Name: inhibition of wound epidermis formation via full skin flap surgery during axolotl limb regeneration
Uploaded: 2020-06-24T14:30:00
Duration: 4 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration at JoVE.com

De auteur bedankt Doug voor zijn constante aanmoediging en niet-aflatende steun, evenals de leden van het Melton-lab voor hun nuttige feedback en opmerkingen over het manuscript. De auteur wil ook het Harvard Office of Animal Resources (OAR) bedanken voor hun toegewijde dierenverzorging.

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de IACUC (Protocol #: 11-32) en AAALAC-richtlijnen aan de Harvard University.
1. Oplossingen voorbereiden en instellen voor anesthesie en herstel
<ol><li>Bereid verse 0,1% tricaïne-oplossing voor anesthesie en 0,5% sulfamerazine natriumzoutoplossing voor herstel. Maak de oplossingen met water geschikt voor axolotl-veehouderij37 volgens goedgekeurde IACUC-protocollen bij de betreffende onderzoeksinstelling (bijvoorbeeld de oplossing van Holtfreter aangepast). Zorg ervoor dat de oplossingen goed gemengd zijn en dat er voldoende volume is voorbereid om de hele axolotl onder te dompelen.<ol>
<li>Om 0,1% tricaïne-oplossing te bereiden, mengt u 1 g tricaïne en 1 g natriumbicarbonaat met 1 l water. De oplossing kan volgens dit recept worden opgeschaald.</li>
		<li>Om 0,5% sulfamerazine natriumzoutoplossing te bereiden, mengt u 5 g sulfamerazine natriumzout met 1 l water. De oplossing kan volgens dit recept worden opgeschaald. Sulfamerazine-oplossing is een anti-bioticum dat bacteriële infectie tijdens chirurgisch herstel zal voorkomen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ontsmet het operatiegebied door het te besproeien met Clidox-S of 70% ethanol. Steriliseer chirurgische hulpmiddelen (tang, ontleedschaar, veerschaar) door autoclaveren. Als u meerdere operaties uitvoert, zorg er dan voor dat u de chirurgische hulpmiddelen steriliseert met een hete kraalsterilisator tussen dieren.</li>
	<li>Om het herstelgebied in te stellen, plaatst u een petrischaal van 15 cm of een container die op de axolotl past bovenop een emmer gevuld met nat ijs. Vul de petrischaal met een laag gehalte van 0,5% sulfamerazine natriumzoutoplossing, voldoende zodat de axolotl niet volledig onder water komt te staan. Het herstel op ijs na de operatie zal de beweging van het dier vertragen terwijl het ontwaakt uit anesthesie, waardoor het hechte gebied relatief ongestoord kan genezen. OPMERKING: Deze opstelling kan door onderzoekers worden aangepast, afhankelijk van welke materialen ze beschikbaar hebben.</li>
</ol>2. Het uitvoeren van de volledige huid flap chirurgische ingreep
<ol><li>Verdoof de axolotl door deze onder te dompelen in een container met 0,1% tricaïne-oplossing. Dit duurt ongeveer 15-20 minuten. Zorg ervoor dat de axolotl inderdaad volledig verdoofd is door een staartknijp uit te voeren. Als er geen reactie van de axolotl is, ga dan verder met de operatie. OPMERKING: Gebruik oudere, grotere axolotls voor deze operatie (minstens 15 cm groot). Zorg ervoor dat de axolotl gedurende de hele operatie goed gehydrateerd blijft door de huid periodiek nat te maken met axolotl-systeemwater met behulp van een plastic pipet. Zorg ervoor dat u de operatieplaats aseptisch voorbereidt door het gebied voorafgaand aan de operatie te irrigeren met steriele PBS. Het dier moet ook op een steriel chirurgisch gordijn worden geplaatst voor de procedure.</li>
	<li>Voer een ledemaatamputatie uit aan het distale uiteinde van de zeugopodiale skeletelementen met behulp van de ontleedschaar (figuur 1.1).</li>
	<li>Maak met de voorjaarsschaar een kleine incisie (ongeveer 2 mm) op het ventrale deel van de huid (figuur 1.2).</li>
	<li>Gebruik de tang om de huid voorzichtig terug te pellen tot ongeveer de middellijn van de zeugopodiale skeletelementen, waardoor de onderliggende ledemaatweefsels (spier, bot, enz.) worden blootgesteld (Figuur 1.3). Zorg ervoor dat u de huid niet beschadigt. Zie opmerking na stap 2.8.</li>
	<li>Amputer de blootgestelde onderliggende ledemaatweefsels aan de middellijn van de zeugopode met behulp van een chirurgische schaar (figuur 1.4).</li>
	<li>Duw het spierweefsel terug met de chirurgische schaar en trim het blootgestelde bot. OPMERKING: Dit is nodig om een betere genezing te garanderen en ook om het succes van de operatie te vergroten, omdat uitstekend bot tegen de gehechte flap kan worden gekarteld en later de integriteit van een intacte huidflap kan verstoren.</li>
	<li>Trek met behulp van de tang voorzichtig de extra huid van volledige dikte over het amputatievlak om de blootgestelde onderliggende weefsels en hechting op zijn plaats te bedekken door verbinding te maken met de ventrale huid van volledige dikte (figuur 1.5).</li>
	<li>Hecht de resterende rechter- en linkerkant van de huidflap in de onderliggende ventrale delen van de intacte huid. Dit kan worden gedaan door de zijkanten van de flap op een "kriskras" manier te hechten (aanbevolen) (figuur 1.6-1.9), of gewoon recht in de ventrale huid te hechten. Gebruik de tang en gebogen veerschaar voor het hechten. Zorg ervoor dat er geen blootgestelde onderliggende weefsels te zien zijn en dat hechtingen strak zijn vastgebonden (minstens drie keer geknoopt). OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat de intacte huid niet wordt beschadigd in stap 2.4, 2.7-2.8. We hebben ontdekt dat schade aan de huid van volledige dikte is gecorreleerd met mislukte operaties, omdat de gebieden met schade nog steeds een kleine wondepidemis kunnen vormen. Probeer indien mogelijk een doffere tang te gebruiken bij het overhandigen van de huidflap van volledige dikte.</li>
	<li>Voer een amputatie uit op de contralaterale ledemaat (optionele interne diercontrole) door deze te amputeren op mid-zeugopod-niveau met een chirurgische schaar. Duw het spierweefsel terug met een chirurgische schaar en trim het blootgestelde bot. OPMERKING: Een interne contralaterale ledemaatcontrole kan worden uitgevoerd om het succes van de operatie tijdens stap 4 bij hetzelfde dier beter te beoordelen. Amputatie van dezelfde ledemaat in een afzonderlijk dier kan echter ook worden gebruikt om als controle te dienen.</li>
</ol>3. Postoperatief herstel en zorg
<ol><li>Zodra de operatie is voltooid, plaatst u een Kimwipe of steriele papieren handdoek op de bodem van de container of petrischaal om deze nat te maken. Plaats het dier in de container op nat ijs en wikkel de blootgestelde uiteinden van de Kimwipe of papieren handdoek voorzichtig rond de bovenkant van het dier om het goed gehydrateerd te houden met sulfamerazine-oplossing. Laat 30 minuten tot 1 uur op nat ijs staan om minimale beweging te garanderen tijdens het herstel van de anesthesie.</li>
	<li>Plaats het dier in een statische behuizingscontainer met 0,5% sulfamerazine-oplossing. Axolotls moeten de eerste 24 uur in deze oplossing blijven om infectie te voorkomen.</li>
	<li>Plaats de axolotl in normaal systeemwater en controleer de gezondheid dagelijks. Zorg ervoor dat er elke dag geen hechtingen uitvallen, omdat dit kan resulteren in de vorming van een kleine wond epidermis die de resultaten zal verstoren. OPMERKING: Zorg ervoor dat de behuizingscontainer voldoende ruimte heeft voor de axolotl om te bewegen en minimaliseer de kans dat de gehechte ledemaat op de axolotl in contact kan komen met de zijkanten van de container. Dit zal helpen om ervoor te zorgen dat de hechtingen op hun plaats blijven, vooral tijdens de eerste week na de operatie.</li>
</ol>4. Beoordeling van het succes van de operatie onder een stereomicroscoop
OPMERKING: We raden aan om dieren minstens één keer per week onder een stereomicroscoop te controleren om de integriteit van de volledige huidflap en het succes van de operatie te beoordelen.
<ol><li>Verdoof de axolotl in 0,1% tricaïne zoals in stap 2.1. Zorg ervoor dat er voldoende ruimte in de container is voor de axolotl om te bewegen.</li>
	<li>Als u de eerste twee weken na de operatie inspecteert, inspecteer dan de gehechte ledemaat met behulp van een stereomicroscoop om er zeker van te zijn dat er geen hechtingen zijn uitgesprongen en dat een duidelijke dunne wondepidemis nergens zichtbaar is. Als u inspecteert in de derde week na de operatie of later, zorg er dan voor dat er geen blasteem is gevormd en vergelijk met hoe de normale controle geamputeerde ledemaat (van hetzelfde dier of een ander dier) zich tijdens de regeneratie heeft ontwikkeld (d.w.z. of zich een blasteem heeft gevormd).</li>
	<li>Als u klaar bent, brengt u de axolotl terug naar normale systeemwater- en houderijomstandigheden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Spallanzani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prodromo Di Un'opera Da Imprimersi Sopra Le Riproduzioni Animali. , (1768).</li><li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration.">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. , (2018).</li><li>Leigh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+landscape+of+the+blastema+niche+in+regenerating+adult+axolotl+limbs+at+single-cell+resolution.">Transcriptomic landscape of the blastema niche in regenerating adult axolotl limbs at single-cell resolution.</a> Nature Communications. 9 (1), 5153 (2018).</li><li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration.">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li><li>McCusker, C., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+limb+blastema:+cellular+and+molecular+mechanisms+driving+blastema+formation+and+limb+regeneration+in+tetrapods.">The axolotl limb blastema: cellular and molecular mechanisms driving blastema formation and limb regeneration in tetrapods.</a> Regeneration (Oxford). 2 (2), 54-71 (2015).</li><li>Endo, T., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+model+system+for+limb+regeneration.">A stepwise model system for limb regeneration.</a> Developmental Biology. 270 (1), 135-145 (2004).</li><li>Tsai, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+interplay+between+progenitors+and+immune+cells+in+tissue+regeneration+and+homeostasis.">The molecular interplay between progenitors and immune cells in tissue regeneration and homeostasis.</a> Journal of Immunology and Regenerative Medicine. 7, 100024 (2020).</li><li>Godwin, J. W., Pinto, A. R., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+required+for+adult+salamander+limb+regeneration.">Macrophages are required for adult salamander limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9415-9420 (2013).</li><li>Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+cellular+choreography+of+appendage+regeneration.">The molecular and cellular choreography of appendage regeneration.</a> Cell. 165 (7), 1598-1608 (2016).</li><li>Campbell, L. J., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+epidermis+formation+and+function+in+urodele+amphibian+limb+regeneration.">Wound epidermis formation and function in urodele amphibian limb regeneration.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (1), 73-79 (2008).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).</li><li>Sandoval-Guzman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+differences+in+dedifferentiation+and+stem+cell+recruitment+during+skeletal+muscle+regeneration+in+two+salamander+species.">Fundamental differences in dedifferentiation and stem cell recruitment during skeletal muscle regeneration in two salamander species.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 174-187 (2014).</li><li>Tassava, R. A., Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+injury,+nerves,+and+the+wound+epidermis+during+the+initiation+of+amphibian+limb+regeneration.">The roles of injury, nerves, and the wound epidermis during the initiation of amphibian limb regeneration.</a> Differentiation. 4 (1), 23-24 (1975).</li><li>Hay, E. D., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+the+blastema+in+regenerating+limbs+of+the+newt+Triturus+viridescens.+An+autoradiographic+study+using+tritiated+thymidine+to+follow+cell+proliferation+and+migration.">Origin of the blastema in regenerating limbs of the newt Triturus viridescens. An autoradiographic study using tritiated thymidine to follow cell proliferation and migration.</a> Developmental Biology. 3, 26-59 (1961).</li><li>Christensen, R. N., Tassava, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+epithelial+cap+morphology+and+fibronectin+gene+expression+in+regenerating+axolotl+limbs.">Apical epithelial cap morphology and fibronectin gene expression in regenerating axolotl limbs.</a> Developmental Dynamics. 217 (2), 216-224 (2000).</li><li>Repesh, L. A., Oberpriller, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+epidermal+cell+migration+in+wound+healing+during+limb+regeneration+in+the+adult+newt,+Notophthalmus+viridescens.">Scanning electron microscopy of epidermal cell migration in wound healing during limb regeneration in the adult newt, Notophthalmus viridescens.</a> American Journal of Anatomy. 151 (4), 539-555 (1978).</li><li>Neufeld, D. A., Day, F. A., Settles, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+role+of+the+basement+membrane+and+dermal+fibers+during+newt+limb+regeneration.">Stabilizing role of the basement membrane and dermal fibers during newt limb regeneration.</a> Anatomical Record. 245 (1), 122-127 (1996).</li><li>Singer, M., Saltpeter, M. M., Zarrow, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Growth in Living Systems. , (1961).</li><li>Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+adult+newt+limb+regeneration+of+partial+and+complete+skin+flaps+over+the+amputation+surface.">Effects on adult newt limb regeneration of partial and complete skin flaps over the amputation surface.</a> Journal of Experimental Zoology. 195 (1), 117-128 (1976).</li><li>Tassava, R. A., Garling, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+responses+in+larval+axolotl+limbs+with+skin+grafts+over+the+amputation+surface.">Regenerative responses in larval axolotl limbs with skin grafts over the amputation surface.</a> Journal of Experimental Zoology. 208 (1), 97-110 (1979).</li><li>Tornier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Der+Kampf+der+Gewebe+im+Regeneratbei+Begunsiigung+der+Hautregeneralion.">Der Kampf der Gewebe im Regeneratbei Begunsiigung der Hautregeneralion.</a> Arch. Entwmech. 22, 348-352 (1906).</li><li>Goss, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+inhibition+following+limb+amputation+and+immediate+insertion+into+the+body+cavity.">Regenerative inhibition following limb amputation and immediate insertion into the body cavity.</a> Anatomical Record. 126 (1), 15-27 (1956).</li><li>Thornton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+apical+cap+removal+on+limb+regeneration+in+Amblystoma+larvae.">The effect of apical cap removal on limb regeneration in Amblystoma larvae.</a> Journal of Experimental Zoology. 134 (2), 357-381 (1957).</li><li>Thornton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+limb+regeneration+in+urodele+larvae+by+localized+irradiation+with+ultraviolet+light.">The inhibition of limb regeneration in urodele larvae by localized irradiation with ultraviolet light.</a> Journal of Experimental Zoology. 137 (1), 153-179 (1958).</li><li>Tsai, S. L., Baselga-Garriga, C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midkine+is+a+dual+regulator+of+wound+epidermis+development+and+inflammation+during+the+initiation+of+limb+regeneration.">Midkine is a dual regulator of wound epidermis development and inflammation during the initiation of limb regeneration.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).</li><li>Elewa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading+and+editing+the+Pleurodeles+waltl+genome+reveals+novel+features+of+tetrapod+regeneration.">Reading and editing the Pleurodeles waltl genome reveals novel features of tetrapod regeneration.</a> Nature Communications. 8 (1), 2286 (2017).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Looso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+de+novo+assembly+of+the+newt+transcriptome+combined+with+proteomic+validation+identifies+new+protein+families+expressed+during+tissue+regeneration.">A de novo assembly of the newt transcriptome combined with proteomic validation identifies new protein families expressed during tissue regeneration.</a> Genome Biology. 14 (2), 16 (2013).</li><li>Abdullayev, I., Kirkham, M., Bjorklund, A. K., Simon, A., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reference+transcriptome+and+inferred+proteome+for+the+salamander+Notophthalmus+viridescens.">A reference transcriptome and inferred proteome for the salamander Notophthalmus viridescens.</a> Experimental Cell Research. 319 (8), 1187-1197 (2013).</li><li>Burns, J. A., Zhang, H., Hill, E., Kim, E., Kerney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+illuminates+the+nature+of+the+intracellular+interaction+in+a+vertebrate-algal+symbiosis.">Transcriptome analysis illuminates the nature of the intracellular interaction in a vertebrate-algal symbiosis.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Nakamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+for+the+study+of+early+processes+of+retinal+regeneration+in+the+adult+newt,+Cynops+pyrrhogaster.">A transcriptome for the study of early processes of retinal regeneration in the adult newt, Cynops pyrrhogaster.</a> PLoS One. 9 (10), 109831 (2014).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-scale+assembly+of+the+axolotl+genome.">A chromosome-scale assembly of the axolotl genome.</a> Genome Research. 29 (2), 317-324 (2019).</li><li>Arenas Gomez, C. M., Woodcock, R. M., Smith, J. J., Voss, S. R., Delgado, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+transcriptomics+to+enable+a+plethodontid+salamander+(Bolitoglossa+ramosi)+for+limb+regeneration+research.">Using transcriptomics to enable a plethodontid salamander (Bolitoglossa ramosi) for limb regeneration research.</a> BMC Genomics. 19 (704), (2018).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+optimization+of+CRISPR-Cas9-mediated+genome+engineering+in+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Application and optimization of CRISPR-Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li><li>Joven, A., Elewa, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+regeneration:+salamanders.">Model systems for regeneration: salamanders.</a> Development. 146 (14), (2019).</li><li>Johnson, K., Bateman, J., DiTommaso, T., Wong, A. Y., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+cell+cycle+activation+is+induced+following+complex+tissue+injury+in+axolotl.">Systemic cell cycle activation is induced following complex tissue injury in axolotl.</a> Developmental Biology. 433 (2), 461-472 (2018).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit artikel beschrijft een protocol voor het uitvoeren van volledige huidflapoperaties in axolotl-ledematen om de vorming van wondepidemis te remmen. Hoewel deze operatie relatief eenvoudig en technisch reproduceerbaar is in vergelijking met andere methoden om de vorming van wondepidemis te remmen, zijn er verschillende kritieke stappen die het succes van de operatie kunnen beïnvloeden. Ten eerste, bij het trekken van de intacte volledige huidflap over de blootgestelde onderliggende weefsels, is het van het grootste belang dat de huid van volledige dikte op geen enkele manier wordt beschadigd. Schade aan de huidflap kan nog steeds leiden tot de vorming van een kleine wondepidemis, wat kan resulteren in een kleine blasteemachtige uitgroei. Ten tweede, zorg ervoor dat hechtingen niet uitvallen tijdens postoperatieve zorg, omdat dit ook kan leiden tot de vorming van een kleine wond epidermis. Tot nu toe is het minimaliseren van het potentiële contact tussen de gehechte ledemaat en eventuele oppervlakken belangrijk, vooral tijdens de eerste week na de operatie. Verschillende manieren om dit te voorkomen zijn het huisvesten en verdoven van de axolotl in een container die groot genoeg is, zodat de axolotl voldoende ruimte heeft om na de operatie te bewegen.
Deze operatie heeft ook verschillende beperkingen. Misschien wel het meest opvallende is dat het succes van operaties slechts op twee manieren kan worden beoordeeld: het gebruik van de ontleedkijker tijdens de eerste twee weken van de operatie om te zoeken naar een afwezigheid van een wondepidemis en / of controleren of zich binnen 3 weken een blasteem vormt. Hoewel deze methoden effectief zijn, hebben ze een relatief lage doorvoer. De ontwikkeling van toekomstige transgene reporter axolotls voor wond epidermis-specifieke markers kan helpen bij een snellere screening op succesvolle versus mislukte operaties. Bovendien is deze operatie moeilijker uit te voeren bij jongere dieren omdat de intacte huid kwetsbaarder is. Het gebruik van sub-volwassen of volwassen axolotls wordt daarom aanbevolen.
Hoewel deze operatie oorspronkelijk werd ontwikkeld in N. viridiscens19, is het gemakkelijk aangepast voor axolotls25,39 en kan het waarschijnlijk ook op andere salamandersoorten worden toegepast. Kortom, het toepassen van deze techniek op toekomstige ledemaatregeneratieve studies zal onderzoekers in staat stellen om zowel meer hulpmiddelen te ontwikkelen om wondepidemisbiologie aan te pakken als de onderliggende mechanismen te identificeren die de functie ervan bij het initiëren van blasteemvorming stimuleren.

Sinds Lazzaro Spallanzani het in 17681 meldde, is de regeneratie van salamanderpen een van de best bestudeerde natuurlijke regeneratieve fenomenen die biologen eeuwenlang heeft gecharmeerd. Succesvolle ledemaatregeneratie hangt af van de vorming, uitgroei en daaropvolgende patronen van een ongedifferentieerde cellulaire structuur die bekend staat als het blasteem. Onderzoekers hebben aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het begrijpen van de cellulaire samenstelling van het blasteem en welke ondersteunende weefsels en celtypen nodig zijn voor de vorming ervan2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Toch blijven de gecoördineerde signaleringsmechanismen tussen verschillende weefsels en celtypen die leiden tot het initiëren van blasteemvorming slecht begrepen.
Een belangrijke vereiste voor succesvolle blasteemvorming en regeneratie is de wondepidemis, een voorbijgaand en gespecialiseerd epitheel dat het amputatievlak binnen 12 uur na amputatie bedekt10. Na amputatie migreren epitheelcellen van de intacte huid proximaal naar de verwonding snel over het amputatievlak om een dun wondepitheel te vormen14. Naarmate het blasteem zich in de volgende weken vormt, ontwikkelt de vroege wondepidemis zich tot een dikkere epitheliale signaleringsstructuur die de apicale epitheliale dop (AEC) wordt genoemd15. Terwijl de normale huid van volledige dikte zowel een epitheliale als een dermale laag bevat, gescheiden door een basale lamina, bestaat de wondepithina/AEC alleen uit een epitheellaag en ontbreekt een basale lamina16,17. De afwezigheid van de basale lamina en dermis zorgt voor direct contact tussen de wondepitheelcellen en de onderliggende weefsels, wat bidirectionele signalering tussen de twee compartimenten vergemakkelijkt die van cruciaal belang is voor zowel blasteemvorming als onderhoud17,18.
Klassieke experimentele studies bedachten verschillende innovatieve chirurgische methoden om wondepidemis / AEC-functie en noodzaak te onderzoeken via het remmen van de vorming ervan. Deze methoden omvatten het hechten19 of enten van huid van volledige dikte20,21 over het amputatievlak, het onmiddellijk hechten van de geamputeerde ledemaat in de lichaamsholte22 en continue dagelijkse verwijdering of bestraling van de vroege wondepithoffer en AEC23,24. Al met al hebben deze experimenten niet alleen het belang van de wondepidemis / AEC vastgesteld, maar ook de rol ervan in vroege weefselhistolyse verder bepaald, evenals het handhaven van proliferatie van voorlopercelen en blastemale uitgroei13 tijdens de regeneratie.
Deze eerdere studies waren echter grotendeels beperkt tot histologische kleuring en tritiated thymidine-pulsen om celproliferatie te volgen. In feite is het opnieuw bekijken van deze klassieke experimenten met moderne sequencingtechnologieën en functionele technieken in salamanders pas onlangs gedaan en heeft dit geleid tot de ontdekking van extra rollen voor de wondepidemis bij het moduleren van ontsteking en ECM-degradatie / afzetting tijdens vroege stadia van regeneratie25. Met de afgifte van verschillende salamandergenoom- en transcriptoomsequenties26,27,28,29,30,31,32,33,34, evenals het ontluikende aantal functionele methoden dat beschikbaar is bij salamandersoorten11,35,36,37,38 , zijn onderzoekers nu goed gepositioneerd om te beginnen met het ontrafelen van de moleculaire mechanismen die de vorming, functie en AEC-ontwikkeling van wondepidemis aansturen.
Helaas zijn verschillende van deze klassieke methoden die worden gebruikt om de vorming van wondepidemis te remmen technisch uitdagend, wat problemen oplevert voor de reproduceerbaarheid tussen biologische replicaties in hetzelfde experiment. Het onderhouden van huidtransplantaten kan bijvoorbeeld een uitdaging zijn, omdat grafts uiteindelijk van de ledemaat van de gastheer kunnen vallen en het dagelijks verwijderen van de wondepidemis / AEC moeilijk is zonder de onderliggende weefsels te beschadigen. Bovendien is het hechten van de geamputeerde ledemaat in de lichaamsholte een uitdaging en vereist het ook extra letsel op de plaats van inbrenging. Aan de andere kant is het hechten van de huid van volledige dikte onmiddellijk over het amputatievlak relatief eenvoudig, technisch reproduceerbaar en introduceert het minimale weefselschade. Deze full skin flap (FSF) chirurgische methode werd eerder ontwikkeld door Anthony Mescher in 1976 bij volwassen salamanders (Notophthalmus viridiscens). Hij toonde aan dat de FSF-operatie de vorming en functie van wondepithinamis remde door zowel epitheelcelmigratie over het amputatievlak als direct contact tussen epitheelcellen en de onderliggende weefsels te verbieden.
Hier wordt deze chirurgische ingreep stap voor stap getoond met behulp van de axolotl-ledemaat. In combinatie met moderne moleculaire en sequencingtechnologieën, kan deze techniek zeer nuttig blijken te zijn voor onderzoekers om ons begrip van wondepidemis / AEC-vorming en -functie tijdens ledemaatregeneratie te verdiepen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Curved spring scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>886-86-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td>Need two pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon monofilament sutures (9-0)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>SUT-1000-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamerazine sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>127-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inhibition of wound epidermis formation via full skin flap surgery during axolotl limb regeneration

Klassieke experimenten in salamander regeneratieve biologie in de afgelopen eeuw hebben al lang vastgesteld dat de wond epidermis een cruciale signaleringsstructuur is die snel na amputatie wordt gevormd en nodig is voor ledemaatregeneratie. Methoden om de precieze functie ervan op moleculair niveau te bestuderen in de afgelopen decennia zijn echter beperkt vanwege een gebrek aan precieze functionele technieken en genomische informatie die beschikbaar is in salamandermodelsystemen. Opwindend genoeg maakt de recente overvloed aan sequencingtechnologieën in combinatie met de release van verschillende salamandergenomen en de komst van functionele genetische testmethoden, waaronder CRISPR, het mogelijk om deze fundamentele experimenten opnieuw te bezoeken met een ongekende moleculaire resolutie. Hier beschrijf ik hoe de klassiek ontwikkelde full skin flap (FSF) -operatie bij volwassen axolotls moet worden uitgevoerd om de vorming van wondepidemis onmiddellijk na amputatie te remmen. De wondepidemis vormt zich normaal gesproken via distale migratie van epitheelcellen in de huid proximaal naar het amputatievlak om de wond af te sluiten van de externe omgeving. De operatie omvat het onmiddellijk hechten van de huid van volledige dikte (die zowel epidermale als dermale lagen omvat) over het amputatievlak om epitheelcelmigratie en contact met de onderliggende beschadigde mesenchymale weefsels te belemmeren. Succesvolle operaties resulteren in de remming van blasteemvorming en ledemaatregeneratie. Door deze chirurgische methode te combineren met hedendaagse downstream moleculaire en functionele analyses, kunnen onderzoekers beginnen met het blootleggen van de moleculaire onderbouwing van wond epidermisfunctie en biologie tijdens ledemaatregeneratie.

Dit chirurgische protocol zorgt voor de volledige remming van de vorming van de wondepidemis (figuur 1) en uiteindelijk voor de regeneratie van de ledematen. Een succesvolle operatie resulteert in geen blasteemvorming in ongeveer 2-3 weken, afhankelijk van de grootte van het dier, terwijl controle regenererende ledematen normaal gesproken een blasteem zouden moeten vormen.
Onderzoekers moeten de gehechte ledemaat om de 2-3 dagen met het blote oog inspecteren om er zeker van te zijn dat de hechtingen er niet uit zijn gesprongen en dat er zich geen blasteem vormt. Als een of meer van de hechtingen eruit springen, kan zich nog steeds een wondepidemis vormen, wat resulteert in een klein of groot blasteem en een mislukte operatie (figuur 2). Bovendien moeten onderzoekers de gehechte ledemaat minstens één keer per week onder een stereomicroscoop inspecteren om er zeker van te zijn dat een dunne wondepidemis nergens op het amputatieoppervlak zichtbaar is. Ter vergelijking moeten onderzoekers ook de controle regenererende ledemaat onderzoeken die een wondepithdermis over het amputatievlak moet hebben en gedurende 2-3 weken een blasteem moet vormen. De wond epidermis zal dun en helder lijken, terwijl de normale huid meer ondoorzichtig en lichtroze (bijna wit), lichtgeel of donkergroen zal lijken in respectievelijk leucistische, albino- of wildtype axolotls.
Als onderzoekers weefsel willen verzamelen voorafgaand aan de blasteemvormingsstadia na 2-3 weken, moeten ze de gehechte ledematen inspecteren voorafgaand aan de monsterverzameling om er zeker van te zijn dat de hechtingen op hun plaats bleven en dat er geen kleine wondepidemi werd gevormd. Bovendien kan het sagitisch doorsnijden van het gehechte ledemaatweefsel en het uitvoeren van histologische analyses op elk moment ook de aanwezigheid van de dermis van de volledige huidflap rond het hele amputatievlak en de afwezigheid van een wondepithdermis verifiëren (figuur 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig01.jpg"> Figuur 1: Schema van de stappen van de volledige huidflapoperatie. De stappen van het protocol zijn hier genummerd en in een diagram weergegeven. De stippellijnen geven de amputatievlakken aan bij stap 1 en 3 van het protocol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig02.jpg"> Figuur 2: Voorbeelden van succesvolle en mislukte volledige huidflapoperaties. Representatief brightfield-beeld van een ledemaat dat een succesvolle operatie heeft ondergaan (links), een mislukte operatie (rechts) en een controle regenererende ledemaat (geen operatie) 25 dagen na amputatie (dpa). De succesvolle operatie heeft een plat amputatievlak waar de volledige huidflap overheen werd gehecht, terwijl de mislukte operatie een klein blasteem ontwikkelt. Pijlpunten geven het amputatievlak aan en witte stippellijnen zijn er om de visualisatie van de afwezigheid van een blasteem in de succesvolle operatie en de aanwezigheid van blastema's in de mislukte operatie te helpen visualiseren en regenererende ledematen te beheersen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig03.jpg"> Figuur 3: Histologische kleuring van normale regenererende en FSF gehechte ledematen. (A-B') Representatieve brightfield-afbeeldingen van picro-mallory gekleurde secties van regenererende (A-A') en gehechte axolotl-ledematen (B-B') bij 7 dpa. Inzetstukken in A en B worden weergegeven in respectievelijk A' en B'. De collageenzware huidlaag bekleedt en bedekt het hele amputatievlak in gehechte ledematen. Amputatievlak wordt aangeduid met pijlpunten in A-B. Schaalbalken vertegenwoordigen 500 μm. Dit cijfer is overgenomen van Tsai et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration at JoVE.com

Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

Dit artikel beschrijft hoe een chirurgische methode kan worden uitgevoerd om de vorming van wondepidemis te remmen tijdens axolotl ledemaatregeneratie door de huid van volledige dikte onmiddellijk over het amputatievlak te hechten. Met deze methode kunnen onderzoekers de functionele rollen van de wondepidemis onderzoeken tijdens de vroege stadia van ledemaatregeneratie.

Remming van wond epidermisvorming via volledige huidflapchirurgie tijdens Axolotl Limb Regeneration

Classical experiments in salamander regenerative biology over the last century have long established that the wound epidermis is a crucial signaling ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Een omgekeerde genetische benadering van functionele redundantie Test tijdens de embryogenese

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Lot in kaart brengen van menselijke embryonale stamcellen door teratoom Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

Het beoordelen van Signalering Eigenschappen van ectodermale epitheel Tijdens craniofaciale ontwikkeling

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount Immunohistochemische Analyse voor Embryonale Limb Skin vaatstelsel: een modelsysteem voor Vasculaire Vertakkingen Morphogenesis in Embryo Study

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Snelle Genetische analyse van epitheliale-mesenchymale signalering tijdens haar regeneratie

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Lange termijn, hoge resolutie Confocale Time Lapse Imaging van<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis Bij het ontkiemen

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methoden voor de huid De verwondingen en Testen voor Wond Reacties in<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Kwantificeren van de leukocyten Egress via de lymfevaten van lymfkliertest huid en tumoren

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...