Name: probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2020-07-30T13:30:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Bu protokol S.K. tarafından Dr. Christine Jacobs-Wagner'in Howard Hughes Tıp Enstitüsü'ndeki laboratuvarında ve Yale Üniversitesi Mikrobiyal Bilimler Enstitüsü'ndeki doktora sonrası araştırması sırasında geliştirilmiştir. Dr. Jacobs-Wagner ve laboratuvar üyelerine yöntem geliştirme sırasında ki çeşitli girdiler için ve Laura Troyer'a makalenin eleştirel okuması için teşekkür ederiz. S.K. Searle Scholars Programı'nın desteğini kabul eder; K.V. Illinois Üniversitesi'nden James Scholar Preble Araştırma Ödülü'nün desteğini kabul eder.

<ol>
	<li>Bervoets, I., Charlier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity,+versatility+and+complexity+of+bacterial+gene+regulation+mechanisms:+opportunities+and+drawbacks+for+applications+in+synthetic+biology.">Diversity, versatility and complexity of bacterial gene regulation mechanisms: opportunities and drawbacks for applications in synthetic biology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 304-339 (2019).</li><li>Epshtein, V., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+RNA+polymerase+molecules+in+transcription+elongation.">Cooperation between RNA polymerase molecules in transcription elongation.</a> Science. 300 (5620), 801-805 (2003).</li><li>Vogel, U., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+chain+elongation+rate+in+Escherichia+coli+depends+on+the+growth+rate.">The RNA chain elongation rate in Escherichia coli depends on the growth rate.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 2807-2813 (1994).</li><li>Tennyson, C. N., Klamut, H. J., Worton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+dystrophin+gene+requires+16+hours+to+be+transcribed+and+is+cotranscriptionally+spliced.">The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is cotranscriptionally spliced.</a> Nature Genetics. 9, 184 (1995).</li><li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes.">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 16, 1128 (2009).</li><li>Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+RNA+Half-Life+Analysis+in+Escherichia+coli+Reveals+Positional+Patterns+of+Transcript+Degradation.">Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation.</a> Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).</li><li>Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. -. H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+decay+and+abundance+in+Escherichia+coli+at+single-gene+resolution+using+two-color+fluorescent+DNA+microarrays.">Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).</li><li>P&#233;rez-Ort&#237;n, J. E., Medina, D. A., Ch&#225;vez, S., Moreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+do+you+mean+by+transcription+rate.">What do you mean by transcription rate.</a> BioEssays. 35 (12), 1056-1062 (2013).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li><li>Kuchina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+single-cell+RNA+sequencing+by+split-pool+barcoding.">Microbial single-cell RNA sequencing by split-pool barcoding.</a> BioRxiv. , 869248 (2019).</li><li>Blattman, S. B., Jiang, W., Oikonomou, P., Tavazoie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotic+single-cell+RNA+sequencing+by+in+situ+combinatorial+indexing.">Prokaryotic single-cell RNA sequencing by in situ combinatorial indexing.</a> Nature Microbiology. , (2020).</li><li>Femino, A., Fay, F., Fogarty, K., Singer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Montero Llopis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+flow+of+genetic+information+in+bacteria.">Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria.</a> Nature. 466 (7302), 77-81 (2010).</li><li>So, L. -. h., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+properties+of+transcriptional+time+series+in+Escherichia+coli.">General properties of transcriptional time series in Escherichia coli.</a> Nature Genetics. 43 (6), 554-560 (2011).</li><li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells.">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li><li>Jones, D. L., Brewster, R. C., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+architecture+dictates+cell-to-cell+variability+in+gene+expression.">Promoter architecture dictates cell-to-cell variability in gene expression.</a> Science. 346 (6216), 1533-1536 (2014).</li><li>Iyer, S., Park, B. R., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantitative+measurement+of+transcriptional+kinetic+parameters+in+vivo.">Absolute quantitative measurement of transcriptional kinetic parameters in vivo.</a> Nucleic Acids Research. 44 (18), 142 (2016).</li><li>Kim, S., Beltran, B., Irnov, I., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Distance+Cooperative+and+Antagonistic+RNA+Polymerase+Dynamics+via+DNA+Supercoiling.">Long-Distance Cooperative and Antagonistic RNA Polymerase Dynamics via DNA Supercoiling.</a> Cell. 179 (1), 106-119 (2019).</li><li>Wang, M., Zhang, J., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+transcription+at+a+single+gene+copy+reveals+hidden+drivers+of+bacterial+individuality.">Measuring transcription at a single gene copy reveals hidden drivers of bacterial individuality.</a> Nature Microbiology. 4 (12), 2118-2127 (2019).</li><li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Labeling DNA (or RNA) for single-molecule FRET. 2012 (9), 1005-1008 (2012).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Ethanol Precipitation of DNA in Microcentrifuge Tubes. 2006 (1), 4456 (2006).</li><li>Skinner, S. O., Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization.">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li><li>Adesnik, M., Levinthal, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+and+degradation+of+lactose+operon+messenger+RNA+in+E.+coli.">The synthesis and degradation of lactose operon messenger RNA in E. coli.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 35, 451-459 (1970).</li><li>Campbell, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanism+for+rifampicin+inhibition+of+bacterial+RNA+polymerase.">Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase.</a> Cell. 104 (6), 901-912 (2001).</li><li>Raj, A., Tyagi, S., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 472, 365-386 (2010).</li><li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics.">High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Molecular Microbiology. 80 (3), 612-627 (2011).</li><li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oufti:+an+integrated+software+package+for+high-accuracy,+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis.">Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Molecular Microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).</li><li>Moffitt, J. R., Zhuang, X., Filonov, G. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).</li><li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+gene+expression+in+live+cells,+one+protein+molecule+at+a+time.">Probing gene expression in live cells, one protein molecule at a time.</a> Science. 311 (5767), 1600-1603 (2006).</li><li>Chen, H., Shiroguchi, K., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+study+of+mRNA+degradation+and+transcript+elongation+in+Escherichia+coli.">Genome-wide study of mRNA degradation and transcript elongation in Escherichia coli.</a> Molecular Systems Biology. 11 (1), 781 (2015).</li><li>Vogel, U., S&#248;rensen, M., Pedersen, S., Jensen, K. F., Kilstrup, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreasing+transcription+elongation+rate+in+Escherichia+Coli+exposed+to+amino+acid+starvation.">Decreasing transcription elongation rate in Escherichia Coli exposed to amino acid starvation.</a> Molecular Microbiology. 6 (15), 2191-2200 (1992).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+and+translation+contribute+to+gene+locus+relocation+to+the+nucleoid+periphery+in+E.+coli.">Transcription and translation contribute to gene locus relocation to the nucleoid periphery in E. coli.</a> Nature Communications. 10 (1), 5131 (2019).</li><li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast.">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li><li>Fontenete, S., Guimar&#227;es, N., Wengel, J., Azevedo, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+melting+temperatures+in+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+procedures+using+thermodynamic+models.">Prediction of melting temperatures in fluorescence in situ hybridization (FISH) procedures using thermodynamic models.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 36 (3), 566-577 (2016).</li><li>Sep&#250;lveda, L. A., Xu, H., Zhang, J., Wang, M., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+gene+regulation+in+individual+cells+reveals+rapid+switching+between+promoter+states.">Measurement of gene regulation in individual cells reveals rapid switching between promoter states.</a> Science. 351 (6278), 1218-1222 (2016).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+shapes+the+turnover+of+a+bacterial+transcriptome.">Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome.</a> eLife. 5, 13065 (2016).</li><li>Fei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+in+vivo+target+search+kinetics+of+regulatory+noncoding+RNA.">Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA.</a> Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Burada, E. colimRNA kinetik ölçmek için bir smFISH protokolü sundu. Daha önce yayınlanan bakteriler için smFISH protokollerinde23, hücreler protokolün sonuna kadar tüplerde tutuldu, yani görüntülemeye hazır olana kadar. Kapak yüzeyi23'tefloresan probların minimum spesifik olmayan bağlanması gibi birçok faydası olsa da, bir zaman kursu deneyinden çok sayıda örnek olduğunda bu protokolleri takip etmek zordur. İlk olarak, nispeten büyük miktarda hücre (>1 mL) saptanmadan önce örneklenmeli ve hatta hasat edilmelidir. İkinci olarak, hücre örneklerinin çözüm değişimi ve hibridizasyon adımından sonra yıkanması için birden çok kez santrifüj edilmesi gerekir. Protokolümüzde, küçük bir kültür hacmi (<1 mL) doğrudan 1,5 mL'lik bir tüpteki sabitleme çözeltisi ile karıştırılır ve örnekleme anında hücre durumunun hızla "dondurulmasına" yardımcı olur. Ayrıca, hücreler işlem boyunca yüzeye bağlı kalır ve farklı çözeltiler vakum filtrasyon sistemi ile sıvıların aspire edilmesi ve çok kanallı pipet ile aynı anda çözelti damlaları uygulanarak hızlı bir şekilde değiştirilebilir. Bu fark, çok sayıda numunenin aynı anda işlenmesi gerektiğinde protokolümüzü son derece avantajlı hale getirir. Protokolümüzü kullanarak, 12-48 numune aynı anda işlenebilir ve tüm FISH prosedürü ~8 saat içinde, yaklaşık birkaç örnek için gerekli olan benzer bir süre içinde tamamlanabilir(Şekil 2). E. coli'deki lacZ ifadesini örnek olarak kullanmamıza rağmen, protokol aşağıda tartışılan hususlar ile farklı genler ve bakteri türleri için yaygın olarak uygulanmaktadır.
Farklı genler için göz önünde bulundurulması gereken ilk şey smFISH sondalarıdır. İlginin mRNA'sını çinileyen oligonükleotid problar tasarlanabilir (Şekil 1A)13. Bu "fayans" sonda yaklaşımında, her prob ~20 baz uzunluğundadır ve 5' veya 3' terminusta bir florofor ile etiketlenir. Hiçbir genetik manipülasyon gerekli olduğu gibi bu strateji uygundur. Alternatif olarak, genomik diziye yabancı olan ~20 bp dizisinin bir tandem tekrarı (örneğin, Caulobacter crescentus14'tekibir dizi lako dizisi), ilgi çekici bir genin çevrilmemiş bölgesine eklenebilir ve tekrar birimine tamamlayıcı tek bir prob mRNA ("dizi" yaklaşımı) etiketlemek için kullanılır; Şekil 1B). Her iki durumda da, birden fazla florofor bir mRNA süsler, kolayca bir hücre içinde özel olarak bağlı olmayan tek bir prob ayırt edilebilir amplifiye floresan sinyali veren.
"Döşeme" veya "dizi" yaklaşımlarının seçilip seçilemeyeceği negatif denetime bağlıdır, hedef mRNA'dan yoksun olduğu için probların spesifik olmayan bağlanmasının test edildiği bir örnek. Fayans probları için(Şekil 1A),genin yazılmaması (örneğin, lacZ'ninbastırılması) ilgi geni veya bir durum olmayan mutant bir tür, probların spesifik olmayan bağlanmasını test etmek için negatif bir kontrol görevi görebilir. Dizi tabanlı smFISH(Şekil 1B)için, diziden yoksun bir yabani tür, problar için bağlayıcı siteler içermediğinden negatif denetim olarak kullanılabilir.
Optimum hibridizasyon koşulları sonda dizilerine ve hatta florofor boyaseçimine bağlı olabilir. LacZ prob setleri için hibridizasyon koşulunu 37 °C'de tutarak ve hibridizasyon çözeltisinde farklı prob setleri ve formamid konsantrasyonlarını test ederek optimize ettik. Formamid yüksek konsantrasyonları hem nonspesifik hem de spesifik bağlayıcılığı azaltmak eğilimindedir26,35. Melezleme süresini ve sıcaklığını aynı tutarken, melezleşme ve yıkama koşullarını sistematik olarak değiştirmenizi öneririz. Durum daha sıkı hale geldikçe, hem spesifik hem de spesifik bağlama azalması(Şekil 6). Spesifik olmayan bağlamanın, belirli bağlamadan daha fazla ödün vermeden kabul edilebilir bir eşiğin altına vurmaya başladığı bir nokta bulmak önemlidir. Örneğin, herhangi bir sonda olmadan elde edilen sinyal düzeyini ("prob yok") eşik olarak kullandık (Şekil 6).
Bir mRNA'nın iki ayrı bölgesini etiketleyen iki renkli smFISH yöntemi uzun genlerle sınırlıdır. Transkripsiyon uzama oranını ölçmek için, lacZ'ın uzun (3075 bp) olduğu ve ifadesinin IPTG tarafından indüklenebildiği gerçeğinden yararlandık. Bir gen kısa olduğunda, iki döşeme sondası seti (5' ve 3' uçlara yakın) tasarlamak ve 5' ile 3' mRNA bölgelerinin görünümleri arasındaki zaman gecikmesini çözmek zordur. Bu durumda, smFISH tarafından sürekli durumda yeni doğan mRNA'ları sayabilir ve transkripsiyon uzama oranı uygun bir parametre20olan analitik bir model ile dağılımlarını analiz edebilir. Ayrıca, ilgi bir gen indüklenebilir olmadığında, bir zaman sıfır rifampisin ile hücreleri tedavi edebilir ve 5've 3'mRNA alt bölgelerinde zamansal değişim ölçmek. 5' mRNA sinyalinin düşürülmesinden 3' mRNA sinyaline gecikme, daha önce31'deyapıldığı gibi transkripsiyon uzama oranını hesaplamak için kullanılabilir.
Son olarak, smFISH protokolü çok yönlüdür ve diğer etiketleme şemaları ile birleştirilebilir. Daha önce, DNA lokusu mRNA FISH ile DNA FISH14 veya floresan muhabir-operatör sistemi20ile birleştirilerek mRNA ile birlikte görselleştirildi. Protein ürünleri mRNA FISH14,36ile birlikte immünororesans gerçekleştirerek görselleştirilebilir. Ayrıca, üç boyutlu süper çözünürlüklü mikroskopi ile kombine edilebilir37 her üç boyutta mRNA görselleştirmek için38,39.

DNA'dan mRNA ve proteine genetik bilgi akışı, regülasyonu hücresel fitness1için önemli olan en temel hücresel süreçlerden biridir. Hücredeki mRNA sayısı transkripsiyon ve mRNA bozulması olmak üzere iki dinamik süreçle belirlenir. Ancak, transkripsiyon ve mRNA bozulmasının tek bir hücrenin zaman ve uzayda nasıl düzenlendiği, büyük ölçüde in vivo daki kinetiklerini nicel olarak ölçmek için deneysel yöntemlerin yetersizliğinden dolayı tam olarak anlaşılamamıştır.
Kuzey leke, RT-PCR, RNA dizilemesi ve gen ekspresyonu mikrodizileri gibi bir hücre popülasyonundan elde edilen toplam mRNA'lara dayalı yöntemler, mRNA düzeylerindeki bağıl farkı ölçebilir ve transkripsiyonuzamaoranını 2,3,4,5 veya mRNA bozulma oranı6,7olarak analiz etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Ancak, hücre başına mRNA mutlak sayısını sağlamaz ve bu nedenle, transkripsiyon başlatma oranını araştırmak için uygun değildir8. Ayrıca, mRNA'lar bir hücre popülasyonundan çıkarıldığı için, mRNA'ların tek bir hücre içindeki mekansal dağılımı ve mRNA kopya numaralarının hücreler arasındaki değişkenliği ölçülemememaktadır.
Tek tek hücrelerde yeni nesil RNA dizilimi (scRNAseq) genomik ölçekte hücre başına mRNA sayısını ölçebilir9. Ancak, örnek hazırlama ve yüksek maliyet ile ilgili zorluklar nedeniyle transkripsiyon kinetik ölçmek için bu tekniği kullanmak zor olmaya devam etmektedir. Özellikle, bakterilere scRNaAseq uygulaması düşük mRNA bolluğu nedeniyle teknik olarak zor olmuştur10,11.
Yerinde hibridizasyonda tek moleküllü floresan (smFISH) floresan etiketli tek iplikli probların melezleştirilmesine dayanır ve dizileri ilgialanının hedef mRNA'sına tamamlayıcıdır12,13. Diziye özgü hibridizasyon kavramı Kuzey blot veya RT-PCR kullanılan benzer, ancak melezleme sabit hücreler içinde yerinde yapılır, mRNA'ların yerel yerelleştirme korumak için. Tek bir mRNA'nın sinyali, bir mRNA'nın farklı kısımlarına hibridize edilebilen, ~20 nükleotit (nt) uzunluğunda birçok prob kullanılarak yükseltilir (Şekil 1A)13. Bu "döşeme" sondası yaklaşımında, tek bir mRNA'yı algılamak için gereken prob sayısı, tazyiklebilen mRNA uzunluğuna daha düşük bir sınır belirler. Alternatif olarak, ilgi mRNA transkripsiyonel tandem Lac operatör dizileri olmayan bir kodlama dizi erimiş olabilir, bir floresan etiketli lacO prob birden fazla kopya tek bir mRNA hibridize gibi (Şekil 1B)14.
smFISH sabit durumda hücre başına mRNA sayısını ölçmek için kullanılmıştır (yani, sentez ve çürüme dengede olduğunda) ve bakteri hücreleri arasında mRNA ortalama ve değişkenlik analiz etmek için15,16,17. Son zamanlarda, smFISH sabit olmayan durumda mRNA numaraları ölçmek için uygulanmıştır, sağ e. coligen ekspresyonu indüksiyon veya baskı sonra18,19,20. Daha sonra mutlak mRNA kopya numaralarındaki zamansal değişiklikler transkripsiyon başlatma, uzama ve sonlandırma oranının yanı sıra mRNA bozulma oranını hesaplamak için kullanıldı. Bu uygulama için, geleneksel smFISH prosedürleri hantal olabilir, çünkü her biri bir zaman noktasını temsil eden, birden fazla arabellek değişim adımlarından geçmesi gereken (yani santrifüj ve yıkama) birçok örnek vardır. Burada, örnek işleme adımlarının, hücrelerin bir kapak kayması yüzeyine yapıştırılarak ve vakum filtrasyon sistemi 14,19ile sıvıları azarlayarak önemli ölçüde basitleştirildiği bir smFISHprotokolünütanımlıyoruz. E. coli'deki lacZ ifadesini örnek olarak kullanarak, transkripsiyon (inisiyasyon, uzama ve sonlandırma) in vivo kinetiği (inisiyasyon, uzama ve sonlandırma) ve mRNA bozunması, mRNA ekspresyonunda hücreden hücreye değişkenlik ve mRNA lokalizasyonu içeren görüntü analizi(Şekil 3)dahil olmak üzere, tam iş akışı(Şekil 2)gösterilmiştir. Protokolün, çeşitli bakteri türlerinde in vivo kinetik ve diğer mRNA'ların lokalizasyonu için yaygın olarak uygulanacağını tahmin ediyoruz.

probing mrna kinetics in space and time in escherichia coli using two-color single-molecule fluorescence in situ hybridization

Yerinde hibridizasyonda tek moleküllü floresan (smFISH) tek tek hücrelerdeki mutlak mRNA sayısını saymaya olanak sağlar. Burada, Escherichia colitranskripsiyon ve mRNA bozulma oranlarını ölçmek için smFISH bir uygulama açıklar. smFISH sabit hücrelere dayandığı için, bir zaman dersi deneyi sırasında, yani hücrelerin gen ekspresyonunun indüksiyonu veya baskısı üzerine senkronize değişiklikler emildiğinde birden fazla zaman noktasında smFISH gerçekleştiriyoruz. Her zaman noktasında, bir mRNA'nın alt bölgeleri transkripsiyon uzamasını ve erken sonlandırmayı araştırmak için ayırt edilir. Bu protokolün sonucu aynı zamanda hücreler arasında mRNA kopya sayılarında mRNA'ların hücre içi lokalizasyonu ve heterojeniteanalizine de olanak sağlar. Bu protokol kullanılarak birçok örnek (~50) sadece birkaç örnek için gereken süre gibi 8 saat içinde işlenebilir. Bakteri hücrelerindeki farklı mRNA'ların transkripsiyon ve bozunma kinetiğini incelemek için bu protokolün nasıl uygulanacağı tartışılmaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Bu protokol, mRNA sentezi ve bozulmasının in vivo kinetiklerini ölçmek için yerinde hibridizasyonda (smFISH) tek moleküllü floresan uygulamasını açıklar.

Situ Hibridizasyonda İki Renkli Tek Moleküllü Floresan Kullanarak Escherichia coli'de Uzay ve Zamanda MRNA KinetikLerini Sondalama

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

smFISH, mutlak sayıyı mRNA'ların alt hücresel konumu olarak ölçmesi ile bilinir. İki renkli sMFISH protokolümüz transkripsiyon ve mRNA bozulmasının kinetiklerini ölçme özelliğine sahiptir. Bu yöntem kullanılarak, birçok örnek ek süre veya çaba olmadan aynı anda işlenebilir.Örneğin, 48 örnek veren dört zaman ders deneyi sekiz saat içinde görüntüleme için işlenebilir. Protokolümüz birçok gen ve bakteri türü için geniş ölçüde geçerlidir. Deney için kapak fişleri ve cam slaytlar hazırlamak için.% 100 etanol içeren bir Coplin kavanoz kapak fişleri ve slaytlar yerleştirmek ve 15 ila 20 dakika boyunca bir su banyosu ultrasonik hitap kavanoz yerleştirin forseps kullanın. Sonication sonunda% 70 etanol ile kavanoz dolum ve sonication tekrarlamadan önce ultra saf su ile slaytlar ve kapak üç ila dört kez kayar yıkayın. Tüm sonication adımları yapıldığında, azot gazı ile kapak fişleri ve slaytlar kuru.Kapak kaymasını boş 1000 mikrolitrelik pipet ucu kutusuna yerleştirin ve slaytları temiz bir slayt kutusuna yerleştirin. Daha sonra, pipet ucu kutusunun deliklerini takiben kapak fişleri üzerine daireler çizmek ve bu kuyuların her birine % 0.1 Poli l lsin 20 mikrolitre likit damla uygulamak için bir hidrofobik marker kullanın. Bir zaman kursu deneyi kurmak için, 20 mililitrelik üssel olarak büyüyen E.coli kültüründen 1,5 mililitrelik kültür tüpüne 750 mikrolitre ekleyin.Ve hemen tüpü ters çevirin. 0.2-bir milimolar IPTG ile lac Z ifadesi indükleyin ve bir zamanlayıcı başlatın. Zamanlayıcıyı kontrol ettikten sonra, hücre kültürünü arka arkaya her deneysel zaman noktasında toplayın.Deney sırasında uygun zaman noktasında, lak Z ifadesini bastırmak için şişeye beş milimolar ONPF ekleyin ve mRNA bozulmasını izlemek için kültürleri örneklemeye devam edin. Zaman kursu numune alımı sonunda, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında örnekleri kuluçka ve 30 dakika buz üzerinde kuluçka. Kuluçka sonunda fiksatif kaldırmak ve supernatant kaldırmak için bir pipet kullanmak için örnekleri santrifüj.DePC PBS bir mililitre bakteri yeniden askıya ve yıkama başına taze DEPC PBS bir mililitre hücreleri iki kez daha yıkayın. Son yıkamadan sonra, 30 mikrolitre taze DEPC PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın. Hücrelerin permeabilizasyonu için.İlk etanol steril cam kapak fişleri biri üzerinde bireysel hidrofobik kuyular için her zaman noktadan örnek ekleyin. Ve hücrelerin oda sıcaklığında 10 ila 30 dakikalık bir kuluçka ile kapak kayma uymak için izin verin. Kuluçka sonunda, her kuyuya %70 etanol15 mikrolitre ekleyin.Dört dakika sonra, kuyular tamamen kuru böylece her kuyudan etanol aspire. Yıkandıktan sonra permeabilize hücrelerin her kuyusuna 30 mikrolitre prehibridizasyon çözeltisi ekleyin ve hücreleri 37 derecelik bir fırında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Ön hibridizasyon çözümünün yerine kuyu başına yaklaşık 30 mikrolitre prob hibridizasyon çözeltisi değiştirin.Ve 37 santigrat derece fırında iki saatlik kuluçka için alüminyum folyo ile oda kapağı. Kuluçka sonunda kuyuları yıkama başına 30 mikrolitre yıkama çözeltisi ile 3-5 kez durulamak için çok kanallı bir pipet kullanın. Son yıkamadan sonra, yıkama başına 30 mikrolitre taze DEPC PBS ile kuyuları beş kez yıkamadan önce hücreleri 37 santigrat derecede 15 ila 30 dakika kuluçkaya yatırın.Son yıkamadan sonra, kapak kayma tüm sıvı aspire. Ve her kuyuya dört mikrolitre taze DEPC PBS ekleyin. Kapak fişini etanol steril cam slayt numunesinin üzerine dikkatlice yerleştirmek için terlikleri kullanın ve kapak fişinin kenarlarını kapatmak için silikon diş sakızını kullanın.İlgi çekici bir alan bulmak için faz kontrast görüntüleme canlı modunu seçin ve bir kuyu içinde görüş alanını değiştirmek için sahne joystick manevra. Hücre yoğunluğunun en uygun olduğu bir alan ve faz kontrast hücre görüntüleri odak olacak şekilde Z odağı ayarlayın. Daha sonra dört saniye pozlama ile bir C beş görüntü elde, iki saniye pozlama ile bir C üç görüntü ve kuyu başına yaklaşık 10 farklı alanlar için 0,2 saniye pozlama ile bir faz kontrast görüntü.Alternatif olarak, C beş, C üç ve faz kontrast görüntülerinin seri olarak elde edildiği bir NDI edinimi çalıştırılabilir. Tüm kuyular görüntülendiğinde, uygun bir hücre segmentasyon aracını açın ve yığına tıklamayı açın. İlgi alanı kontrast görüntülerini yükleyin ve bağımsız kareler seçin ve bilgi işlem aşaması profilini sıfır olarak tıklatın.Hücrelerin tanımlandığı ve konturları hesaplanacaktır segmentasyon sürecine başlamak için. GitHub klasöründe sağlanan parametreleri yükleyin ve tüm kareleri tıklatın. İşlemin sonunda mesh görselleştirmek için kontur seçin.Ardından, nokta algılama sekmesi altında, yığını niçin denetleyin, meshes kontrol edin ve iki D Gaussian uydurma dayalı nokta tanımlama ve nicelik başlamak için ovmak tıklatın. Floresan görüntüleri içeren klasörü ve hücre algılama yordamından yeni hesaplanan kafes dosyasını seçin ve nokta algılama sonuçlarının kaydedileceği dosya adını belirtin. Ardından, floresan görüntülerini analiz etmek için GitHub'da sağlanan görüntü analizi iş akışını kullanın.Bu tam görüş alanında hücre segmentasyonu için iyi bir yoğunlukta yaklaşık 500 E.coli hücresi görülebilir. Faz kontrast görüntüleri hücrelerin morfolojisi segmentasyon amaçlı canlı hücrelerin ki karşılaştırılabilir kalmalıdır. Hücreler aşırı permeabilize ise, onların morfolojisi segmentasyon için uygun hale gelecektir.İndüksiyon öncesi lak Z mRNA nokta yoğunluklarının dağılımı, yüksek yoğunluklu lekelerin varlığı nedeniyle normal veya Poisson dağılımına uymaz. Lac Z ekspresyonu indüklendiğinde, üç asal lak Z mRNA sinyali artmadan önce beş asal lak Z mRNA sinyali artar. Lak Z ifadesi bastırılırsa hem beş hem de üç ana lak Z mRNA sinyalleri azalır.Transkripsiyon uzama oranını elde etmek için, beş ve üç asal sinyallerin yükselişi çizgilerle uyum sağlar. MRNA bozulma oranı, çürüme bölgesinin üstel bir fonksiyonla donatılması ile elde edilir. Tek moleküllü balıktek hücre tekniği olduğundan transkripsiyondaki hücreden hücreye değişkenlikleri de analiz edilebilir.Buna ek olarak, beş asal ve üç prime lak Z mRNA'nın kolokalizasyonunun analizi, lak Z geniüzerindeki RNA polimerazların yoğunluğunun ölçülmesine olanak sağlar. Farklı zaman noktalarından örnekler bu işlem sırasında aynı anda ele alınır gibi. Numuneyi tüplerde ve kapak kapağındayken ayrı tutmak önemlidir.Bu tek moleküllü tek hücreli mikroskopi tekniğini kullanarak. Araştırmacılar artık transkripsiyon ve mRNA bozunma kinetiklerinin mRNA'ların mutlak sayıları veya hücre altı konumları ile nasıl ilişkili olduğunu keşfedebilirler.

Research

JoVE Journal

Biology

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Floresan In situ İnsan Sperm hibridizasyon (FISH) Protokolü

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Tüm Dağı In situ Moleküler Biyoloji ve organizma Biyoloji Link Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

Tek Yaşayan Hücreler mRNA Transkripsiyon Kinetik Ölçüm

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Floresan DNA için Basit Bir Yöntem<em&gt; In Situ</em&gt; Ezilmiş Kromozomlar için Hibridizasyon

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein birlikte-ifade edilme yönlü Faydalar<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...