executada. Quando todos os poços tiverem sido imagens, abra uma ferramenta de segmentação celular apropriada e desciclhe a pilha. Carregue as imagens de contraste de fase de interesse e selecione quadros independentes e clique em calcular o perfil de fase como zero.Para iniciar o processo de segmentação durante o qual as células serão identificadas e seus contornos serão calculados. Carregue os parâmetros fornecidos na pasta GitHub e clique em todos os quadros. No final do processamento selecione contorno para visualizar a malha.Em seguida, sob a guia de detecção de manchas, desmarcar, verificar malhas e clicar em esfregar para iniciar a identificação e quantificação do local com base no encaixe de dois D Gaussian. Selecione a pasta contendo as imagens fluorescentes e o arquivo de malha que foi calculado a partir do procedimento de detecção de células e indique o nome do arquivo para o qual os resultados de detecção de ponto serão salvos. Em seguida, use o fluxo de trabalho de análise de imagem fornecido no GitHub para analisar as imagens de fluorescência.Neste campo de visão completo, aproximadamente 500 células E.coli com uma boa densidade para segmentação celular podem ser observadas. A morfologia das células nas imagens de contraste de fase deve permanecer comparável à das células vivas para fins de segmentação. Se as células estiverem mais permeabilizadas, sua morfologia se tornará inadequada para a segmentação.A distribuição das intensidades de ponto de lac Z mRNA antes da indução não se encaixa bem com uma distribuição normal ou poisson devido à presença de manchas com alta intensidade. Quando a expressão de lac Z é induzida o sinal de cinco prime lac Z mRNA aumenta antes que o sinal de três prime lac Z mRNA aumente. Se a expressão de lac Z for reprimida, os sinais de mRNA Z de cinco e três primeiros lacs diminuem.Para obter a taxa de alongamento da transcrição, o aumento dos cinco e três sinais primos são adequados com linhas. Enquanto a taxa de degradação do mRNA é obtida pela adequação da região de decomposição com uma função exponencial. Como o peixe de molécula única é uma técnica de célula única, variabilidades celulares a células na transcrição também podem ser analisadas.Além disso, a análise da colocalização de cinco mRNAs primos e três primeiros lac Z permite quantificar a densidade das polimerases de RNA no gene lac Z. Como amostras de diferentes pontos de tempo são tratadas simultaneamente durante este procedimento. É importante manter a amostra separada enquanto estão nos tubos e no deslizamento da tampa.Usando esta técnica de microscopia de célula única de uma única molécula. Os pesquisadores agora podem explorar como a transcrição e a cinética de degradação do mRNA estão relacionadas com os números absolutos ou locais subcelulares de mRNAs.

Research

JoVE Journal

Biology

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

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Fluorescência In situ Hybridization (FISH) Protocolo no esperma humano

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Biologia

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

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Usando Monte Whole In situ Hibridação a ligação de Biologia Molecular e Organísmicos

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

Medição da Cinética de Transcrição mRNA em células Living Single

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening da atividade endoglucanase de fungos em Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Detecção de RNA viral por fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Usando sintéticos matrizes genéticas

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

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Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

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Método simples para DNA de Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com Cromossomos Squashed

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

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As multifacetadas benefícios da proteína Co-expressão em<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...