Name: inhibition of wound epidermis formation via full skin flap surgery during axolotl limb regeneration
Uploaded: 2020-06-24T14:30:00
Duration: 4 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration at JoVE.com

Forfatteren takker Doug for hans konstante opmuntring og urokkelige støtte samt medlemmerne af Melton-laboratoriet for deres nyttige feedback og kommentarer til manuskriptet. Forfatteren vil også gerne takke Harvard Office of Animal Resources (OAR) for deres dedikerede dyrepleje.

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med IACUC (protokol nr.: 11-32) og AAALAC-retningslinjer ved Harvard University.
1. Forberedelse af løsninger og opsætning til anæstesi og genopretning
<ol><li>Forbered frisk 0,1% tricainopløsning til anæstesi og 0,5% sulfamerazinnatriumsaltopløsning til genopretning. Gør opløsningerne ved hjælp af vand egnede til axolotl-opdræt37 i henhold til godkendte IACUC-protokoller ved den relevante forskningsinstitution (f.eks. modificeret Holtfreters løsning). Sørg for, at opløsningerne er godt blandet, og at der er forberedt nok volumen til at nedsænke hele axolotl.<ol>
<li>For at fremstille 0,1% tricainopløsning blandes 1 g tricain og 1 g natriumbicarbonat med 1 liter vand. Løsningen kan skaleres op i henhold til denne opskrift.</li>
		<li>For at fremstille 0,5% sulfamerazinnatriumsaltopløsning blandes 5 g sulfamerazinnatriumsalt med 1 liter vand. Løsningen kan skaleres op i henhold til denne opskrift. Sulfamerazinopløsning er et antibiotikum, der forhindrer bakteriel infektion under kirurgisk genopretning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rens det kirurgiske område ved at sprøjte det ned med Clidox-S eller 70% ethanol. Steriliser kirurgiske værktøjer (tang, dissekering af saks, fjedersaks) ved autoklavering. Hvis du udfører flere operationer, skal du sørge for at sterilisere de kirurgiske værktøjer med en varm perlesterilisator mellem dyr.</li>
	<li>For at oprette genopretningsområdet skal du placere en 15 cm petriskål eller en hvilken som helst beholder, der passer til axolotlen oven på en spand fyldt med våd is. Fyld petriskålen med et lavt niveau af 0,5% sulfamerazinnatriumsaltopløsning, nok til, at axolotl ikke ville blive helt nedsænket. Genopretningen på is efter operationen vil bremse dyrets bevægelse, mens det vågner fra anæstesi, så det suturerede område kan helbrede relativt uforstyrret. BEMÆRK: Denne opsætning kan tilpasses af forskere afhængigt af hvilke materialer de har til rådighed.</li>
</ol>2. Udførelse af den kirurgiske procedure med fuld hudklap
<ol><li>Anæstesi axolotl ved at nedsænke den i en beholder med 0,1% tricainopløsning. Dette vil tage cirka 15-20 minutter. Sørg for, at axolotl faktisk er fuldt aetiseret ved at udføre en haleklemme. Hvis der ikke er noget svar fra axolotl, fortsæt med operationen. BEMÆRK: Brug ældre, større axolotler til denne operation (mindst 15 cm i størrelse). Sørg for, at axolotl forbliver godt hydreret under hele operationen ved at fugte huden med jævne mellemrum med axolotl-systemvand ved hjælp af en plastpipette. Sørg for aseptisk at forberede det kirurgiske sted ved at vande området med steril PBS inden operationen. Dyret skal også placeres på en steril kirurgisk drapering til proceduren.</li>
	<li>Udfør en lem amputation i den distale ende af de zeugopodiale skeletelementer ved hjælp af dissekeringssaksen (figur 1.1).</li>
	<li>Brug fjedersaksen til at lave et lille snit (ca. 2 mm) på den ventrale del af huden (figur 1.2).</li>
	<li>Brug tangen til forsigtigt at skrælle huden tilbage til omtrent midterlinjen af de zeugopodiale skeletelementer og udsætte de underliggende lemmervæv (muskel, knogle osv.) (Figur 1.3). Sørg for ikke at beskadige huden. Se bemærkning efter trin 2.8.</li>
	<li>Amputere det eksponerede underliggende lemvæv ved zeugopodens midterlinje ved hjælp af kirurgisk saks (figur 1.4).</li>
	<li>Skub muskelvævet tilbage med den kirurgiske saks og trim den udsatte knogle. BEMÆRK: Dette er nødvendigt for at sikre forbedret heling og også for at øge operationens succes, da fremspringende knogle kan hakkes mod den suturerede klap og forstyrre integriteten af en intakt hudklap senere.</li>
	<li>Brug tangen til forsigtigt at trække huden med ekstra fuld tykkelse over amputationsplanet for at dække det udsatte underliggende væv og suturen på plads ved at forbinde med den ventrale hud med fuld tykkelse (figur 1.5).</li>
	<li>Sutur de resterende højre og venstre sider af hudklappen ind i de underliggende ventrale dele af intakt hud. Dette kan gøres ved enten at suturere klappens sider på en "kryds-tværs" måde (anbefales) (figur 1.6-1.9) eller blot suturere lige ind i den ventrale hud. Brug tangen og den buede fjedersaks til suturering. Sørg for, at der ikke kan ses eksponeret underliggende væv, og at suturer er bundet stramt (knyttet mindst tre gange). BEMÆRK: Det er afgørende, at den intakte hud ikke beskadiges i trin 2.4, 2.7-2.8. Vi har fundet ud af, at skader på huden med fuld tykkelse er blevet korreleret med mislykkede operationer, da skadeområderne stadig kan danne en lille sårepidermis. Hvis det er muligt, så prøv at bruge et kedeligere par tang, når du afleverer hudklappen i fuld tykkelse.</li>
	<li>Udfør en amputation på det kontralaterale lem (valgfri intern dyrekontrol) ved at amputere det på midten af zeugopod-niveau med kirurgisk saks. Skub muskelvævet tilbage med kirurgisk saks og trim den udsatte knogle. BEMÆRK: En intern kontralateral lemkontrol kan gøres for bedre at vurdere operationens succes under trin 4 i det samme dyr. Amputation af det samme lem i et separat dyr kan dog også bruges til at tjene som kontrol.</li>
</ol>3. Postoperativ genopretning og pleje
<ol><li>Når operationen er afsluttet, skal du placere et Kimwipe eller sterilt papirhåndklæde i bunden af beholderen eller petriskålen for at gøre den våd. Placer dyret i beholderen på våd is og pakk forsigtigt de udsatte ender af Kimwipe eller papirhåndklædet rundt om toppen af dyret for at holde det godt hydreret med sulfamerazinopløsning. Lad være på våd is i 30 minutter til 1 time for at sikre minimal bevægelse under genopretning fra anæstesi.</li>
	<li>Anbring dyret i en statisk husbeholder med 0,5% sulfamerazinopløsning. Axolotler skal forblive i denne opløsning i de første 24 timer for at forhindre infektion.</li>
	<li>Placer axolotl i normalt systemvand og overvåg helbredet dagligt. Sørg for, at ingen suturer falder ud hver dag, da dette kan resultere i dannelse af et lille sår epidermis, som vil forvirre resultaterne. BEMÆRK: Sørg for, at husbeholderen har rigelig plads til, at axolotl'en kan bevæge sig rundt, og minimer chancerne for, at det suturerede lem på axolotl kan komme i kontakt med beholderens sider. Dette vil bidrage til at sikre, at suturerne forbliver på plads, især i den første uge efter operationen.</li>
</ol>4. Vurdering af operationens succes under et stereomikroskop
BEMÆRK: Vi anbefaler at kontrollere dyr under et stereomikroskop mindst en gang om ugen for at vurdere integriteten af den fulde hudklap og operationens succes.
<ol><li>Anæstesi axolotl i 0,1% tricain som i trin 2.1. Sørg for, at der er rigelig plads i beholderen til, at axolotlen kan bevæge sig rundt.</li>
	<li>Hvis du inspicerer i løbet af de første to uger efter operationen, skal du inspicere det suturerede lem ved hjælp af et stereomikroskop for at sikre, at ingen suturer er sprunget ud, og at en klar tynd sårepidermis ikke er synlig overalt. Hvis du inspicerer den tredje uge efter operationen eller senere, skal du sørge for, at der ikke er dannet et blastema, og sammenligne med, hvordan det normale kontrol amputerede lem (enten fra det samme dyr eller et andet dyr) har udviklet sig under regenerering (dvs. om der er dannet et blastema).</li>
	<li>Når du er færdig, skal du returnere axolotl til normale systemvands- og opdrætsforhold.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Spallanzani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prodromo Di Un'opera Da Imprimersi Sopra Le Riproduzioni Animali. , (1768).</li><li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration.">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. , (2018).</li><li>Leigh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+landscape+of+the+blastema+niche+in+regenerating+adult+axolotl+limbs+at+single-cell+resolution.">Transcriptomic landscape of the blastema niche in regenerating adult axolotl limbs at single-cell resolution.</a> Nature Communications. 9 (1), 5153 (2018).</li><li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration.">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li><li>McCusker, C., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+limb+blastema:+cellular+and+molecular+mechanisms+driving+blastema+formation+and+limb+regeneration+in+tetrapods.">The axolotl limb blastema: cellular and molecular mechanisms driving blastema formation and limb regeneration in tetrapods.</a> Regeneration (Oxford). 2 (2), 54-71 (2015).</li><li>Endo, T., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+model+system+for+limb+regeneration.">A stepwise model system for limb regeneration.</a> Developmental Biology. 270 (1), 135-145 (2004).</li><li>Tsai, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+interplay+between+progenitors+and+immune+cells+in+tissue+regeneration+and+homeostasis.">The molecular interplay between progenitors and immune cells in tissue regeneration and homeostasis.</a> Journal of Immunology and Regenerative Medicine. 7, 100024 (2020).</li><li>Godwin, J. W., Pinto, A. R., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+required+for+adult+salamander+limb+regeneration.">Macrophages are required for adult salamander limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9415-9420 (2013).</li><li>Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+cellular+choreography+of+appendage+regeneration.">The molecular and cellular choreography of appendage regeneration.</a> Cell. 165 (7), 1598-1608 (2016).</li><li>Campbell, L. J., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+epidermis+formation+and+function+in+urodele+amphibian+limb+regeneration.">Wound epidermis formation and function in urodele amphibian limb regeneration.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (1), 73-79 (2008).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).</li><li>Sandoval-Guzman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+differences+in+dedifferentiation+and+stem+cell+recruitment+during+skeletal+muscle+regeneration+in+two+salamander+species.">Fundamental differences in dedifferentiation and stem cell recruitment during skeletal muscle regeneration in two salamander species.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 174-187 (2014).</li><li>Tassava, R. A., Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+injury,+nerves,+and+the+wound+epidermis+during+the+initiation+of+amphibian+limb+regeneration.">The roles of injury, nerves, and the wound epidermis during the initiation of amphibian limb regeneration.</a> Differentiation. 4 (1), 23-24 (1975).</li><li>Hay, E. D., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+the+blastema+in+regenerating+limbs+of+the+newt+Triturus+viridescens.+An+autoradiographic+study+using+tritiated+thymidine+to+follow+cell+proliferation+and+migration.">Origin of the blastema in regenerating limbs of the newt Triturus viridescens. An autoradiographic study using tritiated thymidine to follow cell proliferation and migration.</a> Developmental Biology. 3, 26-59 (1961).</li><li>Christensen, R. N., Tassava, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+epithelial+cap+morphology+and+fibronectin+gene+expression+in+regenerating+axolotl+limbs.">Apical epithelial cap morphology and fibronectin gene expression in regenerating axolotl limbs.</a> Developmental Dynamics. 217 (2), 216-224 (2000).</li><li>Repesh, L. A., Oberpriller, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+epidermal+cell+migration+in+wound+healing+during+limb+regeneration+in+the+adult+newt,+Notophthalmus+viridescens.">Scanning electron microscopy of epidermal cell migration in wound healing during limb regeneration in the adult newt, Notophthalmus viridescens.</a> American Journal of Anatomy. 151 (4), 539-555 (1978).</li><li>Neufeld, D. A., Day, F. A., Settles, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+role+of+the+basement+membrane+and+dermal+fibers+during+newt+limb+regeneration.">Stabilizing role of the basement membrane and dermal fibers during newt limb regeneration.</a> Anatomical Record. 245 (1), 122-127 (1996).</li><li>Singer, M., Saltpeter, M. M., Zarrow, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Growth in Living Systems. , (1961).</li><li>Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+adult+newt+limb+regeneration+of+partial+and+complete+skin+flaps+over+the+amputation+surface.">Effects on adult newt limb regeneration of partial and complete skin flaps over the amputation surface.</a> Journal of Experimental Zoology. 195 (1), 117-128 (1976).</li><li>Tassava, R. A., Garling, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+responses+in+larval+axolotl+limbs+with+skin+grafts+over+the+amputation+surface.">Regenerative responses in larval axolotl limbs with skin grafts over the amputation surface.</a> Journal of Experimental Zoology. 208 (1), 97-110 (1979).</li><li>Tornier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Der+Kampf+der+Gewebe+im+Regeneratbei+Begunsiigung+der+Hautregeneralion.">Der Kampf der Gewebe im Regeneratbei Begunsiigung der Hautregeneralion.</a> Arch. Entwmech. 22, 348-352 (1906).</li><li>Goss, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+inhibition+following+limb+amputation+and+immediate+insertion+into+the+body+cavity.">Regenerative inhibition following limb amputation and immediate insertion into the body cavity.</a> Anatomical Record. 126 (1), 15-27 (1956).</li><li>Thornton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+apical+cap+removal+on+limb+regeneration+in+Amblystoma+larvae.">The effect of apical cap removal on limb regeneration in Amblystoma larvae.</a> Journal of Experimental Zoology. 134 (2), 357-381 (1957).</li><li>Thornton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+limb+regeneration+in+urodele+larvae+by+localized+irradiation+with+ultraviolet+light.">The inhibition of limb regeneration in urodele larvae by localized irradiation with ultraviolet light.</a> Journal of Experimental Zoology. 137 (1), 153-179 (1958).</li><li>Tsai, S. L., Baselga-Garriga, C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midkine+is+a+dual+regulator+of+wound+epidermis+development+and+inflammation+during+the+initiation+of+limb+regeneration.">Midkine is a dual regulator of wound epidermis development and inflammation during the initiation of limb regeneration.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).</li><li>Elewa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading+and+editing+the+Pleurodeles+waltl+genome+reveals+novel+features+of+tetrapod+regeneration.">Reading and editing the Pleurodeles waltl genome reveals novel features of tetrapod regeneration.</a> Nature Communications. 8 (1), 2286 (2017).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Looso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+de+novo+assembly+of+the+newt+transcriptome+combined+with+proteomic+validation+identifies+new+protein+families+expressed+during+tissue+regeneration.">A de novo assembly of the newt transcriptome combined with proteomic validation identifies new protein families expressed during tissue regeneration.</a> Genome Biology. 14 (2), 16 (2013).</li><li>Abdullayev, I., Kirkham, M., Bjorklund, A. K., Simon, A., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reference+transcriptome+and+inferred+proteome+for+the+salamander+Notophthalmus+viridescens.">A reference transcriptome and inferred proteome for the salamander Notophthalmus viridescens.</a> Experimental Cell Research. 319 (8), 1187-1197 (2013).</li><li>Burns, J. A., Zhang, H., Hill, E., Kim, E., Kerney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+illuminates+the+nature+of+the+intracellular+interaction+in+a+vertebrate-algal+symbiosis.">Transcriptome analysis illuminates the nature of the intracellular interaction in a vertebrate-algal symbiosis.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Nakamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+for+the+study+of+early+processes+of+retinal+regeneration+in+the+adult+newt,+Cynops+pyrrhogaster.">A transcriptome for the study of early processes of retinal regeneration in the adult newt, Cynops pyrrhogaster.</a> PLoS One. 9 (10), 109831 (2014).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-scale+assembly+of+the+axolotl+genome.">A chromosome-scale assembly of the axolotl genome.</a> Genome Research. 29 (2), 317-324 (2019).</li><li>Arenas Gomez, C. M., Woodcock, R. M., Smith, J. J., Voss, S. R., Delgado, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+transcriptomics+to+enable+a+plethodontid+salamander+(Bolitoglossa+ramosi)+for+limb+regeneration+research.">Using transcriptomics to enable a plethodontid salamander (Bolitoglossa ramosi) for limb regeneration research.</a> BMC Genomics. 19 (704), (2018).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+optimization+of+CRISPR-Cas9-mediated+genome+engineering+in+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Application and optimization of CRISPR-Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li><li>Joven, A., Elewa, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+regeneration:+salamanders.">Model systems for regeneration: salamanders.</a> Development. 146 (14), (2019).</li><li>Johnson, K., Bateman, J., DiTommaso, T., Wong, A. Y., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+cell+cycle+activation+is+induced+following+complex+tissue+injury+in+axolotl.">Systemic cell cycle activation is induced following complex tissue injury in axolotl.</a> Developmental Biology. 433 (2), 461-472 (2018).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Denne artikel beskriver en protokol til udførelse af fuld hudklapoperationer i axolotl lemmer for at hæmme dannelsen af sårepidermis. Mens denne operation er relativt enkel og teknisk reproducerbar sammenlignet med andre metoder til at hæmme dannelsen af sårepidermis, er der flere kritiske trin, der kan påvirke operationens succes. For det første, når du trækker den intakte fulde hudklap over det udsatte underliggende væv, er det afgørende, at huden med fuld tykkelse ikke beskadiges på nogen måde. Skader på hudklappen kan stadig føre til dannelse af en lille sårepidermis, hvilket kan resultere i en lille blastema-lignende udvækst. For det andet skal du sikre, at suturer ikke falder ud under postoperativ pleje, da dette også kan føre til dannelse af en lille sårepidermis. Til dette punkt er det vigtigt at minimere den potentielle kontakt mellem det suturerede lem og eventuelle overflader, især i den første uge efter operationen. Flere måder at forhindre dette på indebærer at huse og anæstesi axolotl i en stor nok beholder, således at axolotl har masser af plads til at bevæge sig rundt efter operationen.
Denne operation har også flere begrænsninger. Måske er det mest bemærkelsesværdige, at succesen med operationer kun kan vurderes på to måder: Brug af dissekeringsomfanget i løbet af de første to uger af operationen til at søge efter fravær af en sårepidermis og / eller kontrollere, om der dannes et blastema inden for 3 uger. Mens disse metoder er effektive, er de relativt lave gennemstrømninger. Udviklingen af fremtidige transgene reporter axolotler til sår epidermis-specifikke markører kan hjælpe med hurtigere screening for vellykkede versus mislykkede operationer. Desuden er denne operation vanskeligere at udføre på yngre dyr, da den intakte hud er mere skrøbelig. Brug af sub-voksne eller voksne axolotler anbefales derfor.
Mens denne operation oprindeligt blev udviklet i N. viridiscens19, er den let tilpasset axolotls25,39 og kan sandsynligvis også anvendes på andre salamanderarter. Sammenfattende vil anvendelse af denne teknik til fremtidige lemmer regenerative undersøgelser give forskere mulighed for både at udvikle flere værktøjer til at tackle sår epidermis biologi og identificere de underliggende mekanismer, der driver dens funktion i initiering af blastema dannelse.

Siden Lazzaro Spallanzani rapporterede det i 17681, har regenerering af salamanderlemmer været et af de mest velstuderede naturlige regenerative fænomener, der har fortryllet biologer i århundreder. Vellykket regenerering af lemmer afhænger af dannelsen, udvæksten og efterfølgende mønster af en udifferentieret cellulær struktur kendt som blastema. Forskere har gjort betydelige fremskridt med at forstå blastemaets cellulære sammensætning samt hvilke støttende væv og celletyper der er nødvendige for dets dannelse2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Alligevel forbliver de koordinerede signalmekanismer mellem forskellige væv og celletyper, der fører til initiering af blastemadannelse, dårligt forstået.
Et centralt krav til vellykket blastemadannelse og regenerering er sårepidermis, et forbigående og specialiseret epitel, der dækker amputationsplanet inden for 12 timer efter amputation10. Efter amputation migrerer epitelceller fra den intakte hud, der er proksimal til skaden, hurtigt over amputationsplanet for at danne et tyndt sårepitel14. Da blastema dannes i de følgende uger, udvikler den tidlige sårepidermis sig til en tykkere epitelsignalstruktur kaldet den apikale epitelhætte (AEC)15. Mens normal hud med fuld tykkelse indeholder både et epitel- og dermalt lag adskilt af en basal lamina, består sårepidermis / AEC kun af et epitellag og mangler en basal lamina16,17. Fraværet af basal lamina og dermis muliggør direkte kontakt mellem sårepitelcellerne og det underliggende væv, hvilket letter tovejssignalering mellem de to rum, der er kritisk for både blastemadannelse og vedligeholdelse17,18.
Klassiske eksperimentelle undersøgelser udtænkte forskellige innovative kirurgiske metoder til at undersøge sårepidermis / AEC-funktion og nødvendighed ved at hæmme dens dannelse. Disse metoder omfattede suturering19 eller podning af huden med fuld tykkelse20,21 over amputationsplanet, straks suturering af det amputerede lem i kropshulrummet22 og kontinuerlig daglig fjernelse eller bestråling af den tidlige sårepidermis og AEC23,24. Alt i alt fastslog disse eksperimenter ikke kun betydningen af sårepermermis/AEC, men bestemte også yderligere dets roller i tidlig vævssytolyse samt opretholdelse af stamcelleproliferation og blastemal udvækst13 gennem hele regenereringen.
Imidlertid var disse tidligere undersøgelser stort set begrænset til histologisk farvning såvel som tritierede thymidinimpulser for at spore celleproliferation. Faktisk er det først for nylig blevet gjort at revidere disse klassiske eksperimenter med moderne sekventeringsteknologier og funktionelle teknikker i salamandere, og det har ført til opdagelsen af yderligere roller for sårepermermis i modulering af inflammation og ECM-nedbrydning / aflejring i tidlige stadier af regenerering25. Med frigivelsen af forskellige salamandergenomer og transkriptomsekvenser26,27,28,29,30,31,32,33,34 samt det voksende antal funktionelle metoder, der er tilgængelige i salamanderarter11,35,36,37,38 , er forskere nu godt positioneret til at begynde at optrævle de molekylære mekanismer, der driver dannelse af sårepidermis, funktion og AEC-udvikling.
Desværre er flere af disse klassiske metoder, der anvendes til at hæmme dannelsen af sårepidermis, teknisk udfordrende og giver vanskeligheder for reproducerbarhed mellem biologiske replikater i det samme eksperiment. For eksempel kan vedligeholdelse af hudtransplantater være udfordrende, da transplantater i sidste ende kan falde af værtslemmet, og fjernelse af såret epidermis / AEC dagligt er vanskeligt uden at beskadige det underliggende væv. Desuden er suturering af det amputerede lem i kropshulrummet udfordrende og kræver også yderligere skade på indsættelsesstedet. På den anden side er suturering af fuld tykkelse hud umiddelbart over amputationsplanet relativt enkel, teknisk reproducerbar og introducerer minimal vævsskade. Denne kirurgiske metode med fuld hudklap (FSF) blev tidligere udviklet af Anthony Mescher i 1976 hos voksne newts (Notophthalmus viridiscens). Han demonstrerede, at FSF-operationen hæmmede dannelsen og funktionen af sårepidermis ved at forbyde både epitelcellemigration over amputationsplanet og direkte kontakt mellem epitelceller og det underliggende væv.
Her vises denne kirurgiske procedure trin for trin ved hjælp af axolotllemmet. Sammen med moderne molekylære og sekventeringsteknologier kan denne teknik vise sig at være meget nyttig for forskere til at uddybe vores forståelse af såretididermis / AEC-dannelse og funktion under regenerering af lemmer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Curved spring scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>886-86-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td>Need two pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon monofilament sutures (9-0)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>SUT-1000-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamerazine sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>127-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inhibition of wound epidermis formation via full skin flap surgery during axolotl limb regeneration

Klassiske eksperimenter i salamander regenerativ biologi i løbet af det sidste århundrede har længe fastslået, at sårepidermis er en afgørende signalstruktur, der dannes hurtigt efter amputation og er nødvendig for regenerering af lemmer. Metoder til at studere dens præcise funktion på molekylært niveau i løbet af de sidste årtier har imidlertid været begrænset på grund af en mangel på præcise funktionelle teknikker og genomisk information, der er tilgængelig i salamandermodelsystemer. Spændende er det, at den seneste overflod af sekventeringsteknologier kombineret med frigivelsen af forskellige salamandergenomer og fremkomsten af funktionelle genetiske testmetoder, herunder CRISPR, gør det muligt at genbesøge disse grundlæggende eksperimenter i hidtil uset molekylær opløsning. Her beskriver jeg, hvordan man udfører den klassisk udviklede full skin flap (FSF) kirurgi i voksne axolotler for at hæmme dannelsen af sårepidermis umiddelbart efter amputation. Sårepidermis dannes normalt via distal migration af epitelceller i huden proksimal til amputationsplanet for at forsegle såret fra det ydre miljø. Operationen indebærer straks suturering af fuld tykkelse hud (som omfatter både epidermale og dermale lag) over amputationsplanet for at forhindre epitelcellemigration og kontakt med de underliggende beskadigede mesenkymale væv. Vellykkede operationer resulterer i hæmning af blastemadannelse og regenerering af lemmer. Ved at kombinere denne kirurgiske metode med nutidige nedstrøms molekylære og funktionelle analyser kan forskere begynde at afdække det molekylære grundlag for sårepidermis funktion og biologi under regenerering af lemmer.

Denne kirurgiske protokol vil muliggøre fuldstændig hæmning af dannelse af sårepidermis (figur 1) og i sidste ende regenerering af lemmer. En vellykket operation resulterer i ingen blastemadannelse i cirka 2-3 uger afhængigt af dyrets størrelse, mens kontrolregenererende lemmer normalt skal danne et blastema.
Forskere bør inspicere det suturerede lem med det blotte øje hver 2-3 dage for at sikre, at suturerne ikke er sprunget ud, og at der ikke dannes et blastema. Hvis en eller flere af suturerne springer ud, kan der stadig dannes en sårepaidermis, hvilket resulterer i enten et lille eller stort blastema og en mislykket operation (figur 2). Derudover bør forskere inspicere det suturerede lem mindst en gang om ugen under et stereomikroskop for at sikre, at en tynd sårepidermis ikke er tydelig overalt på amputationsoverfladen. Til sammenligning bør forskere også undersøge det kontrolregenererende lem, som skal have en sårepræidermis over amputationsplanet og danne et blastema over 2-3 uger. Sårepidermis vil fremstå tynd og klar, mens den normale hud vil fremstå mere uigennemsigtig og lyserød (næsten hvid), lysegul eller mørkegrøn i henholdsvis leukistiske, albino eller vildtype axolotler.
Hvis forskere ønsker at indsamle væv før blastemadannelsesstadierne efter 2-3 uger, bør de inspicere de suturerede lemmer inden prøveindsamling for at sikre, at suturerne forblev på plads, og at der ikke blev dannet en lille sårepidermis. Derudover kan sektionering sagitært gennem det suturerede lemvæv og udførelse af histologiske analyser til enhver tid også verificere tilstedeværelsen af dermis fra den fulde hudklap, der omkranser hele amputationsplanet, og fraværet af en sårepidermis (figur 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk oversigt over trinnene i den fulde hudklapoperation. Trinene i protokollen er nummereret og diagrammet her. De prikkede linjer angiver amputationsplanerne ved trin 1 og 3 i protokollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig02.jpg"> Figur 2: Eksempler på vellykkede og mislykkede operationer med fuld hudflap. Repræsentativt lysfeltbillede af et lem, der har gennemgået en vellykket operation (venstre), en mislykket operation (højre) og et kontrolregenererende lem (ingen operation) 25 dage efter amputation (dpa). Den vellykkede operation har et fladt amputationsplan, hvor den fulde hudklap blev sutureret over, mens den mislykkede operation har et lille blastema under udvikling. Pilespidser betegner amputationsplanet, og hvide prikkede linjer er der for at hjælpe visualisering af fraværet af et blastema i den vellykkede operation og tilstedeværelse af blastemas i den mislykkede operation og kontrol regenererende lemmer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig03.jpg"> Figur 3: Histologisk farvning af normale regenererende og FSF suturerede lemmer. (A-B«) Repræsentative lysfeltbilleder af picro-mallory farvede sektioner fra regenererende (A-A') og suturerede axolotl-lemmer (B-B') ved 7 dpa. Indsætninger i A og B er vist i henholdsvis A' og B'. Det kollagentunge dermale lag linjer og dækker hele amputationsplanet i suturerede lemmer. Amputationsplan betegnes med pilespidser i A-B. Skalabjælker repræsenterer 500 μm. Denne figur blev tilpasset fra Tsai et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration at JoVE.com

Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

Denne artikel beskriver, hvordan man udfører en kirurgisk metode til at hæmme dannelsen af sårepidermis under regenerering af axolotl-lemmer ved straks at suturere huden i fuld tykkelse over amputationsplanet. Denne metode gør det muligt for forskere at undersøge de funktionelle roller af såret epidermis i de tidlige stadier af lemmer regenerering.

Inhibering af sårepidermisdannelse via fuld hudklapkirurgi under regenerering af axolotl-lemmer

Classical experiments in salamander regenerative biology over the last century have long established that the wound epidermis is a crucial signaling ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hurtig genetisk analyse af Epithelial-mesenkyme Signaling Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Langsigtet, høj opløsning Konfokal Time Lapse Imaging af<em&gt; Arabidopsis Kimblad</em&gt; Epidermis under spiring

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Metoder til Hud sårbarhed og Analyser for Wound Svar i<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Kvantificere leukocyt udgang via lymfekar fra Murine hud og tumorer

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...