Name: probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2020-07-30T13:30:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Detta protokoll har utvecklats av S.K. under hennes postdoktorala forskning i Dr. Christine Jacobs-Wagners laboratorium vid Howard Hughes Medical Institute och Microbial Sciences Institute vid Yale University. Vi tackar Dr Jacobs-Wagner och hennes labbmedlemmar för olika ingångar under metodutvecklingen och Laura Troyer för kritisk läsning av manuskriptet. S.K. erkänner stöd från Searle Scholars Program; K.V. erkänner stöd av James Scholar Preble Research Award från University of Illinois.

<ol>
	<li>Bervoets, I., Charlier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity,+versatility+and+complexity+of+bacterial+gene+regulation+mechanisms:+opportunities+and+drawbacks+for+applications+in+synthetic+biology.">Diversity, versatility and complexity of bacterial gene regulation mechanisms: opportunities and drawbacks for applications in synthetic biology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 304-339 (2019).</li><li>Epshtein, V., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+RNA+polymerase+molecules+in+transcription+elongation.">Cooperation between RNA polymerase molecules in transcription elongation.</a> Science. 300 (5620), 801-805 (2003).</li><li>Vogel, U., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+chain+elongation+rate+in+Escherichia+coli+depends+on+the+growth+rate.">The RNA chain elongation rate in Escherichia coli depends on the growth rate.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 2807-2813 (1994).</li><li>Tennyson, C. N., Klamut, H. J., Worton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+dystrophin+gene+requires+16+hours+to+be+transcribed+and+is+cotranscriptionally+spliced.">The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is cotranscriptionally spliced.</a> Nature Genetics. 9, 184 (1995).</li><li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes.">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 16, 1128 (2009).</li><li>Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+RNA+Half-Life+Analysis+in+Escherichia+coli+Reveals+Positional+Patterns+of+Transcript+Degradation.">Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation.</a> Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).</li><li>Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. -. H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+decay+and+abundance+in+Escherichia+coli+at+single-gene+resolution+using+two-color+fluorescent+DNA+microarrays.">Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).</li><li>P&#233;rez-Ort&#237;n, J. E., Medina, D. A., Ch&#225;vez, S., Moreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+do+you+mean+by+transcription+rate.">What do you mean by transcription rate.</a> BioEssays. 35 (12), 1056-1062 (2013).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li><li>Kuchina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+single-cell+RNA+sequencing+by+split-pool+barcoding.">Microbial single-cell RNA sequencing by split-pool barcoding.</a> BioRxiv. , 869248 (2019).</li><li>Blattman, S. B., Jiang, W., Oikonomou, P., Tavazoie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotic+single-cell+RNA+sequencing+by+in+situ+combinatorial+indexing.">Prokaryotic single-cell RNA sequencing by in situ combinatorial indexing.</a> Nature Microbiology. , (2020).</li><li>Femino, A., Fay, F., Fogarty, K., Singer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Montero Llopis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+flow+of+genetic+information+in+bacteria.">Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria.</a> Nature. 466 (7302), 77-81 (2010).</li><li>So, L. -. h., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+properties+of+transcriptional+time+series+in+Escherichia+coli.">General properties of transcriptional time series in Escherichia coli.</a> Nature Genetics. 43 (6), 554-560 (2011).</li><li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells.">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li><li>Jones, D. L., Brewster, R. C., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+architecture+dictates+cell-to-cell+variability+in+gene+expression.">Promoter architecture dictates cell-to-cell variability in gene expression.</a> Science. 346 (6216), 1533-1536 (2014).</li><li>Iyer, S., Park, B. R., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantitative+measurement+of+transcriptional+kinetic+parameters+in+vivo.">Absolute quantitative measurement of transcriptional kinetic parameters in vivo.</a> Nucleic Acids Research. 44 (18), 142 (2016).</li><li>Kim, S., Beltran, B., Irnov, I., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Distance+Cooperative+and+Antagonistic+RNA+Polymerase+Dynamics+via+DNA+Supercoiling.">Long-Distance Cooperative and Antagonistic RNA Polymerase Dynamics via DNA Supercoiling.</a> Cell. 179 (1), 106-119 (2019).</li><li>Wang, M., Zhang, J., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+transcription+at+a+single+gene+copy+reveals+hidden+drivers+of+bacterial+individuality.">Measuring transcription at a single gene copy reveals hidden drivers of bacterial individuality.</a> Nature Microbiology. 4 (12), 2118-2127 (2019).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Labeling DNA (or RNA) for single-molecule FRET. 2012 (9), 1005-1008 (2012).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Ethanol Precipitation of DNA in Microcentrifuge Tubes. 2006 (1), 4456 (2006).</li><li>Skinner, S. O., Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization.">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li><li>Adesnik, M., Levinthal, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+and+degradation+of+lactose+operon+messenger+RNA+in+E.+coli.">The synthesis and degradation of lactose operon messenger RNA in E. coli.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 35, 451-459 (1970).</li><li>Campbell, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+for+rifampicin+inhibition+of+bacterial+RNA+polymerase.">Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase.</a> Cell. 104 (6), 901-912 (2001).</li><li>Raj, A., Tyagi, S., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 472, 365-386 (2010).</li><li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics.">High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Molecular Microbiology. 80 (3), 612-627 (2011).</li><li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oufti:+an+integrated+software+package+for+high-accuracy,+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis.">Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Molecular Microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).</li><li>Moffitt, J. R., Zhuang, X., Filonov, G. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).</li><li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+gene+expression+in+live+cells,+one+protein+molecule+at+a+time.">Probing gene expression in live cells, one protein molecule at a time.</a> Science. 311 (5767), 1600-1603 (2006).</li><li>Chen, H., Shiroguchi, K., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+study+of+mRNA+degradation+and+transcript+elongation+in+Escherichia+coli.">Genome-wide study of mRNA degradation and transcript elongation in Escherichia coli.</a> Molecular Systems Biology. 11 (1), 781 (2015).</li><li>Vogel, U., S&#248;rensen, M., Pedersen, S., Jensen, K. F., Kilstrup, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreasing+transcription+elongation+rate+in+Escherichia+Coli+exposed+to+amino+acid+starvation.">Decreasing transcription elongation rate in Escherichia Coli exposed to amino acid starvation.</a> Molecular Microbiology. 6 (15), 2191-2200 (1992).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+and+translation+contribute+to+gene+locus+relocation+to+the+nucleoid+periphery+in+E.+coli.">Transcription and translation contribute to gene locus relocation to the nucleoid periphery in E. coli.</a> Nature Communications. 10 (1), 5131 (2019).</li><li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast.">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li><li>Fontenete, S., Guimar&#227;es, N., Wengel, J., Azevedo, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+melting+temperatures+in+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+procedures+using+thermodynamic+models.">Prediction of melting temperatures in fluorescence in situ hybridization (FISH) procedures using thermodynamic models.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 36 (3), 566-577 (2016).</li><li>Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Zhang, J., Wang, M., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+gene+regulation+in+individual+cells+reveals+rapid+switching+between+promoter+states.">Measurement of gene regulation in individual cells reveals rapid switching between promoter states.</a> Science. 351 (6278), 1218-1222 (2016).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+shapes+the+turnover+of+a+bacterial+transcriptome.">Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome.</a> eLife. 5, 13065 (2016).</li><li>Fei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+in+vivo+target+search+kinetics+of+regulatory+noncoding+RNA.">Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA.</a> Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).</li></ol>

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Här presenterade vi ett smFISH-protokoll för mätning av mRNA-kinetik i E. coli. I de tidigare publicerade smFISH protokollen för bakterier23, celler hölls i rören tills själva slutet av protokollet, det vill säga tills de är redo för avbildning. Även om det har många fördelar, såsom minimal ospecifik bindning av fluorescerande sonder på täckunderlagetyta 23, är det svårt att följa dessa protokoll när det finns många prover från en tid-kurs experiment. Först behöver en relativt stor volym celler (>1 mL) provsmakas och till och med skördas före fixering. För det andra måste cellproverna centrifugeras flera gånger för att utbyta lösningar och tvätta efter hybridiseringssteget. I vårt protokoll, en liten volym (< 1 mL) av kultur är direkt blandat med en fixlösning i en 1,5-mL rör, hjälper till att snabbt "frysa" celltillståndet vid provtagningsögonblicket. Också, celler stanna fäst vid ytan under hela förfarandet, och olika lösningar kan utbytas snabbt genom att aspirera vätskor med ett vakuum filtreringssystem och tillämpa lösning droppar på en gång med en flerkanalspipett. Denna skillnad gör vårt protokoll mycket fördelaktigt när ett stort antal prover måste bearbetas på en gång. Med hjälp av vårt protokoll kan 12-48 prover hanteras samtidigt och hela FISH-proceduren kan slutföras inom ~8 timmar, ungefär en liknande tid som behövs för några få prover (Bild 2). Även om vi använde uttrycket av lacZ i E. coli som exempel, är protokollet allmänt tillämpliga på olika gener och bakteriearter med överväganden som diskuteras nedan.
För olika gener, det första att tänka på är smFISH sonder. Man får utforma oligonukleotid sonder som kakel mRNA av intresse (Figur 1A)13. I denna "plattsättning" sond tillvägagångssätt, är varje sond ~ 20 bas lång och märkt med en fluorophore vid 5 'eller 3'-ändstationen. Denna strategi är bekväm eftersom ingen genetisk manipulation behövs. Alternativt kan en tandemrest på ~20 bp-sekvens, främmande till den genomiska sekvensen (t.ex. en array av lacO-sekvens i Caulobacter crescentus14), införas i den oöversatta regionen av en gen av intresse och en enda sond som kompletterar upprepningsenheten används för att märka mRNA ("array"-metoden; Bild 1B). I båda fallen dekorerar flera fluoroforer ett mRNA, vilket ger förstärkt fluorescenssignal som lätt kan skiljas från en enda sond ospecifikt bunden inuti en cell.
Om du ska välja "plattsättning" eller "array" tillvägagångssätt beror på den negativa kontrollen, ett prov där ospecifik bindning av sonder testas eftersom den saknar målet mRNA. För plattsättningssonder (Figur 1A), kan en mutant stam utan genen av intresse eller ett tillstånd, där genen inte transkriberas (t.ex. förtrycket av lacZ) fungera som en negativ kontroll för att testa ospecifik bindning av sonder. För den matrisbaserade smFISH (Bild 1B) kan en vildtypsstam som saknar matrisen fungera som en negativ kontroll eftersom den inte innehåller bindningsplatser för sonderna.
Optimala hybridiseringsförhållanden kan bero på sondsekvenserna och till och med valet av fluorofafärgämnen. Vi optimerade hybridiseringsvillkoret för lacZ-probeuppsättningar genom att hålla hybridiseringstemperaturen vid 37 °C och testa olika koncentrationer av probuppsättningar och formamid i hybridiseringslösningen. Högre koncentrationer av formamid tenderar att minska både ospecifik och specifik bindning26,35. Vi rekommenderar att man systematiskt ändrar hybridiseringen och dess tvättförhållanden samtidigt som hybridiseringstiden och temperaturen håller samma. I och med att villkoret blir strängare minskar både ospecifik och specifik bindning (figur 6). Det är viktigt att hitta en punkt där den icke-specifika bindningen börjar träffa under ett godtagbart tröskelvärde utan att ytterligare äventyra specifik bindning. Vi använde till exempel den signalnivå som erhållits utan några sonder ("inga sonder") som ett tröskelvärde (Bild 6).
Den tvåfärgade smFISH-metoden som märker två separata regioner i ett mRNA är begränsat till långa gener. För att mäta graden av transkription töjning, tog vi fördel av det faktum att lacZ är lång (3075 bp) och dess uttryck kan induceras av IPTG. När en gen är kort, är det svårt att utforma två plattsättning sond uppsättningar (nära 5' och 3' slutar) och lösa tidsfördröjningen mellan framträdanden av 5 ' vs. 3 ' mRNA regioner. I detta fall kan man räkna begynnande mRNAs på steady state by smFISH och analysera deras distribution med en analytisk modell som har graden av transkription töjning som en passande parameter20. Också, när en gen av intresse inte är inducible, kan man behandla celler med rifampicin vid tid noll och mäta den tidsmässiga förändringen i 5' och 3' mRNA sub-regioner. Fördröjningen från minskningen av 5' mRNA signal till den av 3' mRNA signal kan sedan användas för att beräkna graden av transkription töjning som gjorttidigare 31.
Slutligen är smFISH-protokollet mångsidigt och kan kombineras med andra märkningsscheman. Tidigare visualiserades DNA-locus tillsammans med mRNAs genom att kombinera mRNA FISH med antingen DNA FISH14 eller fluorescerande reporter-operator system20. Proteinprodukter kan visualiseras genom att man utför immunofluorescens tillsammans med mRNA FISH14,36. Också, det kan kombineras med tredimensionella super-upplösning mikroskopi37 att visualisera mRNAs i alla tredimensionerna 38,39.

Flödet av genetisk information från DNA till mRNA och protein är en av de mest grundläggande cellulära processer, vars reglering är viktigt för cellulär kondition1. Antalet mRNAs i en cell bestäms av två dynamiska processer, transkription och mRNA nedbrytning. Hur transkription och mRNA nedbrytning regleras i tid och rum av en enda cell förblir dock inte helt förstått, till stor del på grund av bristen på experimentella metoder för att kvantitativt mäta deras kinetik in vivo.
Metoder baserade på totalt mRNAs extraherade från en population av celler, såsom Northern blot, RT-PCR, RNA sekvensering, och genuttryck mikroarrayer, kan mäta den relativa skillnaden i mRNA nivåer och har använts i stor utsträckning för att analysera graden av transkription töjning2,3,4,5 ellergraden av mRNA nedbrytning6,7. De ger dock inte det absoluta antalet mRNAs per cell, och därmed, de är inte lämpliga för sondering graden av transkription inledande8. Också, eftersom mRNAs extraheras från en population av celler, kan den rumsliga fördelningen av mRNAs inom en enda cell och variabiliteten av mRNA kopia nummer bland celler inte mätas.
Nästa generations RNA-sekvensering på enskilda celler (scRNAseq) kan kvantifiera antalet mRNAs per cell i en genomisk skala9. Det är dock fortfarande svårt att använda denna teknik för att mäta transkription kinetik, på grund av utmaningar med provberedning och höga kostnader. I synnerhet har tillämpningen av scRNAseq på bakterier varit tekniskt svårt på grund av låg mRNA överflöd10,11.
Single-molecule fluorescens in situ hybridization (smFISH) baseras på hybridiseringen av fluorescently-märkt singel-stranded sonder vars ordnar är kompletterande till uppsätta som mål mRNA avintresserar 12,13. Begreppet sekvensspecifik hybridisering liknar den som används i Northern blot eller RT-PCR, men hybridiseringen sker in situ inom fasta celler, för att bevara den infödda lokaliseringen av mRNAs. Signalen av en enda mRNA förstärks med hjälp av många sonder, ~ 20 nukleotider (nt) i längd, hybridisering till olika delar av en mRNA (Figur 1A)13. I denna "plattsättning" sond tillvägagångssätt, antalet sonder som behövs för att upptäcka en enda mRNA sätter en lägre gräns på längden av mRNA som kan analyseras. Alternativt kan mRNA av intresse vara transkriptionellt smält till en icke-kodande array av tandem Lac operatörssekvenser, så att flera kopior av en fluorescently märkt LacO sond hybridisera till en enda mRNA (Figur 1B)14.
smFISH har använts för att kvantifiera antalet mRNAs per cell vid steady state (dvs. när syntes och förfall är i balans) och för att analysera medelvärdet och variabiliteten av mRNAs bland bakterieceller15,16,17. Nyligen har smFISH tillämpats för att kvantifiera mRNA-tal vid icke-steady state, direkt efter induktion eller förtryck av genuttryck i E. coli18,19,20. De tidsmässiga förändringarna i de absoluta mRNA-kopieringsnumren användes sedan för att beräkna graden av transkriptionsinitiering, töjning och uppsägning, samt graden av mRNA-nedbrytning. För denna ansökan kan konventionella smFISH förfaranden vara besvärligt eftersom det finns många prover, var och en representerar en tidpunkt, som behöver gå igenom flera steg buffertutbyte (dvs centrifugeringen och tvätt). Här beskriver vi ett smFISH-protokoll, där provhanteringsstegen förenklas dramatiskt genom att celler följs till ytan på ett täckskydd och genom att aspirera vätskor med ett vakuumfiltreringssystem14,19. Med hjälp av uttrycket av lacZ i E. coli som exempel, är det fullständiga arbetsflödet ( Figur2) påvisas, inklusive bildanalys (Figur 3) ger in vivo kinetik av transkription (initiering, töjning och uppsägning) och mRNA nedbrytning, cell-till-cell variabilitet i mRNA uttryck, och mRNAIZATION. Vi räknar med att protokollet är allmänt tillämpligt på sond in vivo-kinetik och lokalisering av andra mRNAs hos olika bakteriearter.

probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization

Enmolekylfluorescens in situ-hybridisering (smFISH) möjliggör räkning av absoluta antalet mRNAs i enskilda celler. Här beskriver vi en tillämpning av smFISH att mäta andelen transkription och mRNA nedbrytning i Escherichia coli. Som smFISH bygger på fasta celler, utför vi smFISH vid flera tidpunkter under en time-course experiment, dvs, när celler genomgår synkroniserade förändringar vid induktion eller förtryck av genuttryck. Vid varje tidpunkt är delregioner i ett mRNA spektralt urskiljda till sond transkription töjning och förtida uppsägning. Resultatet av detta protokoll möjliggör också för analys av intracellulära lokalisering av mRNAs och heterogenitet i mRNA kopia nummer bland celler. Med hjälp av detta protokoll många prover (~ 50) kan bearbetas inom 8 h, som den tid som behövs för bara några få prover. Vi diskuterar hur man tillämpar detta protokoll för att studera transkription och nedbrytning kinetik av olika mRNAs i bakterieceller.

Watch this Scientific Journal Video about Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Detta protokoll beskriver en tillämpning av enmolekylfluorescens in situ-hybridisering (smFISH) för att mäta in vivo-kinetiken av mRNA-syntes och nedbrytning.

Sondering mRNA Kinetics i rum och tid i Escherichia coli med hjälp av två-färg single-molecule fluorescens In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

smFISH är känd för att mäta det absoluta antalet som sub cellulära plats för mRNAs. Våra två färg sMFISH protokoll har den extra förmågan att mäta kinetik transkription och mRNA nedbrytning. Med hjälp av denna metod kan många prover bearbetas samtidigt utan extra tid eller ansträngning.Till exempel kan fyra tidskursexperiment som ger 48 prov bearbetas för bildtagning på åtta timmar. Vårt protokoll är i stort sett tillämpligt för många gener och bakteriearter. För att förbereda täckglidningar och glasglas för experimentet.Använd tång för att placera täcksli och rutschkanor i en Coplin burk som innehåller 100%etanol och placera burken i ett vattenbad ultraljud tillgodose 15 till 20 minuter. I slutet av ultraljudsbehandling tvätta diabilder och täcka glider tre till fyra gånger med ultra rent vatten innan påfyllning burken med 70%etanol och upprepa ultraljudsbehandling. När alla ultraljudsbehandling steg är klar, torka locket glider och glider med kvävegas.Placera locket glider i en tom 1000 microliter pipett spets låda och placera bilderna i en ren dialåda. Sedan, efter hålen i pipettspetslådan använd en hydrofoba markör för att rita cirklar på locket glider och tillämpa en 20 microliter droppe 0,1%Poly l lysin till var och en av dessa brunnar. För att ställa in en tidskurs experiment, lägga till 750 mikroliter från en 20 milliliter exponentiellt växande E.coli kultur till en 1,5 milliliter kultur röret märkt tid noll.Och omedelbart invertera röret. Framkalla lac Z-uttryck med 0,2 till en millimolar IPTG och starta en timer. Efter kontroll av timern, samla cellkulturen vid varje på varandra följande experimentella tidpunkter som bara visat.Vid lämplig tidpunkt under försöket, tillsätt fem millimolar ONPF till kolven för att förtränga lac Z uttryck och fortsätta att provsmaka kulturerna för att spåra mRNA nedbrytning. Vid slutet av tidskursprovet förvärv, inkubera proverna i rumstemperatur i 15 minuter följt av inkubation på is i 30 minuter. Vid slutet av inkubationen centrifugera proverna för att avlägsna fixativet och använd en pipett för att avlägsna supernatanten.Åter upphäva bakterierna i en milliliter av DEPC PBS och tvätta cellerna ytterligare två gånger i en milliliter av färska DEPC PBS per tvätt. Efter den sista tvätten, åter upphäva cellerna i 30 mikroliter av färska DEPC PBS. För permeabilisering av cellerna.Tillsätt först provet från varje tidpunkt till enskilda hydrofoba brunnar på en av de etanolsteriliserade glaslocket glider. Och låt cellerna att hålla sig till locket glida med en 10 till 30 minuters inkubation vid rumstemperatur. I slutet av inkubationen, tillsätt 15 mikroliter av 70%etanol till varje brunn.Efter fyra minuter aspirerar du etanolen från varje brunn så att brunnarna är helt torra. Efter tvätt tillsätt 30 mikroliter av pre hybridisering lösning till varje brunn av permeabiliserade celler, och inkubera cellerna i 30 minuter i en 37 grader Celsius ugn. Ersätt lösningen för hybridisering före och med cirka 30 mikroliter av sondhybridiseringslösning per brunn.Och täck kammaren med aluminiumfolie för en två timmars inkubation i 37 grader Celsius ugn. I slutet av inkubationen använd en flerkanalspipett för att skölja brunnarna tre till fem gånger med 30 mikroliter tvättlösning per brunn per tvätt. Efter den sista tvätten, inkubera cellerna i 15 till 30 minuter vid 37 grader Celsius innan du tvättar brunnarna fem gånger med 30 mikroliter färska DEPC PBS per tvätt.Efter den sista tvätten aspirerar du all vätska från täckslien. Och tillsätt fyra mikroliter färska DEPC PBS till varje brunn. Använd tåtor för att försiktigt placera locket glida på en etanol steriliserat glas slide prov sida ner, och använda silikon tandköttet för att täta kanterna på locket slip.För att lokalisera ett område av intresse välj live-läge faskontrast bildbehandling och manövrera scenen joystick för att ändra synfältet inom en brunn. Ligger ett område där celltätheten är optimal och justera Z-fokus så att faskontrastcellens bilder är i fokus. Sedan förvärva en C fem bild med en fyra sekunders exponering, en C tre bild med en två sekunders exponering och en fas kontrast bild med en 0,2 sekunders exponering för cirka 10 olika områden per brunn.Alternativt kan ett NDI-förvärv där C fem- C-tre- och faskontrastbilder förvärvas i serie köras. När alla brunnarna har avbildats öppnar du ett lämpligt cellsegmenteringsverktyg och har oklickat på stapeln. Ladda faskontrastbilderna av intresse och välj oberoende ramar och klicka på compute phase profile as zero.För att börja segmenteringsprocessen under vilken cellerna kommer att identifieras och deras konturer kommer att beräknas. Läs in de parametrar som tillhandahålls i GitHub-mappen och klicka på alla ramar. I slutet av bearbetningen välj kontur för att visualisera nätet.Nästa, under fliken spot upptäckt, avmarkera stack, kontrollera maskor och klicka gnugga för att påbörja dekoridentifiering och kvantifiering baserat på de två D Gaussian montering. Välj den mapp som innehåller de lysrörsbilder och nätfilen som just beräknats från celldetekteringsproceduren och ange det filnamn som de platsidentifieringsresultaten kommer att sparas till. Använd sedan arbetsflödet för bildanalys som tillhandahålls på GitHub för att analysera fluorescensbilderna.I denna fulla synfält ungefär 500 E.coli celler vid en god densitet för cellsegmentering kan observeras. Cellernas morfologi i faskontrastbilderna bör förbli jämförbar med den för levande celler för segmenteringsändamål. Om cellerna är över permeabilized, deras morfologi kommer att bli olämpliga för segmentering.Fördelningen av lac Z mRNA-fläckintensiteter före induktionen passar inte bra med en normal eller Poisson-fördelning på grund av närvaron av fläckar med höga intensiteter. När uttrycket av lac Z induceras signalen av fem prime lac Z mRNA ökar innan de tre främsta lac Z mRNA signalen ökar. Om uttrycket av lac Z är förträngda både fem och tre främsta lac Z mRNA signaler minska.För att få graden av transkription töjning, ökningen av de fem och tre främsta signaler är lämpliga med linjer. Medan graden av mRNA nedbrytning erhålls genom att montera sönderfall regionen med en exponentiell funktion. Eftersom enmolekylfisk är en enda cellteknik kan cell till cellvariation i transkription också analyseras.Dessutom gör analys av colocalization av fem främsta och tre prime lac Z mRNA tätheten av RNA polymeraser på lac Z genen som skall kvantifieras. Som prover från olika tidpunkter hanteras samtidigt under denna procedur. Det är viktigt att hålla provet åtskilda medan de är i rören och på omslaget slip.Med hjälp av denna enda molekyl enda cell mikroskopi teknik. Forskare kan nu undersöka hur transkription och mRNA nedbrytning kinetik är relaterade till de absoluta tal eller subcellulära platser för mRNAs.

Research

JoVE Journal

Biology

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Fluorescens På plats Hybridisering (FISH) Protokoll i mänskliga spermier

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Använda Hela Mount På plats Hybridisering till Link Molekyl-och organismbiologi

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

Att mäta kinetiken av mRNA-transkription i enskilda levande celler

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Hög throughput screening av svamp Endoglucanase aktivitet i Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Detektering av viralt RNA genom Fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosom Bundna framväxande Polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; För att identifiera Translationell Paus webbplatser Längs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Kartläggning Bakteriella funktionella nätverk och vägar i<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Använda syntetiska genetiska Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering och analys av mRNA-molekyler användning av fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Enkel metod för fluorescens-DNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering till kläm Kromosomer

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Det mångfacetterade Fördelar med Protein Samexpression i<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...