Name: probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2020-07-30T13:30:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Este protocolo fue desarrollado por S.K. durante su investigación postdoctoral en el laboratorio de la Dra. Christine Jacobs-Wagner en el Instituto Médico Howard Hughes y el Instituto de Ciencias Microbianas de la Universidad de Yale. Agradecemos a la Dra. Jacobs-Wagner y a los miembros de su laboratorio por diversos aportes durante el desarrollo del método y a Laura Troyer por la lectura crítica del manuscrito. S.K. reconoce el apoyo del Programa de Becas Searle; K.V. reconoce el apoyo del James Scholar Preble Research Award de la Universidad de Illinois.

<ol>
	<li>Bervoets, I., Charlier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity,+versatility+and+complexity+of+bacterial+gene+regulation+mechanisms:+opportunities+and+drawbacks+for+applications+in+synthetic+biology.">Diversity, versatility and complexity of bacterial gene regulation mechanisms: opportunities and drawbacks for applications in synthetic biology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 304-339 (2019).</li><li>Epshtein, V., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+RNA+polymerase+molecules+in+transcription+elongation.">Cooperation between RNA polymerase molecules in transcription elongation.</a> Science. 300 (5620), 801-805 (2003).</li><li>Vogel, U., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+chain+elongation+rate+in+Escherichia+coli+depends+on+the+growth+rate.">The RNA chain elongation rate in Escherichia coli depends on the growth rate.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 2807-2813 (1994).</li><li>Tennyson, C. N., Klamut, H. J., Worton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+dystrophin+gene+requires+16+hours+to+be+transcribed+and+is+cotranscriptionally+spliced.">The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is cotranscriptionally spliced.</a> Nature Genetics. 9, 184 (1995).</li><li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes.">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 16, 1128 (2009).</li><li>Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+RNA+Half-Life+Analysis+in+Escherichia+coli+Reveals+Positional+Patterns+of+Transcript+Degradation.">Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation.</a> Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).</li><li>Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. -. H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+decay+and+abundance+in+Escherichia+coli+at+single-gene+resolution+using+two-color+fluorescent+DNA+microarrays.">Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).</li><li>P&#233;rez-Ort&#237;n, J. E., Medina, D. A., Ch&#225;vez, S., Moreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+do+you+mean+by+transcription+rate.">What do you mean by transcription rate.</a> BioEssays. 35 (12), 1056-1062 (2013).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li><li>Kuchina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+single-cell+RNA+sequencing+by+split-pool+barcoding.">Microbial single-cell RNA sequencing by split-pool barcoding.</a> BioRxiv. , 869248 (2019).</li><li>Blattman, S. B., Jiang, W., Oikonomou, P., Tavazoie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotic+single-cell+RNA+sequencing+by+in+situ+combinatorial+indexing.">Prokaryotic single-cell RNA sequencing by in situ combinatorial indexing.</a> Nature Microbiology. , (2020).</li><li>Femino, A., Fay, F., Fogarty, K., Singer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Montero Llopis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+flow+of+genetic+information+in+bacteria.">Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria.</a> Nature. 466 (7302), 77-81 (2010).</li><li>So, L. -. h., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+properties+of+transcriptional+time+series+in+Escherichia+coli.">General properties of transcriptional time series in Escherichia coli.</a> Nature Genetics. 43 (6), 554-560 (2011).</li><li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells.">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li><li>Jones, D. L., Brewster, R. C., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+architecture+dictates+cell-to-cell+variability+in+gene+expression.">Promoter architecture dictates cell-to-cell variability in gene expression.</a> Science. 346 (6216), 1533-1536 (2014).</li><li>Iyer, S., Park, B. R., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantitative+measurement+of+transcriptional+kinetic+parameters+in+vivo.">Absolute quantitative measurement of transcriptional kinetic parameters in vivo.</a> Nucleic Acids Research. 44 (18), 142 (2016).</li><li>Kim, S., Beltran, B., Irnov, I., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Distance+Cooperative+and+Antagonistic+RNA+Polymerase+Dynamics+via+DNA+Supercoiling.">Long-Distance Cooperative and Antagonistic RNA Polymerase Dynamics via DNA Supercoiling.</a> Cell. 179 (1), 106-119 (2019).</li><li>Wang, M., Zhang, J., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+transcription+at+a+single+gene+copy+reveals+hidden+drivers+of+bacterial+individuality.">Measuring transcription at a single gene copy reveals hidden drivers of bacterial individuality.</a> Nature Microbiology. 4 (12), 2118-2127 (2019).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Labeling DNA (or RNA) for single-molecule FRET. 2012 (9), 1005-1008 (2012).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Ethanol Precipitation of DNA in Microcentrifuge Tubes. 2006 (1), 4456 (2006).</li><li>Skinner, S. O., Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization.">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li><li>Adesnik, M., Levinthal, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+and+degradation+of+lactose+operon+messenger+RNA+in+E.+coli.">The synthesis and degradation of lactose operon messenger RNA in E. coli.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 35, 451-459 (1970).</li><li>Campbell, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+for+rifampicin+inhibition+of+bacterial+RNA+polymerase.">Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase.</a> Cell. 104 (6), 901-912 (2001).</li><li>Raj, A., Tyagi, S., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 472, 365-386 (2010).</li><li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics.">High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Molecular Microbiology. 80 (3), 612-627 (2011).</li><li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oufti:+an+integrated+software+package+for+high-accuracy,+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis.">Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Molecular Microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).</li><li>Moffitt, J. R., Zhuang, X., Filonov, G. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).</li><li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+gene+expression+in+live+cells,+one+protein+molecule+at+a+time.">Probing gene expression in live cells, one protein molecule at a time.</a> Science. 311 (5767), 1600-1603 (2006).</li><li>Chen, H., Shiroguchi, K., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+study+of+mRNA+degradation+and+transcript+elongation+in+Escherichia+coli.">Genome-wide study of mRNA degradation and transcript elongation in Escherichia coli.</a> Molecular Systems Biology. 11 (1), 781 (2015).</li><li>Vogel, U., S&#248;rensen, M., Pedersen, S., Jensen, K. F., Kilstrup, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreasing+transcription+elongation+rate+in+Escherichia+Coli+exposed+to+amino+acid+starvation.">Decreasing transcription elongation rate in Escherichia Coli exposed to amino acid starvation.</a> Molecular Microbiology. 6 (15), 2191-2200 (1992).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+and+translation+contribute+to+gene+locus+relocation+to+the+nucleoid+periphery+in+E.+coli.">Transcription and translation contribute to gene locus relocation to the nucleoid periphery in E. coli.</a> Nature Communications. 10 (1), 5131 (2019).</li><li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast.">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li><li>Fontenete, S., Guimar&#227;es, N., Wengel, J., Azevedo, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+melting+temperatures+in+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+procedures+using+thermodynamic+models.">Prediction of melting temperatures in fluorescence in situ hybridization (FISH) procedures using thermodynamic models.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 36 (3), 566-577 (2016).</li><li>Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Zhang, J., Wang, M., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+gene+regulation+in+individual+cells+reveals+rapid+switching+between+promoter+states.">Measurement of gene regulation in individual cells reveals rapid switching between promoter states.</a> Science. 351 (6278), 1218-1222 (2016).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+shapes+the+turnover+of+a+bacterial+transcriptome.">Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome.</a> eLife. 5, 13065 (2016).</li><li>Fei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+in+vivo+target+search+kinetics+of+regulatory+noncoding+RNA.">Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA.</a> Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.

Aquí, presentamos un protocolo smFISH para medir la cinética de ARNm en E. coli. En los protocolos smFISH publicados anteriormente para las bacterias23,las células se mantuvieron en los tubos hasta el final del protocolo, es decir, hasta que están listas para la toma de imágenes. Si bien tiene muchos beneficios, como la unión mínima inespecífica de sondas fluorescentes en la superficie del cubreobjetos23,es difícil seguir estos protocolos cuando hay muchas muestras de un experimento de curso de tiempo. En primer lugar, un volumen relativamente grande de células (>1 ml) necesita ser muestreado e incluso cosechado antes de la fijación. En segundo lugar, las muestras de células deben ser centrifugadas varias veces para intercambiar soluciones y lavarse después del paso de hibridación. En nuestro protocolo, un pequeño volumen (<1 mL) de cultivo se mezcla directamente con una solución de fijación en un tubo de 1,5 ml, ayudando a "congelar" rápidamente el estado de la célula en el momento del muestreo. Además, las células permanecen unidas a la superficie durante todo el procedimiento, y diferentes soluciones se pueden intercambiar rápidamente aspirando líquidos con un sistema de filtración por vacío y aplicando gotas de solución a la vez con una pipeta multicanal. Esta diferencia hace que nuestro protocolo sea muy ventajoso cuando un gran número de muestras necesitan ser procesadas a la vez. Usando nuestro protocolo, 12-48 muestras se pueden manejar simultáneamente y todo el procedimiento FISH se puede completar dentro de 8 horas, aproximadamente una cantidad similar de tiempo necesario para unas pocas muestras (Figura 2). Aunque utilizamos la expresión de lacZ en E. coli como ejemplo, el protocolo es ampliamente aplicable a diferentes genes y especies bacterianas con consideraciones discutidas a continuación.
Para diferentes genes, lo primero que hay que tener en cuenta son las sondas smFISH. Se pueden diseñar sondas de oligonucleótidos que teen el ARNm de interés (Figura 1A)13. En este enfoque de sonda de "mosaico", cada sonda tiene una longitud de 20o y está etiquetada con un fluoróforo en la terminal de 5' o 3'. Esta estrategia es conveniente, ya que no se necesita manipulación genética. Alternativamente, se puede insertar una repetición en tándem de secuencia de 20 bp, ajena a la secuencia genómica (por ejemplo, una serie de secuencias lacO en Caulobacter crescentus14), en la región no traducida de un gen de interés y se utiliza una sola sonda complementaria a la unidad de repetición para etiquetar el ARNm ("enfoque de arreglo"; Figura 1B). En ambos casos, varios fluoróforos decoran un ARNm, dando una señal de fluorescencia amplificada que se puede diferenciar fácilmente de una sola sonda enlazada sin especificación dentro de una celda.
Si elegir enfoques de "tiling" o "array" depende del control negativo, una muestra donde se prueba el enlace no específico de sondas porque carece del ARNm de destino. Para las sondas de mosaico (Figura 1A), una cepa mutante sin el gen de interés o una condición, en la que el gen no se transcribe (por ejemplo, la represión de lacZ) puede servir como un control negativo para probar la unión inespecífica de sondas. Para el smFISH basado en matrices (Figura 1B), una cepa de tipo comodín que carece de la matriz puede servir como un control negativo porque no contiene sitios de enlace para los sondeos.
Las condiciones óptimas de hibridación pueden depender de las secuencias de la sonda e incluso de la elección de los tintes de fluoróforo. Optimizamos la condición de hibridación para los conjuntos de sondas lacZ manteniendo la temperatura de hibridación a 37 oC y probando diferentes concentraciones de conjuntos de sondas y formamida en la solución de hibridación. Las concentraciones más altas de formamida tienden a reducir la unión no específica y no específica26,35. Recomendamos cambiar sistemáticamente la hibridación y sus condiciones de lavado manteniendo el tiempo y la temperatura de hibridación iguales. A medida que la condición se vuelve más estricta, disminuyen tanto los enlaces no específicos como los específicos (Figura 6). Es importante encontrar un punto en el que el enlace no específico comience a alcanzar por debajo de un umbral aceptable sin comprometer aún más la unión específica. Por ejemplo, utilizamos el nivel de señal obtenido sin ningún sondeo ("sin sondas") como umbral(Figura 6).
El método smFISH de dos colores que etiqueta dos regiones separadas de un ARNm se limita a genes largos. Para medir la tasa de alargamiento de transcripción, aprovechamos el hecho de que lacZ es larga (3075 bp) y su expresión puede ser inducida por IPTG. Cuando un gen es corto, es difícil diseñar dos conjuntos de sondas de mosaico (cerca de 5' y 3' extremos) y resolver el retardo de tiempo entre apariciones de 5' vs. 3' regiones de ARNm. En este caso, se pueden contar los mRNas nacientes en estado estacionario por smFISH y analizar su distribución con un modelo analítico que tiene la tasa de alargamiento de transcripción como parámetro de ajuste20. Además, cuando un gen de interés no es inducible, se pueden tratar las células con rifampicina en el momento cero y medir el cambio temporal en subregiones de ARNm de 5' y 3'. El retardo de la disminución de la señal de ARNm de 5' a la de la señal de ARNm de 3' se puede utilizar entonces para calcular la tasa de alargamiento de transcripción como se hizo anteriormente31.
Por último, el protocolo smFISH es versátil y se puede combinar con otros esquemas de etiquetado. Anteriormente, el locus de ADN se visualizaba junto con los ARNM combinando mRNA FISH con DNA FISH14 o el sistema fluorescente reportero-operador20. Los productos proteicos pueden visualizarse realizando inmunofluorescencia junto con mRNA FISH14,,36. Además, se puede combinar con microscopía tridimensional de superconorción37 para visualizar los MRNAs en las tres dimensiones38,,39.

El flujo de información genética del ADN al ARNm y a las proteínas es uno de los procesos celulares más fundamentales, cuya regulación es importante para la aptitud celular1. El número de ARN en una célula está determinado por dos procesos dinámicos, la transcripción y la degradación del ARNm. Sin embargo, la forma en que la transcripción y la degradación del ARNm se regulan en el tiempo y el espacio de una sola célula sigue sin entenderse completamente, en gran parte debido a la escasez de métodos experimentales para medir cuantitativamente su cinética in vivo.
Los métodos basados en los mRNA totales extraídos de una población de células, tales como Northern blot, RT-PCR, secuenciación de ARN y microarrays de expresión génica, pueden medir la diferencia relativa en los niveles de ARNm y se han utilizado ampliamente para analizar la tasa de alargamiento de transcripción2,3,4,5 o la tasa de degradación del ARNm6,,7. Sin embargo, no proporcionan el número absoluto de mRNAs por célula, y por lo tanto, no son adecuados para sondear la tasa de iniciación de transcripción8. Además, debido a que los ARN se extraen de una población de células, no se puede medir la distribución espacial de los ARN dentro de una sola célula y la variabilidad de los números de copia de ARNm entre las células.
La secuenciación de ARN de próxima generación en células individuales (scRNAseq) puede cuantificar el número de ARNm por célula en una escala genómica9. Sin embargo, sigue siendo difícil utilizar esta técnica para medir la cinética de transcripción, debido a los desafíos con la preparación de la muestra y el alto costo. En particular, la aplicación de scRNAseq a las bacterias ha sido técnicamente difícil debido a la baja abundancia de ARNM10,11.
La hibridación in situ de fluorescencia de una sola molécula (smFISH) se basa en la hibridación de sondas de una sola cadena etiquetadas fluorescentemente cuyas secuencias son complementarias al ARNm objetivo de interés12,,13. El concepto de hibridación específica de la secuencia es similar al utilizado en Northern blot o RT-PCR, pero la hibridación se realiza in situ dentro de celdas fijas, para preservar la localización nativa de los mRNAs. La señal de un solo ARNm se amplifica utilizando muchas sondas, de longitud de 20 nucleótidos (nt), hibridando en diferentes partes de un ARNm (Figura 1A)13. En este enfoque de sonda de "mosaico", el número de sondas necesarias para detectar un solo ARNm establece un límite inferior en la longitud del ARNm que se puede ensayar. Alternativamente, el ARNm de interés puede fusionarse transcripcionalmente con una matriz no codificatoria de secuencias de operadores Lac en tándem, de modo que varias copias de una sonda lacO etiquetada fluorescentemente se hibridan en un solo ARNm (Figura 1B)14.
smFISH se ha utilizado para cuantificar el número de mRNAs por célula en estado estacionario (es decir, cuando la síntesis y la descomposición están en equilibrio) y para analizar la media y variabilidad de los MRNAs entre las células bacterianas15,,16,,17. Recientemente, smFISH se ha aplicado para cuantificar los números de ARNm en estado no estable, inmediatamente después de la inducción o represión de la expresión génica en E. coli18,19,20. Los cambios temporales en los números absolutos de copia de ARNm se utilizaron para calcular la tasa de iniciación de transcripción, elongación y terminación, así como la tasa de degradación del ARNm. Para esta aplicación, los procedimientos smFISH convencionales pueden ser engorrosos porque hay muchas muestras, cada una representando un punto de tiempo, que necesitan pasar por múltiples pasos de intercambio de búferes (es decir, centrifugación y lavado). Aquí, describimos un protocolo smFISH, en el que los pasos de manipulación de muestras se simplifican drásticamente al tener células adheridas a la superficie de un cubreobjetos y aspirando líquidos con un sistema de filtración al vacío14,,19. Utilizando la expresión de lacZ en E. coli como ejemplo, se demuestra el flujo de trabajo completo (Figura 2), incluido el análisis de imágenes (Figura 3) que produce la cinética in vivo de transcripción (iniciación, alargamiento y terminación) y degradación de ARNm, variabilidad de celda a célula en la expresión de ARNm y localización de ARNm. Anticipamos que el protocolo es ampliamente aplicable a la poliética in vivo de la sonda y la localización de otros MRNAs en varias especies de bacterias.

probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization

La hibridación in situ de fluorescencia de una sola molécula (smFISH) permite contar el número absoluto de mRNAs en células individuales. Aquí, describimos una aplicación de smFISH para medir las tasas de transcripción y degradación del ARNm en Escherichia coli. Como smFISH se basa en células fijas, realizamos smFISH en múltiples puntos de tiempo durante un experimento de curso de tiempo, es decir, cuando las células están experimentando cambios sincronizados tras la inducción o la represión de la expresión génica. En cada punto de tiempo, las subregiones de un ARNm se distinguen espectralmente para sondear el alargamiento de transcripción y la terminación prematura. El resultado de este protocolo también permite analizar la localización intracelular de los ARNm y la heterogeneidad en los números de copia de ARNm entre las células. Usando este protocolo muchas muestras (50) se pueden procesar dentro de 8 h, como la cantidad de tiempo necesaria para sólo unas pocas muestras. Discutimos cómo aplicar este protocolo para estudiar la cinética de transcripción y degradación de diferentes mRNAs en células bacterianas.

Watch this Scientific Journal Video about Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Este protocolo describe una aplicación de hibridación in situ de fluorescencia de una sola molécula (smFISH) para medir la cinética in vivo de la síntesis y degradación del ARNm.

Sondeo de mRNA cinética en el espacio y el tiempo en Escherichia coli usando hibridación de fluorescencia de una sola molécula de dos colores

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

smFISH es conocido por medir el número absoluto como ubicación subcelular de los mRNAs. Nuestro protocolo sMFISH de dos colores tiene la capacidad añadida de medir la cinética de la transcripción y la degradación del ARNm. Usando este método, muchas muestras se pueden procesar simultáneamente sin tiempo adicional o esfuerzo.Por ejemplo, cuatro experimentos de curso de tiempo que producen 48 muestras se pueden procesar para la toma de imágenes en ocho horas. Nuestro protocolo es ampliamente aplicable para muchos genes y especies bacterianas. Para preparar resbalones de cubierta y diapositivas de vidrio para el experimento.Utilice fórceps para colocar resbalones de cubierta y diapositivas en un frasco de Coplin que contenga 100%etanol y coloque el frasco en un baño de agua ultrasónico de catering durante 15 a 20 minutos. Al final de la sonicación lavar los portaobjetos y la cubierta se desliza de tres a cuatro veces con agua ultra pura antes de rellenar el frasco con 70% etanol y repetir la sonicación. Cuando se realicen todos los pasos de sonicación, seque los resbalones de la cubierta y se deslice con gas nitrógeno.Coloque los resbalones de la cubierta en una caja de punta de pipeta de 1000 microlitros vacía y coloque las diapositivas en una caja de diapositivas limpia. A continuación, después de los agujeros de la caja de punta de la pipeta utilizar un marcador hidrófobo para dibujar círculos en los resbalones de cubierta y aplicar una caída de 20 microlitro de 0.1%Poly l lisina a cada uno de estos pozos. Para configurar un experimento de curso de tiempo, agregue 750 microlitros de un cultivo de E.coli de crecimiento exponencial de 20 mililitros a un tubo de cultivo de 1,5 mililitros marcado en el tiempo cero.E inmediatamente invertir el tubo. Inducir la expresión Z de lac con 0,2 a un IPTG milimolar e iniciar un temporizador. Después de comprobar el temporizador, recopile el cultivo celular en cada punto de tiempo experimental consecutivo como se acaba de demostrar.En el momento adecuado durante el experimento, agregue un ONPF de cinco mil millonelares al matraz para reprimir la expresión Z de lac y continúe muestreando los cultivos para realizar un seguimiento de la degradación del ARNm. Al final de la adquisición de la muestra del curso de tiempo, incubar las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos seguidas de incubación en hielo durante 30 minutos. Al final de la centrifugación de incubación las muestras para extraer el fijador y utilizar una pipeta para eliminar el sobrenadante.Vuelva a suspender las bacterias en un mililitro de DEPC PBS y lave las células dos veces más en un mililitro de PBS FRESCO DEPC por lavado. Después del último lavado, vuelva a suspender las células en 30 microlitros de DEPC PBS fresco. Para la permeabilización de las células.Primero agregue la muestra de cada punto de tiempo a pozos hidrófobos individuales en uno de los resbalones de cubierta de vidrio esterilizado con etanol. Y permita que las células se adhieran al resbalón de la cubierta con una incubación de 10 a 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, añadir 15 microlitros de 70% etanol a cada pocóyo.Después de cuatro minutos, aspirar el etanol de cada pozo para que los pozos estén completamente secos. Después del lavado añadir 30 microlitros de solución de pre hibridación a cada pozo de células permeabilizadas, e incubar las células durante 30 minutos en un horno de 37 grados Centígrados. Sustituya la solución de pre hibridación por aproximadamente 30 microlitros de solución de hibridación de sondas por pozo.Y cubra la cámara con papel de aluminio durante una incubación de dos horas en el horno de 37 grados Centígrados. Al final de la incubación utilizar una pipeta multicanal para enjuagar los pozos de tres a cinco veces con 30 microlitros de solución de lavado por pozo por lavado. Después del último lavado, incubar las células durante 15 a 30 minutos a 37 grados Celsius antes de lavar los pozos cinco veces con 30 microlitros de DEPC PBS fresco por lavado.Después del último lavado, aspira todo el líquido de la cubierta. Y añadir cuatro microlitros de FRESCO PBS a cada pozo. Utilice fórceps para colocar cuidadosamente el resbalón de la cubierta en un lado de la muestra de vidrio esterilizado con etanol hacia abajo, y utilice goma dental de silicona para sellar los bordes del resbalón de la cubierta.Para localizar un área de interés, seleccione el modo en vivo de imágenes de contraste de fase y manipule el joystick del escenario para cambiar el campo de visión dentro de un pozo. Localizó un área en la que la densidad de celda es óptima y ajuste el enfoque Z de modo que las imágenes de celda de contraste de fase estén enfocadas. A continuación, adquiera una imagen C cinco con una exposición de cuatro segundos, una imagen C tres con una exposición de dos segundos y una imagen de contraste de fase con una exposición de 0,2 segundos para aproximadamente 10 áreas diferentes por pozo.Alternativamente, se puede ejecutar una adquisición NDI en la que se adquieren imágenes de contraste de fase C cinco, C tres y imágenes de contraste de fase. Cuando se hayan hecho imágenes de todos los pozos, abra una herramienta de segmentación de celdas adecuada y anhaga clic en la pila. Cargue las imágenes de contraste de fase de interés y seleccione fotogramas independientes y haga clic en calcular el perfil de fase como cero.Para comenzar el proceso de segmentación durante el cual se identificarán las celdas y se calcularán sus contornos. Cargue los parámetros proporcionados en la carpeta GitHub y haga clic en todos los fotogramas. Al final del procesamiento, seleccione el contorno para visualizar la malla.A continuación, en la pestaña de detección de puntos, desactive la pila, compruebe las mallas y haga clic en frotar para iniciar la identificación y cuantificación del punto en función del accesorio gaussiano D. Seleccione la carpeta que contiene las imágenes fluorescentes y el archivo de malla que se acaba de calcular a partir del procedimiento de detección de celdas e indique el nombre de archivo en el que se guardarán los resultados de la detección de puntos. A continuación, utilice el flujo de trabajo de análisis de imágenes proporcionado en GitHub para analizar las imágenes de fluorescencia.En este campo de visión completo se pueden observar aproximadamente 500 células E.coli a una buena densidad para la segmentación celular. La morfología de las células en las imágenes de contraste de fase debe permanecer comparable a la de las células vivas con fines de segmentación. Si las células están demasiado permeabilizadas, su morfología se volverá inadecuada para la segmentación.La distribución de las intensidades puntuales del ARNm de lac Z antes de la inducción no encaja bien con una distribución normal o Poisson debido a la presencia de manchas con altas intensidades. Cuando se induce la expresión de lac Z, la señal de cinco mRNA Z lac primo aumenta antes de que aumente la señal de ARNm Z de tres lac primo. Si la expresión del lac Z se reprime, las señales de ARNm Z de cinco y tres lac principales disminuyen.Para obtener la tasa de alargamiento de transcripción, el aumento de las cinco y tres señales principales se ajustan con las líneas. Mientras que la tasa de degradación del ARNm se obtiene ajustando la región de descomposición con una función exponencial. Debido a que el pez de molécula única es una técnica de una sola célula, también se pueden analizar las variabilidades de células a células en la transcripción.Además, el análisis de la colocación de cinco arnbas Z de lac primo y tres primos permite cuantificar la densidad de las polimerasas de ARN en el gen lac Z. Como las muestras de diferentes puntos de tiempo se manejan simultáneamente durante este procedimiento. Es importante mantener la muestra separada mientras están en los tubos y en el resbalón de la cubierta.Usando esta técnica de microscopía de una sola molécula. Los investigadores ahora pueden explorar cómo la cinética de la transcripción y la degradación del ARNm están relacionadas con los números absolutos o las ubicaciones subcelulares de los ARNM.

Research

JoVE Journal

Biology

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Fluorescencia In situ</emHibridación> (FISH) Protocolo en el esperma humano

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Investigación

Biología

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Todo el montaje utilizando In situ La hibridación de Enlace de Organismos y Biología Molecular

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

La medición de la cinética de la transcripción de ARNm en las células vivas solo

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cribado de alto rendimiento de la actividad endoglucanasa por hongos en Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

La detección de ARN viral por fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

El aislamiento de los ribosomas polipéptidos nacientes Bound<em&gt; In vitro</em&gt; Para la identificación de sitios de traslación pausa a lo largo del ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapeo bacterianas redes funcionales y vías en<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizando matrices sintéticas genéticos

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Método simple de ADN de fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridación a los cromosomas aplastado

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Las multifacéticas beneficios de la proteína co-expresión en<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...